人肝癌细胞株HepG2 和BEL 一7402 对放射敏感性的体外实验研究

２５４·　塞坦照壁盎盔—２　蟹　量　１王鳖堑ｊ盟．ｆ　ｐｒａ￣ｌｔｃａｌ』　ｒｎ　Ｃａｎｗｒ　人肝癌细胞株ＨｅｐＧ２和ＢＥＬ一７４０２对放射敏感性的　体外实验研究　石卫民　范义湘　陈龙华　【摘要】　目的采用体外实验方法探讨人肝癌细胞林ＨｅｐＧ２和ＢＥＬ一７４０２对放射的敏感性。方法　对人肝癌细胞株　Ｈ　ｐＣ２和ＢＥＬ一７４０２进行俸外培养，应用集落形成法和ＭＴＴ法测定６ＭＶｘ线不同剂量照射后细胞的存活率，计算２株细胞放　射敏感性参数（　）　结果ＨｅｐＧ２的Ｄ０值为１　５，ＳＦ２为（０　４５±０　０５）；ＢＥＬ一７４０２的Ｄ０值为ｌ　６，ＳＦ２为（０　６３±０　０５）。ＭＴＴ　法与集落形成法相关性较好（　＝０　９４６，Ｐ＜０　０５）。结论ＨｅｐＧ２具有较高的放射敏感性，ＢＥＬ一７４０２的放射敏感性较低；ＭＴＴ　法可替代集落形成法作细胞放射敏感性的快速测定。　【关键词】人肝癌细胞系；照射效应；放射敏感性　中图分类号：Ｒ７３５　７　文献标识码：Ａ　文章编号：１００ｌ＋５９３０ｆ２００２｝０３　０２５４—０３　Ｒａｄｉｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　Ｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ　Ｃｅｌｌ　Ｌｉｎｅｓ　ＨｅｐＧ２　ａｎｄ　ＢＥＬ一７４０２　ＳＨＩ　Ｗｅｉ—ｒａｉｎ，ＦＡＮ　Ｙｉ—ｒｉａｎｇ，ＣＨＥＮ　Ｋｏｕｇ－ｈ㈨Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　Ｒａｄｉａｔｉｏｎ　Ｏｎｃａｌｏｇｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　Ｍｉｌｌｉｔａｒｇ　Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ，５１００１０　【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｅｖａｌｕａｔｅ　ｔｈｅ　ｒａｄｉｏ￣ｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌｓ　ＨｅｐＧ２　ａｎｄ　ＢＥＬ一７４０２　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｕｓｉｎｇ　ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｂｅｉｎｇ　ｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ—ＨｅｐＧ２　ａｎｄ　ＢＥＬ一７４０２，ｗｅ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｔｈｅｉｒ　ｓｕｒｖｉ￣ｎｇ　ｆｒａｃｔｉｏｎ　ｂｙ　ｃｌｏｎｏ－　ｇｅｎｉｃ　ａｓｓａｙ　ａｎｄ　ＭＴＴ　ａｆｔｅｒ　ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ　ｂｙ　６ＭＶ　Ｘ—ｒａｙ　ｗｉｔｈ　ｄｏ￣ｅｓ　ｒａｎｇｉｎｇ　０－－１０　Ｇｙ　Ｒａｄｉｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｉｎｄｅｘ，　，ｗａｓ　ｃａ１ｃｕｌａｔｅｄ　Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　Ｄ０ｏｆＨｅｐＧ２ｗａｓ１．