346 中国科学 C 辑 生命科学 2006, 36 (4): 346~354丙型肝炎病毒多表位抗原基因的构建与免疫原性研究*高 军 龚育平 赵 平 杨晓平 戚中田**(第二军医大学, 上海 200433)摘要 丙型肝炎病毒(HCV)基因易发生变异, 尤其是含中和抗原表位的高变区1(HVR1)变异性最大. 模拟HVR1的B 细胞表位具有涵盖多种天然表位的抗原特性, 保守的T 细胞表位具有各型间的相对保守性. 为解决HCV 高变性造成的疫苗研究障碍, 我们选取HCV E2区HVR1(384～410 aa)模拟B 细胞表位9条、C 区的保守CTL 表位2条(35～44 aa, 132～140 aa)、NS3区保守的CTL 表位1条(1073～1081 aa)及NS3区保守的Th 表位1条(aa 1251～1259), 各表位之间以插入3个氨基酸为连接臂, 人工合成上述13条表位基因串联的HCV 多表位抗原基因(mfc ). 将mfc 与gst 基因融合, 表达了多表位抗原蛋白GST-MFC. 同时, 构建了白介素-2信号肽基因、PADRE 表位基因和mfc 基因串联的候选HCV DNA 疫苗, 即质粒pVAX1.0-st -mfc . 以GST-MFC 蛋白免疫家兔和质粒pVAX1.0-st -mfc 免疫小鼠, 采用ELISA 和Western blot 方法, 应用10条具有代表性的HCV HVR1合成肽进行检测, 证明有9条HVR1合成肽能与所有免疫动物血清反应, 交叉反应率(cross reactivity, CR)为90%. 应用HCV 抗体阳性的感染者血清与多表位抗原GST-MFC 蛋白进行反应, 证明其反应识别率(reactivity frequency, RF)为75%. 上述结果表明, 筛选合成的HCV 多表位抗原基因mfc 具有HCV 中和抗原表位的特征, 可作为HCV 疫苗研制的候选基因. 关键词 丙型肝炎病毒 多表位肽 丙型肝炎病毒高变区1 模拟表位 T 细胞保守表位收稿日期: 2005-06-03; 接受日期: 2005-12-24* 国家高技术研究发展计划(863计划, 2002AA214161)和国家自然科学基金(批准号: 30471596)资助项目 **联系人, E-mail: qizt@丙型肝炎病毒(HCV)的感染呈世界性分布, 全球HCV 感染率约为3%, 约1.7亿人感染HCV, 每年新发丙型肝炎病例约 3.5万例. 我国一般人群抗HCV 阳性率约为3.2%, 急性感染者中约50%～80%发展成慢性, 其中约20%可发展为肝硬化, 1%～4%可发展为肝癌. 丙型肝炎治疗常用干扰素和利巴韦林, 其应答率约为40%. 由于HCV 高度变异、缺乏体外培养系统及无可靠的小动物模型等, HCV 疫苗的第4期高 军等: 丙型肝炎病毒多表位抗原基因的构建与免疫原性研究347研究困难重重. 如何突破常规疫苗研究方法, 研制出具有广泛交叉保护性的疫苗, 是目前HCV研究的热点之一[1~4].HCV基因组E2区的N端存在一个由27个(384～410 aa)氨基酸组成的高变区1(HVR1). 研究表明, HVR1区含有HCV主要的中和表位, 但自然状况下为株特异性, 而且, 在免疫压力下此区段极易发生变异, 导致HCV免疫逃逸[5,6]. Puntoriero等人[7]采用噬菌体展示肽库技术, 以不同丙肝患者的血清对肽库进行筛选, 鉴定出了具有交叉反应性的多条HVR1模拟B 细胞表位. 这些模拟B细胞表位的合成肽不仅可以被不同的HCV感染者血清抗体识别, 具有很高的反应识别率(reactivity frequency, RF), 而且, 免疫动物的血清可以与不同型别的HVR1合成肽发生交叉反应, 具有较高的交叉反应率(cross reactivity, CR), 表明HVR1模拟B细胞表位合成肽具有用于HCV疫苗研究的前景. 