一植物病真菌的分离培养

02 真菌培养的基本原理
真菌的营养需求
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碳源
真菌通过摄取碳源获取能量， 常见的碳源包括葡萄糖、蔗糖
、麦芽糖等。
氮源
真菌需要氮源合成蛋白质和核 酸，常见的氮源包括氨基酸、
尿素、硝酸盐等。
无机盐
无机盐对真菌的生长至关重要 ，如镁、磷、硫等元素。
维生素和生长因子
某些维生素和生长因子是真菌 生长所必需的，如生物素、泛
详细描述
将真菌接种在含有碳源、氮源和其他 必要营养物质的液体培养基中，通过 控制温度、pH和通气量等条件，使真 菌进行代谢产生有用产物。
04 真菌培养的过程和步骤
菌种选择与保存
菌种选择
选择具有代表性的真菌种类，考 虑其经济价值、生态意义和研究 价值。
菌种保存
采用低温、干燥、真空等手段， 以及定期更换培养基等方法，确 保菌种不发生变异和死亡。
详细描述
将真菌接种在固体培养基表面，通过控制温度、湿度和气体环境等 条件，使真菌在固体培养基上生长繁殖。
特点
操作简单，成本低，适用于一般实验室和工业生产。
液体培养法
总结词
在液体培养基中悬浮生长 的方法
详细描述
将真菌接种在液体培养基 中，通过搅拌或振荡使真 菌在液体培养基中悬浮生 长。
特点
生长速度快，可实现大规 模生产，但设备要求较高 。
和培养基。
实验后需彻底清洗双手和实验 器具，确保无菌操作。
对于有毒或具有强烈气味的真 菌，应在通风橱中进行操作， 并佩戴化学防护眼镜和化学防
护服。
实验废弃物处理
01
废弃的培养基和真菌样品需进行 灭菌处理，确保无菌后才能丢弃 。

绣线菊内生真菌的分离及对植物病原菌的抑制作用
徐庆庆;曾现银;柏钰;花日茂;操海群;吴祥为;李学德;唐俊
【期刊名称】《安徽农业大学学报》
【年(卷),期】2013(40)6
【摘要】采用组织分离法，以PDA培养基为分离培养基，从绣线菊的根、茎和叶中分离获得39株内生真菌。

平板对峙结果表明，21株活性菌株对6种植物病原菌（辣椒疫霉病原菌、番茄枯萎病原菌、苹果腐烂病原菌、苹果炭疽病原菌、葡萄灰霉病原菌、小麦赤霉病原菌）有不同程度的抑制作用，其中菌株XXT10对苹果腐烂病原菌、苹果炭疽病原菌、番茄枯萎病原菌、小麦赤霉病原菌的抑制率分别达到73．2％、72．5％、39．5％和42．7％。