５Ｇｙ，ＳＦ２（０．４５±０　０５）．Ｔｈｅ　Ｄ０　ｏｆ　ＢＥＬ一７４０２ｗＮｓ１．６Ｇｙ，ＳＦ２（０．６３±０．０５）．Ｔｈｅｒｅｗａｓ　ａ　ｇｏｏｄ　ｃｏｒｒｅｌａ．　ｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｍｍ　Ｍ丌ａｎｄ　ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃ　ａｓｓａｙ（７＝０　９４６，Ｐ＜０　０５）Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔ　ｒａｄｉｏｓｅｎｓｌｔｌｖｉｔｙ　ｏｆ　ＨｅｐＧ２　ｒａｔｈｅｒ　ｈｉｇｈ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ＢＥＬ一７４０２．ＭＴＴ　ｉｓ　ａ　ｑｕｉｃｋ　ｗａｙ　ｔｏ　ｍｅａｓｕｒｅ　ｒａｄｉｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｉｎｓｔｅａｄ　ｏｆ　ｄｏｎｏｇｅｎｉｃ　ａｓ－　ｓａｙ　［Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】Ｈｕｍａｎ　ｂｅｉｎｇ　ｈｅｐａｔｃ￣ｒｃｉｎｏｒｔｍ　ｃｅｌｌ】ｉｎｅ　Ｒａｄｉａｔｉｏｎ　ｅｆｆｅｃｔ　ｌＲａｄｉａｔｉｏｎ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　（ＴｈｅＰｒａｃｔｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＣａｎｃｅｒ，２００２，１７：２５４　２５６）　原发性肝癌是我国高发的恶性肿瘤之一，近年来　立体适形放疗的实践证实肝癌对射线有相当高的反应　率…，但是目前尚缺少肝癌细胞放射敏感性的实验研　究资料，本研究拟以人肝癌细胞ＨｅｐＧ２和ＢＥＬ～７４０２　为模型，应用放射生物学方法评价肝癌细胞的放射敏　感性。　１材料与方法　１＿１细胞系及照射条件　人肝癌细胞系ＨｅｐＧ２、ＢＥＬ一７４０２为人原发性肝　癌切除标本传代培养细胞株，由第一军医大学南方医　院全军消化研究所提供。细胞在３７℃、５％ｃＯ　条件　下，培养于含１０％胎牛血清的ＲＰＭＩ　１６４０培养液中。　细胞处于指数生长期时进行照射（换液后２４　ｈ）　使用　作者荦他：５１（ＩＯ１（Ｉ广州　：区ｒ州总医院放射　憎科（６－Ｉ　Ｊ【也）　５１０５１５第一车睚大学　方　院艘疗科（范义湘、陈尼华】　Ｖａｒｉａｎ　２１００　Ｃ直线加速器６　Ｍｖ　Ｘ线照射，等中心照　射，射野大小为加ｃｍ×１０　ｃｍ，剂量率４００　ｃＧｙ／ｍｉｎ，　照射时培养皿上下各置１．５　ｃｍ厚的有机玻璃板。　１．２集落形成实验　处于指数生长期的细胞经０．２５％胰蛋白酶消化　制成单细胞悬液，按照射剂量将１×１０　～１×１０ｓ个细　胞接种于直径为３　ｃｍ培养皿中，分别给予０～１０　Ｇｙ　单剂量照射，培养１２～１４天后中止培养，甲醇固定，　Ｇｉｅｍｓａ染色，镜下计数超过５０个细胞的集落，计算细　胞存活分数（ＳＦ）。每个剂量点设３个平行样品，取均　数。集落形成率（ＰＥ）＝集落形成数／接种细胞数。细　胞存活分数（ＳＦ）＝照射组集落形成率／对照组集落形　成率。　１．３　ＭＴＴ实验　将射线照射和未照射的细胞分别接种于９６孔培　养板中培养，每孔接种细胞数５×１０　个。３天后于终　止培养前６　ｈ，每孔加入０　５％ＭＴＴ　２０“ｌ。孵育完毕，　吸除孔内液体，每４ＬＮ　１５０　１　ＤＭＳＯ，振荡５　ｍｉｎ，

