TALEN和CAS9技术移码敲除测序峰图分析方法说明-仅供参考

新一代TALEN对比cas9的优势上海斯丹赛生物技术有限公司●新一代TALEN操作比cas9更加简单容易● TALEN比cas9更加精确● TALEN相比cas9总体而言，投入成本更低，更便宜①新一代TALEN操作比cas9更加简单容易做cas9需要对载体酶切，胶回收，而TALEN可以实现一步连接。

新一代TALEN连接1.设计序列，选择模块2.加样，进行连接4-5h完成Cas9系统质粒构建sgRNA设计和oligo合成引物退火形成带粘性末端的双链片段线性化表达载体的制备（酶切、胶回收）双链oligo片段连接入表达载体②TALEN比cas9更加精确很多的文章和报道都说明了cas9的脱靶问题。

No evidence for TALEN off-targetingDing Q, Lee YK, Schaefer EA, et al. A TALEN genome-editing system for generating human stem cell-based disease models [J]. Cell Stem Cell, 2013, 12(2):238-51.本文结合全基因组测序法，在6个细胞系中分别对设计的TALEN靶序列在基因组上可能的10万个脱靶位点处进行了检测，均未发现任何脱靶效应；对外显子区进行测序比对，未发现TALEN存在脱靶效应。

TALEN 无明显脱靶效应TALEN 对基因进行有效编辑时未检测到任何的脱靶突变Liu H, Chen Y, Niu Y, et al. TALEN-Mediated Gene Mutagenesis in Rhesus and Cynomolgus Monkeys[J]. Cell stem cell, 2014.在这项新研究中，研究人员通过采用显微注射法将MECP2靶向TALEN质粒导入猴受精卵中，成功对MECP2进行了有效基因编辑，且未检测到任何的脱靶突变。

TALEN靶向基因操作技术技术介绍：TALE 技术（Transcription activator–like effectors）是一种崭新的分子生物学工具。

科学家发现，来自植物细菌Xanthomonassp.的TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系。

利用TAL的序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白，从而达到靶向操作内源性基因的目的。

目前TALE技术主要有两种应用：1）TALEN（transcription activator-like (TAL) effector nucleases）技术构建针对任意特定核酸靶序列的重组核酸酶，在特异的位点打断目标基因DNA，进而在该位点进行DNA操作，如Knock-out、Knock-in 或点突变。

它克服了常规的ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZFN相等或更好的活性，使基因操作变得更加简单、方便。

2）TALEA（transcription activator-like (TAL) effector activator）技术，针对基因启动子上游任意特定DNA序列构建转录激活因子，可提高特异内源基因的表达水平，而不需要购买或克隆cDNA。

TALE技术已经成功应用到了细胞、植物、酵母、斑马鱼及大、小鼠等各类研究对象，日益成为功能强大的实验室工具，使得过去无法逾越的项目成为可能。

技术特点：1.无基因序列、细胞、物种限制。

2.TAL的核酸识别单元与A、G、C、T有恒定的对应关系。

实验设计简单准确、实验周期短、成本低。

3.成功率几乎可达100%。

4.毒性低、脱靶情况少。

5.克服了常规的ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZFN相等或更好的活性。

TALE构建与应用：1.TALE靶点识别模块构建TAL的核酸识别单位为重复34个恒定氨基酸序列，其中的12、13位点双连氨基酸与A、G、C、T有恒定的对应关系，即NG识别T，HD识别C，NI识别A，NN识别G。

TALEN基因编辑技术前言转录激活样效应因子核酸酶（transcription activator-like effector nuclease, TALEN）技术与锌指核酸酶（Zinc-finger nuclease, ZFN）技术组成了一大类强有力的基因组编辑工具，这一大类技术的发展重新划定了生物学研究的边界。

这些嵌合核酸酶由两部分组成——一个可编码的序列特异性DNA结合模块与一个非特异性的DNA切割结构域。

通过诱导DNA双链断裂（DNA double-strand break）来刺激容易出错的非同源末端连接或在特定基因所在的位置进行的同源定向修复，TALEN和ZFN能够完成一系列遗传学编辑修饰操作。