通过测得的ITSrDNA序列与GenBank数据库中已知序列比对后该菌为链格孢属菌。

生物学特性试验表明，该菌株在28～32℃时，选择PDA培养基，分别以乳糖和蛋白胨作为碳、氮源，酸碱度中性的条件下，茵落的生长状况最佳。

【总页数】6页(P975-980)
【作者】徐庆庆;曾现银;柏钰;花日茂;操海群;吴祥为;李学德;唐俊
【作者单位】安徽农业大学资源与环境学院
【正文语种】中文
【中图分类】S482.292
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平板划线分离法：被普遍采用
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分离方法
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A.倒平板：注意培养基的温度不能太高，否则冷凝水太多，细菌在水中游动而影响单个分散菌落的形成。
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划4条线后，将接种环灭菌，培养皿转动90°，从第2条线开始划4－5条线
如果菌液浓度大，培养皿转动角度减小，增加划线的次数
C.复染剂
原液：番红O 2.5g，95%酒精100mL 复染剂：原液10mL，蒸馏水90mL
B. 鲁戈尔碘液：碘1.0g，碘化钾2g蒸馏水300mL。
将碘和碘化钾在研钵中研和，慢慢加水并继续研和直至碘和碘化钾溶解，然后加水稀释到300mL，盛入棕色试剂瓶，放暗处备用。
（2）染色程序
A. 配制细菌悬浮液：菌龄16h
配制过程：将NH4H2PO4、氯化钾、MgSO4.7H2O溶于蒸馏水，调节pH7.0后加入溴百里酚兰，最后加入碳素化合物（也可分别灭菌后加入）
分装：将上述培养基分装于试管中，每管10 mL左右。如果测定气体产生，加上杜氏发酵小玻管后灭菌。 产酸时培养液变黄，产碱时变蓝，产气则小玻管内培养液被部分排出，出现空隙。
B.用接种环蘸取上述配制好的菌悬液，在已凝固的平板培养基表面划线
（2）培养皿稀释分离法
0 原液
1
取1环菌液
0.5ｍL灭菌水
2
混匀后取1环
3
混匀后取1环
4
混匀后取1环
5
混匀后取1环
3.培养
一般放置在 28－30℃温箱中倒置培养，时间2～3 d。 将冷却至45℃左右的培养基倒入装有稀释菌液的培养皿中，轻轻转动培养皿，使菌液和培养基混匀，待其凝固后培养。
干热灭菌法
通过使用干热空气杀灭微生物的方法叫干热灭菌。一般是把待灭菌的物品包装就绪后，放入电烘箱中烘烤，即加热至160～170℃维持1～2h。 干热灭菌法常用于空玻璃器皿、金属器具的灭菌。 凡带有胶皮的物品，液体及固体培养基等都不能用此法灭菌。

常用的几种典型的病原菌分离方法1．斑点病原菌的分离从病斑部分切取每边3～5 mm的小块组织，在70％酒精中浸数秒钟后，移入0.1％的升汞水溶液中处理3～5 min，以灭菌水冲洗3次，移置培养皿的培养基中，然后培养。

2．维管束组织内病原菌的分离从根茎维管束组织分离病菌，可先将寄主病部表面用70％酒精擦拭消毒，将表皮组织用灭菌的解剖刀削去，然后切取其中小块变色的维管束组织，用升汞或漂白粉液消毒后。

，用灭菌水冲洗几次，移置培养基面上。

3．根腐病病原菌的分离根腐或基腐病的分离，由材料的大小决定。

材料小的可仿照斑点病的分离法，材料大的则可以用维管束组织内病原的分离法。

4．肉质组织中病原菌的分离多肉的根、茎及果实等，可以采用维管束组织内病菌分离法除去表面组织，切取小块病组织分离。

如有杂菌感染可采用“直接接种”法，待出现症状后，用此法再行分离。

5．种子内病原菌分离将整个种子或者种子的一部分进行表面消毒(升汞或漂白粉)，用灭菌水洗涤后，移置培养基上。

6．孢子分离法能产生大量孢子的病菌如青霉素、链格孢等，则可配制成孢子悬浮液以稀释法或划线法分离之。

7、土壤带菌分离法为了研究一些真菌在土壤中存活和分布的情形，从有病的土壤中分离它们是必要的。

分离方法是将土壤取出少许，配制成悬浮液，然后用稀释法或划线法分离。

附录2 真菌单孢子分离技术一、目的要求了解单孢分离技术的基本原理，掌握简便实用的单孢分离方法。

二、基本原理单孢分离的方法很多，如振落法、稀释法和直接挑取法。

振落法和稀释法的共同点都是采用某种方法，使真菌孢子较稀疏地分散在水琼脂平板上，然后在显微镜下检查寻找在水琼脂平板表面的单个孢子，一旦找到理想的单个孢子，就通过无菌操作将其(连同一部分培养基)移植到PDA斜面培养基上，置适温下培养，形成的菌落即为单孢系菌株。

直接挑取法是在实体解剖镜下直接挑取单个孢子进行分离纯化的方法。

三、材料、用具与仪器1．材料(依本地资源情况进行选择，下列材料供参考)(1) 稻瘟病叶、病节、病穗颈(Pyricolaria oryzae)。