用　奎周痨壁盈，　２０ｏ　ｒ王旦璺卫鲞盈　ＥＬ３４０型酶标仪（美国Ｂｉｏ—Ｔｅｃ公司）在５７０　ｎｍ波长　下测定各孔光吸收值（ＯＤ），计算细胞存话分数。细胞　存活分数（ｓＦ）＝照射组ＯＤ值厂对照组ＯＤ值。　１．４统计分析　以上实验均重复３次，取均数。应用多靶单击模　型［ＳＦ＝１一（１一ｅ。ｎ　ｏ）　］计算细胞放射敏感性参数　（Ｄｆ）），亚致死损伤修复能力（Ｄｑ）和外推数（ｎ）。用　ＳＰＳＳ软件进行统计分析。　２结果　２．１　２株细胞的放射敏感性　用集落形成实验结果拟合细胞剂量存活曲线，以　照射剂量为横坐标，以细胞存活分数的对数值为纵坐　标，得到２株细胞的剂量存活曲线，见图１。按文献　的方法以剂量存活曲线计算细胞的放射敏感性参数。　ＨｅｐＧ２的Ｄ０值为１．５　Ｇｙ，Ｄｑ值为０．８Ｇｙ，ｎ为１　８，　细胞受２．０　Ｇｙ照射时的存活分数（ＳＦ２）为０　４５±　０　０５；ＢＥＬ一７４０２的Ｄｎ值为１．６　Ｇｙ，Ｄｑ值为１．３　Ｇｙ，ｎ为２．４，ＳＦ２为０．６３±０　０５。以Ｄ０值作标准，结　果显示，ＨｅｐＧ２的放射敏感性较高，ＢＥＬ一７４０２的放　射敏感性较低。　蔓　萎。　薰　０　照射剂量（Ｇｙ　图ｌ　２株人肝癌细胞剂量存活曲线　为ＨｅｐＧ２．　为ＢＥＬ一７４０２　２．２　ＭＴＴ结果与集落形成宴验结果比较　细胞受照射后的死亡分为问期死亡和增殖性死　亡，当细胞丧失了无限增殖的能力即成为放射生物学　意义上的死亡，因为增殖性死亡可以发生在照射后的　数个细胞周期内，也可能发生在照射后的数十个细胞　周期后，因此为了更好地衡量存活细胞的多少，理论上　应尽量延长照射后培养的时间。本研究的预实验表　明，当细胞密度在ｌ×１０　～２×１０６个／孑Ｌ时　ＯＤ值随　Ｖ　２５５·　细胞密度的增大而递增，表明细胞数在此范围内时，　ＭＴＴ法能较好地反映细胞数量的变化。考虑到兼顾　增殖性死亡的细胞和存活并继续增殖的细胞的细胞　数，本实验选用５×１０４个／子Ｌ。ＭＴＴ法与集落形成法　测定的２株细胞的存活分数的相关比较见图２，直线回　归分析表明，ＭＴＴ法与集落形成法相关性较好，　＝　０．９４６（Ｐ＜Ｏ．Ｏ５）。　蜒　《　壤　铽　蛏　碧　导　细胞存恬分数｛ＭＴｒ法）　图２　２种方法摁Ｉ定２株细胞存活分数的相关直线　３讨论　肿瘤细胞的放射敏感性体外测定结果与临床肿瘤　放疗的疗效密切相关ｌ３】。因此，进行肿瘤细胞体外放　射敏感性的测定，有助于临床上制订更加合理、有效的　放疗计划。　以往对于肝癌对射线的敏感性认识不足，本实验　证实体外培养的人肝癌细胞对放射线比较敏感。李伟　雄等ｌ４　报道的人鼻咽癌ＣＶＥ细胞系的Ｄｆ）值为１．２　，　刘斌等［　］报道口腔黏液表皮样癌细胞ＭＥＣ一１的Ｄ０　为１　５４，而本研究的ＨｅｐＧ２的Ｄ０值为１．５　Ｇｙ，ＢＥＬ　７４０２的Ｄ０值为１．６　Ｇｙ，与其近似，因此有理由认为　其也具有相似的较高的放射敏感性。哺乳动物细胞剂　量存活曲线拟合的ｎ值在１～５，本实验发现，ＨｅｐＧ２　的ｎ值为１　８，ＢＥＬ一７４０２的ｎ值为２．４，说明其细胞　内靶较少，因此被射线全部击中细胞内靶的概率较高，　所以有较高的放射敏感性。近年来，Ｓ　成为描述细　胞放射敏感性的１个重要指标。Ｄａｚａ等【６１报道舌鳞　癌细胞系ＳＣＣ一４的ＳＦ２为０．６。Ａｎｔｈｏｎｙ等【７ｊ发现　甲状腺癌细胞系Ｋ２的ｓＦ２为０．４７。Ｒｅｉｂｅｉｒｏ等　则　报道膀胱癌细胞系ＢＬ—ｌ７的ＳＦ２为０．５７，相比之下，　ＨｅｐＧ２的Ｓ　为０．