成簇规律间隔短回文重复（clustered regulatoryinterspaced short palindromic repeat, CRISPR）技术是最新出现的一种基因组编辑工具，它能够完成RNA导向的DNA识别及编辑。

与其它基因组编辑工具相比，CRISPR技术更易于操作，具有更强的可扩展性。

本文将以上述三种技术为例，介绍并探讨新一代位点特异性基因组工程技术的生物学原理、未来发展趋势，及其在遗传学研究领域的作用和潜在的医学应用前景。

一、TALEN技术TAL效应因子（TAL effector, TALE）最初是在一种名为黄单胞菌（Xanthomonas sp.）的植物病原体中作为一种细菌感染植物的侵袭策略而被发现的。

这些TALE通过细菌 III类分泌系统（bacterial type III secretion system）被注入植物细胞中，通过靶定效应因子特异性的基因启动子来调节转录，来促进细菌的集落形成。

由于TALE具有序列特异性结合能力，研究者通过将FokI核酸酶与一段人造TALE连接起来，形成了一类具有特异性基因组编辑功能的强大工具，即TALEN。

近年来， TALEN已广泛应用于酵母、动植物细胞等细胞水平基因组改造，以及拟南芥、果蝇、斑马鱼及小鼠等各类模式研究系统。

CRISPR与Talen基因组编辑技术对比分析基因组编辑技术一直是生物学和医学领域的研究热点。

近年来，CRISPR和Talen成为最受关注的两种基因组编辑工具。

本文将对CRISPR和Talen进行对比分析，从技术原理、效率、精确性、应用范围等方面综合评价它们在基因组编辑中的优缺点。

首先，我们来探讨这两种技术的原理。

CRISPR（聚合酶鏈反應辅助人工制造的双链RNA）技术利用CRISPR-Cas9系统进行基因组编辑，其中Cas9是一种核酸内切酶，能够识别特定DNA序列并实现DNA切割。

CRISPR系统通过引导RNA（gRNA）与Cas9结合，使其精确识别目标DNA序列，从而实现靶向编辑。

与之相比，Talen（转录激活样基因分子）技术使用转录激活样基因分子（TAL）蛋白质和DNA结合结构域构建。

Tal蛋白质通过与DNA靶位点结合，识别与目标DNA序列互补的核酸，并通过特定核酸串联域（repeats）和变异核酸接头（TAL effectorDNA-binding domain）实现DNA的编辑。

Talen的特点是能够精确定位到任意DNA序列，并且可以进行多点编辑，但其设计和构建过程较为复杂。

在效率方面，CRISPR技术相对于Talen具有更高的编辑效率。

由于CRISPR-Cas9系统利用了高度特异的RNA-DNA序列互补配对，因此能够更容易地找到并切割目标DNA序列。

相比之下，Talen需要通过设计和构建Tal蛋白质与特定DNA序列结合，这一过程较为繁琐。

因此，CRISPR在实现基因组编辑时具有更高的效率和灵活性。

精确性是基因组编辑技术的关键指标之一。

在这方面，CRISPR技术存在一定的局限性。

由于CRISPR-Cas9系统一般通过非同义突变来引导编辑，存在一定的脱靶效应，可能导致编辑到非目标位点的DNA序列。

虽然研究人员已经通过改进gRNA设计和Cas9蛋白质的改造来减少脱靶问题，但在实际应用中仍存在一定的风险。

TALEN和CRISPRCas9技术介导的靶向基因破坏和同源修复的开题报告标题：TALEN和CRISPRCas9技术介导的靶向基因破坏和同源修复摘要：TALEN和CRISPRCas9技术是当前最常用的靶向基因编辑技术。

