第一章激光扫描共聚焦显微镜基本结构、特点
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激光扫描共聚焦显微镜在医学研究中的应用随着科学技术的发展,实验技术已经成为实现实验目的的重要手段,对实验技术的了解和掌握是科技工作者应具备的技能。
激光扫描共聚焦显微镜简称共聚焦显微镜,20世纪80年代中期发展起来并得到广泛应用的新技术,同时也是目前生物医学领域中最先进的荧光成像和细胞分析工具之一,它由激光,电子摄像和计算机图像处理等现代高科技手段与传统的光学显微镜结合而产生的先进的细胞分子生物学分析仪器,并在生物及医学等领域的应用越来越广泛,现在已经成为生物医学实验研究的必备工具。
1.激光扫描共聚焦显微镜的结构和原理激光扫描共聚焦显微镜(Confocal laser scanning microscope)是在荧光成像基础上加装激光扫描装置,利用计算机进行图像集中处理,由于该仪器使用紫外光或者可见光激发荧光探针,从而可以清晰观察细胞或者组织内部微细结构,并可反映出亚细胞水平上生理信号的变化在结构配置上,激光扫描共聚焦显微镜出包括普通光学显微镜的基本构造外,还包括激光光源,扫描装置,检测器,计算机系统(包括数据采集,处理,转换及应用软件),图像输出设备,光学装置和共聚焦系统等部分。
由于该仪器具有高分辨率,高灵敏度,光学切片,三维重建,动态分析等优点,因而为基础医学与临床医学的研究提供了有效手段。
2.日常管理共聚焦显微镜是一种集激光技术、显微镜技术、光度技术、计算机及图像处理技术、精密的机械技术等多种高技术于一身的大型仪器。
其价格昂贵,在使用过程中要特别注意做好保养和管理工作。
通常要做到以下几点:(1)严格按照操作规则使用,避免因使用不当造成损坏。
(2)为保持良好工作状态,延长使用寿命,工作环境应保持清洁、干燥、远离辐射源。
每次使用后,要做好清洁工作,及时清洁目镜、物镜等容易污染的光学部件。
(3)系统应设立专门房间,安装在防震台上,工作间内要安装空调,抽湿及防尘装置。
无论仪器是否工作,最好使其环境始终保持在22 ℃± 1 ℃的恒温。
激光共聚焦扫描显微镜简介一、激光共聚焦显微镜的基本组成激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope LSCM)是20世纪80年代发展起来的一项具有划时代意义的高科技新产品,是当今世界最先进的细胞生物学分析仪器。
激光共聚焦显微镜利用激光作为光源,在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦的原理和装置,以及通过针孔的选择和PMT的收集,并带有一套对其所观察到的对象进行数字图像分析处理的系统软件。
与传统光学显微镜相比,它具有更高的分辨率,实现多重荧光的同时观察并可形成清晰的三维图象等优点。
所以它问世以来在生物学的研究领域中得到了广泛应用。
激光共聚焦显微镜主要有四部分组成:1、显微镜光学系统。
2、扫描装置。
3、激光光源。
4、检测系统。
整套仪器由计算机控制,各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。
1.1 显微镜光学系统显微镜是LSCM的主要组件,它关系到系统的成象质量。
显微镜光路以无限远光学系统可方便地在其中插人光学选件而不影响成象质量和测量精度。
物镜应选取大数值孔径平场复消色差物镜,有利于荧光的采集和成象的清晰。
物镜组的转换,滤色片组的选取,载物台的移动调节,焦平面的记忆锁定都应由计算机自动控制。
1.2 扫描装置LSCM使用的扫描装置在生物领域一般为镜扫描。
由于转镜只需偏转很小角度就能涉及很大的扫描范围,图象采集速度大大提高,512×512画面每秒可达5帧以上,有利于那些寿命短的离子作荧光测定。
扫描系统的工作程序由计算机自动控制。
1.3 激光光源LSCM使用的激光光源有单激光和多激光系统。
多激光器系统在可见光范围使用多谱线氩离子激光器,发射波长为457nm、488nm和514nm的蓝绿光,氦氖绿激光器提供发射波长为543nm的绿光,氦氖红激光器发射波长为633nm的红光。
1.4 检测系统LSCM为多通道荧光采集系统,一般有三个荧光通道和一个透射光通道,能升级到四个荧光通道,可对物体进行多谱线激光激发,样品发射荧光的探测器为感光灵敏度高的光电倍增管PMT,配有高速12位A/D转换器,可以做光子计数。