鹦鹉热嗜衣原体PCR检测体系的建立

嗜衣原体的部分保守区域。检测引物分别为Ｃｐｓｉ一１ ｆ５’一ＡＹＩ＇ＧＧＣＧＴＡＡＡＣＴＧＧＴＣＡＡＧＡ一３’）和Ｃｐｓｉ－２ ｆ５，一ＣＡＴＴＧＡＴＩ’ＡＡＧＣＧＴＧＣＴＴＣＡＣＣ一３’），它们分别 来源于Ｃ．ｐｓｋｔａｃｉ ６ＢＣ菌株ｆＡｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．Ｘ５６９８０） 的外膜主要蛋白基因的５ ７末端的１ ２４６—１ ２６６的核 苷酸序列与３，末端的１ ５１３—１ ５３４的核苷酸互补序 列。
收稿日期：２００９－－０５—２０ 基金项目：云南省科技厅面上项目（１（ＫＳ＾２∞９２６０３８） 作者简介：柳陈坚（１９碍－），男，上海市人，副教授，博士，研究方向；应用微生物与人兽共患传染病，Ｅ。｜ｉｌ；鹏啪岫ｒ８＠ｈｏｔ删－ｉＩ．∞叽
万方数据
第６期
柳陈坚，等：鹦鹉热嗜衣原体ＰＣＲ检测体系的建立
ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ．Ｏｂｊｅｃｔ：Ｔｈｅ ＰＣＲ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＯＭＰ）ｇｅｎｅ ｏｆ Ｃ ｐｓｉｔｔａｃｉ Ｗ８８ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ．
Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｉｒｔｙ－ｔｗｏ Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ａｎｔ｛Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ｔｗｅｎｔｙ－ｆｏｕｒ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ｏｔｈｅｒ ｂａｃｔｅｒｉａ
万方数据
５５６
上海交通大学学报（农ｑｌ，科学版）
Ｔａｂｌｅ １
裹１本研究中所用到的细菌菌株 Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ￥Ｉ／１１ｉｎ８ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ，ｔｕｄｙ
立 ｆ１）基因组ＤＮＡ制备：称取鹦鹉热嗜衣原体阴 性鸟粪２００ ｍｇ，并用ＰＢＳ缓冲液配制成２０％悬浮 液。取１０７个标准菌株Ｃ ｐｓｉｔｔａｃｉ ＮＪｌ的基本小体
．ｅｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｂｏｄｙ，ＥＢ），随后对其进行１０倍梯度稀释 成１０６、１０５、１０＇、１０３、１０２、１０１ ＥＢｓ，接着将上述各稀释 度的基本小体混匀至制备好的阴性粪便悬浮液中， 随后用３ ０００ ｒ·ｍｉｎ－１离心５ ｍｉｎ，取上清再用１５ ０００ ｒ·ｒａｉｎ－ｌ离心３０ ｍｉｎ，取沉渣有待基因组ＤＮＡ制
聚合酶链反应（ＰＣＲ）已被广泛应用于动物源性衣 原体的检测即ｑ。国内外已陆续建立了应用２对甚至更 多对引物的多重ＰＣＲ及巢式ＰＣＲ，或者应用ＰＣＲ结 合限制性内切酶的分析法以检测不同种的衣原它ｐＨｌ。
本研究旨在确立一种确实有效的从鸟禽类粪便 样本中制备ＤＮＡ的方法，随后建立以鹦鹉热嗜衣原
体ＭＯＭＰ基因（ｏｍｐＡ）为靶基因的ＰＣＲ检测体系，该 靶基因区域涵盖了除Ｃ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、ｃ．ｐｅｃｏｒｕｍ、ｃ． ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃ ｓｕｉｓ和ｃ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍ以外的鹦鹉热 嗜衣原体的所有菌株及其他嗜衣原体菌株。
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鹦鹉热嗜衣原的存在１２，３１，接触已感染鹦鹉热鸟类的 粪便可能会导致鹦鹉热的传播与爆发【３＇４】。
近年，鹦鹉热的常规实验室诊断方法有补体结 合试－验ｘ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｆｉｘａｔｉｏｎ，Ｃｎ与微量免疫荧光试 验（ｍｉｃｒｏｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ，ＭＩｎ等血清学检测方 法，但是，这些方法在特异性、敏感性上存在一定的 缺陷，并且临床诊断时间长，因此，建立更加快速、特 异和敏感的检测方法已成当务之急。