同时, 越来越多的实验证明, T细胞免疫在控制HCV感染中有重要作用, HCV各组成蛋白中的Th 和CTL抗原表位[8,9]以及外周血和肝脏内的Th1/Th2与HCV感染后的转归相关[10]. 因此, 将诱导体液免疫和细胞免疫的表位同时引入, 已成为HCV疫苗研究的一个新趋势.本研究选取HCV E2蛋白HVR1模拟B细胞表位9条、C区的保守CTL表位2条、NS3区保守CTL表位及保守Th表位各1条, 将上述13条表位之间以3个氨基酸连接, 人工合成了一段表位基因串联的HCV多表位抗原基因(multi-epitope fragment combination, mfc). 以此基因为基础, 进行了蛋白质表达、核酸疫苗构建及动物免疫接种, 检测了反应识别率、交叉反应率, 评价了该HCV多表位抗原的B 细胞免疫原性.1 材料与方法1.1 HVR1表位基因片段的选择根据Puntoriero等人[7]报道的HCV HVR1区模拟B细胞表位中选取9条, 从Renard等人[11]报道的C区保守CTL细胞表位中选取2条, 从Brinster等人[12]报道的NS3区保守CTL细胞表位及Diepolder等人[13]报道的Th细胞表位中各选取1条. 各表位的序列见图1. 1.2 多表位抗原基因的串联合成、表达和DNA 疫苗的构建应用兼顾pichia酵母偏性密码子和大肠杆菌偏性密码子来设计基因, 各个模拟B细胞表位之间和B 细胞表位与细胞T表位之间, 以GPG(甘氨酸-脯氨酸-甘氨酸)作为连接臂分开, 因为脯氨酸可在两个小氨基酸间形成钢性扭转, 从而保证各个B细胞表位的相对独立. 同时, 在各个T细胞表位之间, 以AAY(丙氨酸-丙氨酸-酪氨酸)作为连接臂分开, 因为这个序列具有优先被蛋白酶切割的特点, 有利于T表位的独立提呈. 设计合成的mfc基因长969 bp, 为了便于合成及克隆, 在mfc基因的5′端引入Bam HⅠ和Eco RⅠ酶切位点, 中间561 bp处(从第一个密码子起)引入KpnⅠ酶切位点, 3′端引入NotⅠ和SalⅠ酶切位点, 以KpnⅠ酶切位点分为A、B两段分别合成, 合成策略及合成后DNA序列和氨基酸序列见图1. A, B两段合成基因分别与T-载体连接, 获得重组质粒pMD18-T-A和pMD18-T-B.分别将质粒pMD18-T-A经Bam HⅠ/Kpn lⅠ双酶切、质粒pMD18-T-B经KpnⅠ/SalⅠ双酶切、GST融合表达载体pGEX-4T-1(购于Amersham Biosciences)经Bam HⅠ/SalⅠ双酶切后, 回收目的片段A, B和载体片段. 三片段连接后, 转化大肠杆菌DH5α, 酶切鉴定出重组表达质粒, 并进行测序检测其全基因序列, 命名为pGEX-4T-gst-mfc, 表达框架见图2(a).本实验室前期工作证明[14], 应用信号肽和通用型辅助性T细胞表位PADRE串联基因(st)可增强DNA 疫苗的免疫原性. 质粒pUC-mT-st(本室赵平博士提供)经Hin dⅢ和Bam HⅠ酶切, 回收st基因; 质粒pGEX-4T-mfc经Bam HⅠ和XhoⅠ酶切, 回收mfc基因; 载体质粒pV AX1.0(购于Invitrogen)经Hin d Ⅲ和XhoⅠ酶切, 回收载体大片段. 3个片段同时连接, 转化大肠杆菌DH5α, 酶切鉴定出重组表达质粒, 并进行测序检测其全基因序列, 命名为pV AX1.0-st- mfc, 质粒结构见图2(b). 按常规方法大量抽提超螺旋质粒DNA, 即获得HCV候选DNA疫苗.348中国科学 C 辑 生命科学第36卷图1 HCV 多表位抗原基因mfc 的合成策略、DNA 序列和氨基酸序列(a) 表示mfc 基因分为A 与B 两段合成和所用26条部分重叠的核酸序列排列方式; (b) 显示mfc 基因的DNA 序列和相应的氨基酸序列1.3 多表位抗原基因的融合表达用构建的pGEX-4T-gst -mfc 转化大肠杆菌BL21(DE3), 同时用质粒pGEX-4T-1转化的大肠杆菌DE3作为对照, 分别在3 mL 的2×YT 培养基中37℃扩增12 h, 加入异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)至终浓度为0.6 mmol/L 诱导3 h. 