这两种方法都能够高效地切割DNA双链，引发靶向基因的破坏、转录调控或同源修复。

其中，靶向基因破坏和同源修复是应用最广泛的功能。

本文主要介绍TALEN和CRISPRCas9技术在靶向基因破坏和同源修复方面的原理、方法和应用。

在靶向基因破坏方面，我们详细分析了TALEN和CRISPRCas9技术介导的靶向基因破坏前端子的选择、设计和优化；在同源修复方面，我们阐述了TALEN和CRISPRCas9介导的同源修复的两种不同策略：基于质粒介导的同源修复和基于核酸修饰介导的同源修复。

关键词：TALEN；CRISPRCas9；靶向基因破坏；同源修复正文：一、TALEN和CRISPRCas9技术介绍TALEN技术是由转录激活样核苷酸修饰（Transcription activator-like effector nucleases）蛋白和双链DNA切割酶FokI蛋白组成的。

TALEN蛋白能够识别靶向DNA上的特定序列，由于携带着特殊的重复、变异结构域，因此它具有高选择性和高亲和力。

组合使用FokI蛋白产生两个股份的断裂，实现基因定点打靶和破坏。

CRISPRCas9技术是目前最为受欢迎和广泛应用的靶向基因编辑技术。

它由靶向RNA（guide RNA, gRNA）和具有核酸内切酶活性的Cas9蛋白组成。

gRNA指示Cas9精确定位到靶向基因上，并通过三个核酸酶活性位点之一引发DNA双链断裂，完成基因编辑。

二、TALEN和CRISPRCas9介导的靶向基因破坏1、TALEN和CRISPRCas9的优缺点TALEN和CRISPRCas9均有精准、高效的优点，但TALEN有更高的精度，因为TALEN识别靶向DNA序列更为精确；CRISPRCas9技术能够进行基因组广泛的编辑，因为它的gRNA能够非常灵活地修饰，从而获得不同的精度和选通性，并且gRNA片段长度更短，更容易与目标序列结合。

利用Cas9/ gRNA 体外细胞水平敲除基因的protocol一、Cas9靶位点的选择1.基因靶位点的选择遵循GGN(17-18)NGG（N 为任意碱基）的序列要求，其中GGN(17-18) 是与靶基因结合的位点，NGG 是Cas9 蛋白切割所必须的PAM（protospacer-adjacent motif）区。

因为我们实验室所用的pU6-gRNA 体外转录载体是U6 启动子，所以要求第一位碱基为G，第二位碱基可任意修改。

此外，可在正义链或反义链上选择靶位点。

图1. Cas9的作用原理（引自Mali et al., 2013）2.对于coding gene，靶位点尽量选择在基因CDS的前2/3区域并且在ATG之后，但是不要在最后一个exon上；最好能破坏重要的domain和/或所有的isoform/variant。

同时还要考虑避免在第一个起始密码子的下游还存在额外的具有相同阅读框（in-frame）的起始密码子。

靶点也可选择在intron和exon交界处，以破坏基因的剪接。

原则上不要选择5’-UTR和3’-UTR。

可参考如下的Cas9靶位点预测网站：/ZiFiT/CSquare9Nuclease.aspx二、Cas9靶位点的确认1. 确认靶点在基因组中的唯一性：靶位点序列在Ensembl/NCBI网站进行blast，确认是基因组中的单一位点。

2．PCR扩增靶点序列：从准备用于打靶的样品中PCR扩增靶点及附近的序列。

在靶位点周围设计引物，使其距离靶位点两侧都大于100 bp，并且PCR扩增产物最好不要超过500 bp，且为单一条带。

3．检测酶切效率：如果计划采用酶切法检测靶点的突变情况，则需要对上述PCR产物进行酶切验证。

要求尽量酶切完全，并且电泳后能明显与原条带区分开。

4．测序确认靶点序列：将PCR产物直接送去测序（不需要TA克隆）。

如果实测序列跟靶点的预测序列有出入，原则上应根据实测结果设计gRNA序列；但是，如果实测序列不再符合靶点选择的原则（例如，PAM区不是NGG，或5’端不是GG），则应重新选择靶点。

