叶绿体蛋白的提取
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一．样品的制备
1. 样品的处理
（包括CK和TRE）用20% 的PEG-6000（渗透势大约为-1.88MPa)诱导干旱胁迫（D），直到它们的相对含水量达到83％-86％(一般3天)。
然后高温胁迫(H)处理在光照培养箱中进行，温度40℃，处理时间为24个小时（恢复0h:R0）。
然后R12，R24，R36，R48。
DH处理前，R0，R12，R24，R36，R48：CK,CK+TRE,CK+DH,CK+TRE+DH; DH处理后，取第3 片全展叶为试材，进行叶绿体蛋白组的分析。
每个处理重复3 次。
（CK,CK+TRE,CK+DH,CK+TRE+DH）
2.叶绿体的分离
(1)剪取10g小麦叶片，将叶片剪碎，液氮研磨；
(2)加入5倍体积4℃预冰冷的buffer A(buffer A：50mM Tris-HCl，20mM EDTA 0.5M蔗糖，0．25M Vc，pH3.5)，匀浆用8层医用纱布过滤滤液至预冷的50mL离心管中，弃残渣。
(3)滤液1500g／min，15min离心，弃上清，留沉淀。
(4)向沉淀中加入3mL bufferA，充分悬浮，转入10mL离心管中。
(5)2000g／min，15min离心，弃上清，收集沉淀。
(6)加入2mLbufferB，充分悬浮。
(buffer B：50mM Tris-HCl，20mM EDTA，0．5M蔗糖，1％BSA，7mM β-巯基乙醇现用现加)
(7)1500g／min，离心10min，弃上清，收集沉淀，再用bufferB 洗一次。
(8)同上离心，弃上清，再加bufferC洗一次，离心，沉淀大部分为叶绿体。
(buffer C：50mM Tris-HCl pH8.0，20mM EDTA，0．5M蔗糖)
3.叶绿体的纯化
（1）制作不连续的percoll密度梯度，先在超速离心管中加入3mL 的60％的percoll，然后沿管壁缓缓加入4mL的40％percoll，最后加入5ml 20％的percoll。
Percoll浓度(％)706050403020 比重g／ml 1.090 1.077 1.067 1.056 1.043 1.031
问：请问percoll连续梯度怎么配制？比如15%---75%的percoll 连续梯度? 答：根据你需要的具体密度梯度决定的，根据要分离的不同细胞种类，数量等等，也有用原液配的。
也有用80％配的，不一定的。
另外，percoll本身是低渗透压的，要用高渗透压溶液配成生理等渗透压溶液，然后使用，不然，细胞容易破裂。
一般是先用9份Percoll与1份8.5％ NaCl或1.5M PBS混合达到生理性渗透压，然后用生理溶液(0.85％ NaCl或0.15M PBS)稀释到所需浓度。
即取Percoll原液与10倍浓缩的PBS以9：1的比例混合，此时溶液为100％ Percoll，比重是1.127。
(2)将粗提出的叶绿体加入离心管中，8000g／min离心lh。
(3)在20％和40％之间是一些密度较小的细胞器或破碎的叶绿体，在40％和60％之间是纯化的叶绿体，在试管底部还有一些沉淀。
用注射器扎入40％和60％的界面，吸出叶绿体。
(4)加入等体积的bufferC(50 mM Tris-Hcl pH8．0，20 mM EDTA，0.5 M蔗糖)，10000rpm离心5min，再用bufferC洗一遍，沉淀即为纯化的叶绿体。
4.叶绿体纯度的鉴定
4．1显微镜观察
用bufferC将叶绿体溶液稀释lO倍，滴到载波片上，可见光下观察叶绿体形态、紫外线下观察叶绿素荧光，比较叶绿体和叶绿素荧光重叠程度。
（荧光显微镜）
4．2特异酶检测
过氧化氢酶活性的检测：先用BCA法测蛋白浓度，然后用过氧化氢酶检测试剂盒检测
5.叶绿体蛋白的提取及溶解
(1)纯化的叶绿体(10g片)加入1.5mL Buffer(100mM Tris，100 mM edta，50mM borax，50mM Vc，1％TritonX-100，2％β-巯基乙醇，30％的蔗糖)，将纯化的叶绿体剧烈悬浮，室温5min。
(2)加入等体积Tris饱和酚(pH8．O)，剧烈震荡10min。
(3)4℃，15000g离心15min，将上层的酚转移到新的试管中。
(4)加入5倍体积的硫酸铵饱和甲醇沉淀蛋白，-20℃，6h。
(5)15000g，15min，4℃离心。
用冰甲醇洗一次，冰丙酮洗三次沉淀，每次洗涤15000g，4℃ 5min，最终沉淀在空气中干燥。
6.用BCA方法测定蛋白浓度。
7.双向电泳
7.1 IEF
7.2 SDS-PAGE
8.双向电泳凝胶的固定及染色
将凝胶放入400 ml固定液中固定3h。
超纯水振荡洗涤三次，每次20 min。
加入400 ml预染色液，预染色l小时。
加入400 ml考马斯亮蓝染色液，染色3天。
超纯水洗涤两次，每次5 min，10％冰乙酸水溶液中保存。
9.差异蛋白比较和鉴定。