第２８卷第６期 ２００９年１２月
上海交通大学学报（农业科学版） ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＪＩＡＯＴＯＮＧ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ（ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥ）
Ｖ０１．２８ Ｎ０．６ Ｄｅｃ．２００９
鹦鹉热嗜衣原体ＰＣＲ检测体系的建立
柳陈坚，龚福明，蔡燕，李海燕，张忠华
（昆明理工大学生命科学与技术学院应用微生物研究室，昆明６５０２２４）
２５９ ｂｐ。反应体系如下：ＩＯｘＰＣＲ缓冲液３“Ｌ，ｄＮＴＰ 混合液（２ ｍｍｏｌ·Ｌ一）３¨Ｌ，上下游引物ＣＭＩ，ＣＭ２（５０
ｐｍｏｌ‘斗Ｌ－１）０．３斗Ｌ，Ｅｘ Ｔａｑ（５ Ｕ。斗Ｌ一，ＴａＫａＲａ）０．１５ “Ｌ，ＤＮＡ模板２．５¨Ｌ，最后加灭菌超纯水２０．７５斗Ｌ 补足到３０斗Ｌ体系。反应过程参数为：９４℃预变性 ３ ｍｉｎ，９４℃变性２０ ｓ，５５℃退火２０ ｓ，７２℃延伸３０ ｓ，共３５个循环，７２℃延伸１０ ｍｉｎ，最后４℃保存。 取１０ ｕＬ ＰＣＲ产物经２％琼脂糖凝胶电泳后于凝胶 成像系统进行成像与结果分析。 １．２．２ 鹦鹉热嗜衣原体ＰＣＲ检测体系建立时基因 组ＤＮＡ的制备应用Ｐｕｒｅｇｅｎｅ ＤＮＡ分离试剂盒 （Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，美国１从纯化的嗜衣原体与衣原体 的基本小体中制备基因组ＤＮＡ，然后以１０倍稀释 梯度将纯化的鹦鹉热嗜衣原体ＤＮＡ稀释调制成２×
ＬＩＵ Ｃｈｅｎ－ｊｉａｎ，ＧＯＮＧ Ｆｕ－ｍｉｎｇ，ＣＡ ｌ Ｙａｈ，ＬＩ Ｈａｉ－ｙａｎ，ＺＨＡ ＮＧ Ｚｈｏｎｇ－ｈｕａ
（Ｌａｂｏｍｍｒｙ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆａｃｕｌｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ。 Ｋａｎｍｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５０２２４，Ｃｈｉｎａ）
ｎｉｎｅ ｏｆ ５７９ ａｖｉａｎ ｆｅｃａｌ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ。２５ ａｖｉａｎ ｃｌｏａｃａｌ ｓｗａｂｓ ａｎｄ ２ ｈｕｍａｎ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ勰ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｆｏｒ Ｃ ｐｓｉｔｔａｃｉ ｂｙ ｔｈｉｓ ＰＥＲ
ｓｙｓｔｅｍ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｉｓ ｎｅｗｌｙ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ＰＥＲ ｉｓ ａ ｒａｐｉｄ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅｌｉａｂｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃ ｐｓｉｔｔａｃｉ ｏｆ ａｖｉａｎ ｏｒｉｇｉｎ．
样本．笔者以Ｃ ｐｓｉｔｔａｃｉ的ＭＯＭＰ基因ｆｍａｊｏｒ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ）为靶基因而开发了ＰＥＲ检测方法．该最低能检测到
１００ｆｓＤＮＡ（相当于１０个衣原体）相当的鹦鹉热嗜衣原体．该靶基因区域涵盖了除Ｃ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、ｃ．ｐｅｃｏｒｕｍ、Ｃ ｔｒａｃｈｏｍａｔ／ｓ、Ｃ ｓｕ／ｓ和ｃ ｍｕｒ／ｄｍｎｍ以外的鹦鹉热嗜衣原体所有的菌株及其他部分嗜衣原体茵株。６０６例临床样本中有２９倒鸟类粪便样本、２５