CRISPR/Cas9基因编辑技术具体步骤及方法CRISPR/Cas9 是一种能够对基因组的特定位点进行精确编辑的技术。

其原理是核酸内切酶Cas9蛋白通过导向性RNA（guide RNA, gRNA）识别特定基因组位点并对双链DNA进行切割，细胞随之利用非同源末端连接(Non homologous End Joining，NHEJ）或者同源重组（Homologous Recombination, HR）方式对切割位点进行修复，实现DNA水平基因敲除或精确编辑。

CRISPR基因敲除利用CRISPR / Cas9 进行单基因敲除目前研究最透彻、应用最广泛的II 型-CRISPR/Cas9 系统由两部分组成：1. 单链的guide RNA（single-guide RNA，sgRNA）2. 有核酸内切酶活性的Cas9 蛋白CRISPR/Cas9 系统利用sgRNA 来识别靶基因DNA，并引导Cas9 核酸内切酶剪切DNA（图1）。

当基因组发生双链DNA 断裂后，细胞通过非同源性末端接合(Non-homologous end joining, NHEJ) 将断裂接合，在此过程中，将随机引入N 个碱基的缺失或增加，若N 非3 的倍数，则目的基因发生移码突变，实表1 CRISPR/Cas9 基因敲除与RNAi 比较CRISPR过表达利用CRISPR / Cas9 进行单基因过表达通过修饰CRISPR/Cas9 系统中的一些元件，形成一种蛋白复合物-协同激活介质（SAM），可实现对多数细胞内源基因的特异性激活。

该系统灵活方便，为研究基因功能提供了极为便利的工具。

CRISPR-SAM 系统由三部分组成：1. 失去核酸酶活性的dCas9（deactivated Cas9）-VP64 融合蛋白2. 含2 个MS2 RNA adapter 的sgRNA3. MS2-P65-HSF1 激活辅助蛋白CRISPR-SAM 系统中的MS2-P65-HSF1 激活辅助蛋白就是SAM，全称为SynergisticActivation Mediator( 协同激活调节器)，这也就是CRISPR-SAM 的命名由来。

⼿把⼿教你学会CRISPRCas9基因敲除技术（需要挑选成对的靶点⼀般在正义链和反义链上分。

h ttp:///a/214091994_177233(需要挑选成对的靶点⼀般在正义链和反义链上分别挑选靶点配对)C RISPR/Cas 是进⾏基因编辑的强⼤⼯具，可以对基因进⾏定点的精确编辑。

在向导 RNA（guide RNA， gRNA）和 Cas9 蛋⽩的参与下，待编辑的细胞基因组 DNA 将被看作病毒或外源 DNA，被精确剪切。

⼀、寻找⽬的基因的靶标使⽤在线设计⽹站 CRISPR direct，如需直接复制⽹址，可在⽣物学霸后台对话框回复 direct即可。

靶点挑选要点：1. 基因敲除靶点应设计在起始密码⼦附近（包括起始密码⼦）或者起始密码⼦下游的外显⼦范围内。

2. 不同Cas9/gRNA 靶点在基因敲除效率上有较⼤差异，因此同时设计构建2～3 个靶点的基因敲除载体再从中选出敲减效果较佳的靶点。

3. N1-N20NGG 靠近 PAM 的碱基对靶点的特异性很重要，前 7～12 个碱基的错配对 Cas9 切割效率影响较⼩。

设计好的靶点序列应在基因库中进⾏ BLAST 检测。

4. Cas9Nicknase 需要挑选成对的靶点。

⼀般在正义链和反义链上分别挑选相距 20～30bp 的靶点配对。

多对靶点的敲除效率常有较⼤差异。

由于基因敲除实验时间长，在正式对⽬的细胞进⾏敲除前对靶点进⾏验证和挑选⾮常必要。

⼆、插⼊⽚段设计插⼊寡核苷酸序列设计（必须 PAGE 纯化寡核苷酸）：正向序列5’ACACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTT3’反向序列3’TGTGGCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAAATCTCGATCTTTATCGTTCAATTTTATTCCGATCAGGCAA5’插⼊⽚段的合成1. ⽤⽔将寡核苷酸稀释为 100 µM。