４５±０　０５，ＢＥＬ一７４０２为Ｏ．６３±　２５６　塞ＪＪ．痛　越．　ｑ：５　ｌ７壹孔ｊ盟一　［　旦翌地　ｊ　ａｔ　ＣａｒＪ！；ｅ　０　０５，具有与上述３株细胞相似的放射敏感性。我们　曾应用立体定向适形放疗已治疗肝癌２Ｏ例，近期疗效　很好［１ｌ，本体外实验结果与临床研究结果基本吻合。　近年来，肿瘤细胞放射敏感性的研究技术向着敏　感和快速的方向发展。集落形成法作为经典的方法，　能够比较真实地反映照射后细胞存活分数的多少，但　实验周期较长，操作复杂，容易污染　ＭＴＴ已广泛用　于研究细胞增殖以及测定肿瘤细胞对化疗药物的敏感　性【　，具有简便、快速、经济的特点。本实验比较分析　了上述２种方法测定细胞存活曲线，发现ＭＴＴ法与　集落形成法有良好的相关性（　＝０　９４６），表明ＭＴＴ　法可以替代集落形成法进行肿瘤细胞放射敏感性的测　定。　参考文献　［１］石卫民，陈龙华原发性肝癌立体定向适形放疗的近期疗　效评价［Ｊ］．癌症，１９９９，１８（５）：６０４　（２］夏寿萱放射生物学［Ｍ］第１版北京：军事医学科学出　版社，１９９８：６０．　［３］浦佩玉，徐　波，杨天恩．恶性肿瘤体外放射敏感性与临　床故疗疗效相关性研究［Ｊ］癌疗．１９９５，１４（Ｉ）：３３　［４］李伟雄，沈瑜．谷铣之７６４—１对鼻咽癌细胞放射增敏作　用的研究［Ｊ］中华放射肿瘤学杂志，１９９４，３（４）：２４７　［５］刘斌，司徒振强，吴军正，等人黏液表皮样癌ＭＥＣ—ｌ　细胞放射敏感性的研究［ｊ］实用口腔医学杂志，１９９７，１３　（２）：１２６　ｆ６］Ｄａｚａ　Ｐ，Ｓｃｈｕｂｌｅｒ　Ｈ，Ｍｃｍｉｌｌａｎ　ｒｊ，ｅｔ　ａｌ　Ｒａｄｉｏ．￣ｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　ｄｏｕｂｌｅ　ｓｔｒａｎｄ—ｂｒｅａｋ　ｒｅｊｏｉｎｉｎｇ　ｉｎ　ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ　ａｎｄ　ｎｏｎ—　ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ　ｈｕｍａｎ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ　ＬＪ］　Ｉ　ｎｔ　Ｊ　Ｒａｄｉａｌ　Ｂｉｏｌ，１９９７，７２（１）：９１．　［７］Ａｎｔｈｏｎｙ　Ｇ，Ｊｅａｎ　ＤＬ，Ｎａｄｉｎｅ　Ｂｔ，，ｅｔ　ａｔ　Ｒａｄｌｏ．．￣ｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｈｕｎｌａｎ　ｎｏｒｍａｌ　ａｎｄ　ｔｕｍｏｒａｌ　ｔｈｙｒｏｉｄ　ｃｅｌｌｓ　ｕｓｉｎｇ　ｆｌｕｏｒｅｓ　ｃｅｎｃｅ　ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｌｏｎｏｇｅｎｌｃ　ＳＵｒｖｉｖａｌ　ａｓｓａｙ　（Ｊ］ｌｎｔ　Ｊ　Ｒａｄｉａｔｉｏｎ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ　Ｂｌｏｔ　Ｐｈｙｓ，１９９９，４４（３）：　６８３　［８］Ｒｉｈｅｉｒｏ　ＪＣ　Ｂａｒｎｅｔｓｏｎ　ＡＲ，Ｆｉｓｈｅｒ　ＲＪ，ｅｔ　ａ１．Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｒａｄｌｔｉｏｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ａｎｄ　ｐ５３　ｓｔａｔｕｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｂｌａｄ—　ｄｅｒ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅ　ｓ［Ｊ］ｌｎｔ　Ｊ　Ｒａｄｉａｔ　Ｂｉｏｌ，１９９７，７２（１）：ｌ１．　［９］　尤迎春，丛文铭，王一，等ＭＴＴ比色分析法快速测定　肝癌细胞株对化疗药物敏感性的方法研究［Ｊ）癌症，　１９９６，１５（３）：２１９．　