摘要：鹦鹉热是由鹦鹉热嗜衣原体（ｃ＾如晌枷『以ｐｓｉｔｔｏｃｉ，Ｃ ｐｓｉｔｔａｃＯ；Ｉ起，并可由带病鸟类传染给人类的一种人言共患传染
病。虽然有巢式ＰＥＲ和多重ＰＥＲ被开发用于Ｃ ｐｓｉｔｔａｃｉ的检测，但是这些方法较为繁琐．本研究应用了３２株衣原体和嗜衣原
体菌株，２４株来自鸟类及人的肠道与呼吸道的细菌茵棒，此外还使用６０６个禽鸟粪便、泄殖腔棉拭子及人体气管分泌物的临床
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｓｉｔｔａｃｏｓｉｓ ｉｓ ｆ．ｉ：ｉｕｓＰ（１ ｂｙ Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｓｉｔｔａｃｉ ｆｃ．ｐｓｉｔｔａｃＯ ａｎｄ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｆｒｏｍ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｂｉｒｄｓ ｔｏ ｈｕｍａｎｓ．Ａｌｔｈｏｕｇｈ ｎｅｓｔｅｄ
ＰＣＲ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｉ＇ＣＲ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｃ ｐｓｉｔｔａｃｉ ｇｅｎｅ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅｓｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗｅｒｅ ｎｏｔ ＳＯ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ
（２）ＰＣＲ反应体系：５斗Ｌ的ＤＮＡ模板加入到５０ “Ｌ的ＰＣＲ反应体系中，该反应体系另外还含有５ 斗Ｌ的１０ｘ Ｅｘ Ｔａｑ缓冲液、２００ ｗｍｏｌ·Ｌ－１的各种脱氧 核苷三磷酸、０．５ Ｉ＿Ｌｍｏｌ·Ｌｄ的上下游引物和１．２５ Ｕ 的Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶（ＴａＫａＲａ。Ｊａｐａｎｌ。反应过程
ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｓｔｏｏｌ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（美国ＱＩＡＧＥＮ公司）， Ｐｕｒｅｇｅｎｅ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（美国Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ
公司），Ｓｅｐａｇｅｎｅ ｋｉｔ（Ｓａｎｋｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，
Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）。 １．２ 方法
１．２．１禽鸟类鹦鹉热嗜衣原体ＤＮＡ制备方法的确
１０５ ｆｇ·“Ｌ－１至２ ｆｇ·¨Ｌ－１的各个浓度，在ＰＣＲ特异性 试验时使用；其次，将其他细菌的基因组ＤＮＡ调制 成４００ ｐｇ＊斗Ｌ－－，以各ＰＣＲ特异性试验。同时，应用 ＱＩＡａｍＤ ＤＮＡ Ｓｔｏｏｌ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ从禽鸟类的临床粪便中 制备基冈组ＤＮＡ。 １．２．３ 鹦鹉热嗜衣原体ＰＣＲ检测体系的确立 （１） 引物设计与合成：寡聚核苷酸引物是根据ｇｅｎｅ－－ｂａｎｋ ｆＤＤＢＪ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｉｓｈｉｍａ，Ｊａｐａｎ） 登录的鹦鹉热嗜衣原体的外膜主要蛋白的ＤＮＡ序 列进行设计。该靶基因涵盖了除Ｃ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃ ｐｅｃｏｒｕｍ、Ｃ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃ ｓｕｉｓ与ｃ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍ以 外所有鹦鹉热嗜衣原体菌株的保守同源区域及其他
