chromas反向测序 变为正向峰图 截取

测序常见问题及其分析Collected by RobertoRun,12.10.2008(From: HTUTUUUTTH)1、PCR产物测序时出现重叠峰问题图1（模板中有碱基缺失，往往是单一位点（1-1）或两个位点（1-2）碱基缺失导致测序结果移码）图1-1图1-2解决方法：将PCR产物克隆到质粒（如T载体）中挑单克隆测序，或将PCR 产物进行PAGE纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序。

问题图2（PCR产物不纯，含部分序列一致的两种以上的片段，长度不一）图2解决方法：主要原因是PCR产物没有纯化，含有部分序列一致的两种以上长度不一的片段，将PCR产物进行PAGE纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序，便可解决。

问题图3（测序引物有碱基缺失）测序引物有碱基缺失（一般是引物的5'端缺失），和模板的碱基缺失即图1有些类似，所不同的是模板碱基缺失一般是在一段正常测序序列后才出现移码，而引物碱基缺失的话，则从测序一开始就出现移码，表面在图形上便是一开始就是严重的峰形重叠。

解决方法：重新合成引物，或将引物进行PAGE纯化2、克隆测序时出现峰形重叠原因：所挑选的重组子不是单克隆，所提供的测序用质粒中含有两种以上插入片段不同的质粒；或是是送测序的菌液污染解决方法：重新挑单克隆的菌落（划线分离单菌落），提质粒或送菌液再次测序。

3、样品有杂合/突变位点模板中有杂合型突变，也就说模板本身在这个位点出现突变；或者是从基因组中扩增出来的杂合位点。

如果模板有杂合（突变或缺失），那么测序图形中其他的位點一般都是單一的峰形，然后突然在某一個位點出現重叠峰(如图中箭頭所示)。

解决方法：建议将DNA片段克隆到载体再测序。

4、poly A/T和C/G cluster导致的套峰和测序信号衰减图4-1图4-3图4-4RACE测序时经常遇到图4-1和图4-4的情形，解决方法：从另一端测序；但如果这样的序列出现在中间，呵呵，目前还没有很好的解决方法，要看测序公司的本事了。

Xcabilur质谱解析
Xcalibur软件使用方法：找到想要解析的数据，双击，激活右上角色谱图光标，使其变绿，即可对色谱图进行编辑；右击色谱图，选中Ranges，在Scan下选择想要查看的正负离子色谱图，以下以正离子为例，在Plot中选择要查看的谱图类型，点击确定，既得总离子色谱；右击正离子色谱图，选中Ranges，在Plot中选择MassRange，在最下方空白Range(s)处输入想要提取的m/z，即可提取到色谱峰；激活质谱图光标，使其变绿，方可对质谱进行编辑，将鼠标定位在提取到的色谱峰处，下方质谱图即可显示对应的一级质谱。

利用SeqMan进行序列拼接Step1:打开Seqman软件Step2:加入你要拼接的序列点击Add sequences查找并选中要拼接的序列（可按住control键进行多选）点击Add按钮填加选择的序列填加完后点击done注：最好用测序的图谱尽量不要直接用测序得到的序列Step3:去除末端序列主要是去除序列末端测序质量差或是载体序列有两种方法可以用来去除这类末端序列其一：利用Seqman自带的去除工具自动去除（利用Trim ends按钮进行）其二：手工去除个人感觉手工去除方法最有效，因此下边我们以后工去除为例进行演示手工去除侧翼序列双击要去除侧翼序列的目标序列将鼠标放到测序图谱左边的一个黑色的竖线上，此时鼠标会变成一个有两个箭头的水平线按住左键拖动黑竖线，那么你就会发现侧翼序列的颜色变浅，这部分变浅的序列则就被去除，不再参加后面的拼接此步请将测序不准确或认为是载体的序列用这种方法去除。

测序准确的峰形图峰形规则，一般在序列的中部，如下图所示测序不准确的峰形图峰形较乱，很难判断是哪个碱基，一般位于序列两端，如下图所示Step4:进行序列拼接点击Assemble按钮在新出现窗口处点击拼接好的contig1在出现的Alignment of contig1 窗口中点击左三角显示序列的测序图谱点击菜单contig->strategy view可以观察序列拼接的宏观图Step5:查找拼接错误find conflict点击菜单Edit点击Find Previous或Find Next查找接接中出现的错误还可以通过Seqman左下角的快捷按钮查找错误的拼接查找错误的拼接错误的拼接的类型类型1：两条序列的测序结果不一致并明显一条测序质量好而另一条质量差处理：直接将该处修改为正确的碱基类型2：两条序列的测序结果不一致并两条测序质量都比较差处理：重新测序或用新的合适引物重新测定类型3：两条序列的测序结果不一致并明显两条测序质量都好处理：测序过程出现问题，重新测定Step6:导出拼接的序列可选择合适的格式，导出拼接好的序列通过以上几步我们就能很快将几个测序片段进行拼接，大家可以拿着自己的序列试试!当然如果两个测序片段的拼接片段太短可能利用默认的参数不能完成拼接，大家可以试着修改一下拼接参数试试!如降低Match size及Minimum Match Percentage的值!修改参数命令。

SeqMan使用方法
Step1：安装软件
在电脑上安装sergene.v7.1软件，SeqMan对应的是，发送到桌面快捷方式。

Step2：添加右键快捷菜单win+R
Step3:选中需要比对的测序结果，发送到Seqman软件
Step2:添加测序结果
点击Add sequences或者将需要增加的测序结果拖入到软件界
Step5:设置参数
将软件默认的参数设置成自己的参数，根据序列长度，匹配百分比，匹配长度，背景峰百分比等
Step3:Mark标准序列
Step4:序列比对
Step5:双击需要分析的序列
Step6:搜索SNP位点区域序列
1、按Ctrl+F进入搜索界面，输入需要搜索的序列
按Ctrl+G搜索整段序列中是否有相同的搜索项2、序列反向
Step7:放大选中区域的序列
1、展开序列峰型图
2、按Ctrl+D放大选中的序列后能比较清晰的分析SNP位点的峰型
Step8:保存比对序列
Ctrl+S保存当前分析的结果，下次打开该文件就可以直接看分析的结果
一条测序结果比对。