（收稿日期２００１—１０—３０修回日期２００２—０３—２５）　（上接第２４９页）　结果还显示，随着胃癌细胞ＦａｓＬ表达水平的升高、　ＴＩＬ浸润程度降低和ＴＩＬ捅亡水平升高，胃癌细胞的　凋亡指数逐渐降低，胃癌细胞的凋亡指数与ＴＩＬ的凋　亡指数有显著负相关关系，提示胃癌细胞的凋亡也与　其ＦａｓＬ表达密切相关，支持胃癌细胞可能通过ＦａｓＬ　表达水平上调诱导Ｔ】Ｌ凋亡（即上述“肿瘤细胞反击　免疫细胞”的机制），间接减弱Ｔ】Ｌ对胃癌细胞的杀伤　作用，从而达到逃避机体免疫监视的观点【１—１。　我们的研究结果还显示，晚期胃癌组织中Ｆａｓ表　达水平有所下降，这与其他的研究结果相似Ｌ５　Ｊ。表明　胃癌细胞免疫逃避的机制既多样又复杂，Ｆａｓ表达水　平的逐步下调可能是其中之．Ｉ　，非ＦａｓＬ依赖的肿　瘤细胞杀伤Ｔ淋巴细胞的机制有待进一步研究。　参考文献　１］Ｗｉｌｌｉａｍｓ　Ｎ　Ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｌ　ｆｉｇｈｔ　ｂａｃｋ　ｔｏ　ｂｅａｔ　ｉｍｍｕｎｅ　ｓｙｓｔｅｍ　［Ｊ］Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９６，２７４（１Ｏ）：１３２０．　［２］Ｓｈｉｒａｋｉ　Ｋ，Ｔｓｕｊｌ　Ｎ，Ｓｈｌｏｄａ　Ｔ，ｅｌ　ａｌ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｆａｓ　ｌｉｇ　ａｎｄ　ｊｎ　ｌｉｖｅｒ　ｍａｔａｓｔａｓｅ￣ｏｆ　ｈｕｍａｎ∞ｌｏｎｉｃ　ａｄ　［Ｊ］Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，１９９７，９４（８）：６４２０．　［３］Ｂｅｎｎｅｔｔ　Ｍｗ，０　Ｃｏｎｎｅｌ　Ｊ，Ｏ　Ｓｕｌｌｉｖａｎ　ＧＣ，ｅｔ　ａｌ　Ｅｘｐｒｅｓ．　ｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｆａｓ　ｌｌｇａｎｄ　ｂｙ　ｈｕｍａｎ　ｇａｓｔｒｉｃ　ａｄｅｎｏｅａｒｅｌｎｏｍａｓ：ａ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｅ　ｅｓｃａｐｅ　ｉｎ　ｓｔｏｍａｃｈ　ｃａｎｃｅｒ　［Ｊ］Ｇｕｔ，１９９９，４４（２）：１５６　［４］刘海峰，刘为纹，房殿春，等胃癌组织中ＦａｓＬ表达及其　与细胞凋亡的关系［Ｊ］．解放军医学杂志　１９９９，２４（１）：　６３　［５　Ｊ　Ｓｈｉｍｏｎｉｓｈｌ　Ｔ，Ｉｓ　Ｋ　Ｓｈｉｂａｔａ　ＧＣ，ｅｔ　ａｌ　Ｕｐ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｆａｓ　ｌｌｇａｎｄ　ａｔ　ｅａｒｌｙ　ｓｔａｇ￣ａｎｄ　ｄｏｗｎ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｆ∞ａｔ　ｐｒｏｇｒ￣ｓｅｄ　ｓｔａｇｅｓ　ｏｆ　ｉｎｔｒａｈｅｐａｔｉｃ　ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃａｒｄｎｏｍａ　ｒｅ．　ｆｌｅｅｔ　ｅｖａｓｉｏｎ　ｔｒｏｍ　ｉｍｍｕｎｅ　ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ［Ｊ】Ｈｅｐａｔｏｔｏｇｙ，　２００１），３２（３）：７６１　［６］贾百是，李继昌、张和平，等Ｆａｓ表达及细胞凋亡与胃癌　浸润及转移的关系［Ｊ］实用癌症杂志，２００１），１５（３）：２３８　（收稿１３期２００１一ｏ９—０７修回日期２００２—０２—２６）