ＤＮＡ ｒｅｇｉｏｎ ｗ∞ｃｏｌｌｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ａｌｌ ｔｈｅ Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｓｉｔｔａｃｉ ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｏｔｈｅｒ Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｓｐｅｃｉｅｓ ｅｘｃｅｐｔ
Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｅｃｏｒｕｍ，Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ，Ｃ＾如ｍ，．ｄ谊ｓｕ／ｓ ａｎｄ Ｃｈ／ａｍｙｄ／ａ ｍ圳噎Ｚ幻１肌．Ｔｗｅｎｔｙ—
ｃｏｍｍｏｎｌｙ ｅｎｃｏｕｎｔｅｒｅｄ ｉｎ ａｖｉａｎ‘＇ｒ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ａｎｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｔｒａｃｔｓ，ｓｉｘ ｈｕｎｄｒｅｄ ａｎｄ ｓｉｘ ａｖｉａｎ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｃｌｉｎｉｃ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ
ｕｓｅｄ．‰ｕｈｓ：Ｔｈｅ ｗｅｒｅ ａｌｓｏ
ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ＰＣＲ ｗａｓ １００ ｆｇ ｏｆ Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ＤＮＡ，ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｔｏ ｌＯ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｐｉｅｓ．Ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ
各时使用。最后应用３种商业用ＤＮＡ制备试剂盒，
对上述混有鹦鹉热嗜衣原体基本小体的粪便悬浮液 进行基因组ＤＮＡ的制备，ＤＮＡ制备方法参照各试 剂盒制造商所推荐的步骤。
ｆ２）ＰＣＲ反应体系：反应体系的上下游引物为： ＣＭｌ（５’一ＣＡＧＧＡＣＡＴＣＴＴＧＴＣＴＧＧＣＴＴ一３’）；ＣＭ２（５’ 一ＣＡＡＧＧＡＴＣＧＣＡＡＧＧＡＴＣＴＣＣ一３ ７１【嘲，该弓ｌ物由日 本ＴａＫａＲａ公司合成，其目的ＤＮＡ扩增片段长度为
例泄殖腔棉拭子样本和２例人源样长检测为阳性．结果表明，谊ＰＥＲ检测法是检测鸟源鹦鹉热嗜衣原体的快速、敏感、有效的
方法．
关键词：鹦鹉热衣原体；ＭＯＭＰ；ＰＥＲ＿Ｉ坌测
中图分类号：￥８５４．４３
文献标识码：Ａ
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｏ
Ｄｅｔｅｃｔ Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ 百度文库ｓｉｔｔａｃｉ
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｓｉｔｔａｃｉ；ＭＯＭＰ：ＰＥＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
鹦鹉热是由鹦鹉热嗜衣原体（醌ｋ嘞Ｉｌｌ池
ｐｓｉｔｔａｃＯ弓［起，并能由感染的鸟类传染给人。该人畜
共患传染病只能用大环内酯类药物治疗，严重感染
时会导致患者呼吸困难并需借助呼吸器辅助呼吸【·ｌ。 鹦鹉热嗜衣原体经常出现在被感染鸟类的各种组织 和分泌物中，而健康鸟类的粪便中往往也能检测到
１材料与方法
１．１ 材料 １．１．１ 微生物菌株
包括３株鹦鹉热嗜衣原体
菌株在内，共有３２株嗜衣原体菌株与衣原体菌株应
用于本研究，同时有２４株与鸟类和人的肠道及呼吸
道有关的细菌亦被用于本研究（表１）。所有的嗜衣原 体菌株和衣原体菌株均使用ＨｅＬａ ２２９细胞进行增
殖。其他的实验菌株则从美国ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｌ购入。 １．１．２ 禽鸟源鹦鹉热嗜衣原体ＤＮＡ制备试剂盒