诱导结束后取1 mL菌液, 常规变性裂解处理及7.5%P AGE 电泳检测, 筛选高表达菌株. 对高表达株进行诱导条件优化, 大量扩增重组表达菌, 按常规方法进行超声破菌, 上清用Glutathione Sepharose TM 4B(购于Amersham Biosciences)纯化, 获得多表位抗原蛋白GST-MFC. 多表位抗原蛋白冷冻干燥后用纯水溶解, 并用Brandford 法测定蛋白浓度.第4期高 军等: 丙型肝炎病毒多表位抗原基因的构建与免疫原性研究349图2 原核表达载体pGEX-4T-mfc和真核表达载体pV AX-1.0-st-mfc的构建策略、表位基因结构及连接处读码序列(a) 原核表达载体pGEX-4T-mfc; (b) 真核表达载体pVAX1.0-st-mfc1.4 多表位抗原蛋白与HCV感染者阳性血清的反应20份丙型肝炎患者血清由上海长海医院传染科提供, 均为HCV抗体检测阳性(检测试剂盒购于上海复星长征医学科学有限公司). 正常人血清4份取自健康自愿者, HCV抗体均为阴性.(1) ELISA方法检测多表位抗原蛋白与HCV感染者阳性血清的反应[15]: 用50 mmol/L的NaHCO3缓冲液作为包被缓冲液, 调整多表位抗原GST-MFC蛋白浓度为0.2 μg/μL, 每孔100 μL加入酶标板. 按常规方法封闭后, 加入100 μL待检血清(1︰10稀释), 设复孔. 室温下震荡反应2 h, 洗板3次, 加入100 μL HRP-兔抗人IgG(1︰1000稀释), 室温震荡反应1 h, 洗板3次, 加入100 μL TMB显色液, 避光反应15 min. 用波长A450 nm参照A630 nm检测, 以空白孔校零, 读取A450nm值, 每个检测设复孔, 取平均值为检测结果.检测标准为:P/N≥2.1时为阳性;反之为阴性.(2) Western blot方法检测多表位抗原蛋白与HCV阳性血清的反应: 配制12.5%的SDS聚丙烯酰胺分离胶. 检测孔加入上述亲和层析纯化获得的多表位抗原蛋白GST-MFC(其中含GST单体蛋白成分)2 μg/泳道. 电泳结束后, 以电转移法将凝胶中的蛋白条带转至1张硝酸纤维素膜, 水洗硝酸纤维素膜数次, 加入封闭液(20 mmol/L Tris-HCl, pH 7.4, 150 mmol/L NaCl, 0.1% Tween20, 5% 脱脂奶粉), 室温封闭1.5 h, 弃封闭液, 加入HCV抗体阳性血清(1︰10稀释)作为一抗, 室温反应 2 h, 用洗液(20 mmol/L Tris-HCl, pH 7.4, 150 mmol/L NaCl, 0.1% Tween20)漂洗硝酸纤维素膜6次, 弃洗液, 加入HRP-兔抗人IgG(1︰1000稀释)作为二抗, 室温反应1.5 h, 用洗液再次漂洗硝酸纤维素膜6次, 放入显色液(0.01 mol/L Tris-HCl , pH 7.6, 6 mg二氨基联苯胺, 临用时加入30% H2O2 20 μL混匀)中轻轻摇动显色, 条带出现后, 即用水漂洗终止反应, 晾干保存.1.5 动物接种实验(1) 多表位抗原蛋白免疫家兔: 健康新西兰家兔购于上海海军医学研究所实验动物中心, 雌、雄各1只, 体重 2.5～2.6 kg. 用纯水调整多表位抗原蛋白浓度至0.2 g/mL, 加入等体积的完全弗氏佐剂(首次接种使用)和不完全弗氏佐剂(加强免疫使用)乳化. 选择家兔背部6～8个部位分别接种0.5～1 mL/处, 首次接种剂量为1.0 mg/(只·次), 以后每隔1周加强接种1次, 加强接种剂量为0.2～1.0 mg/(只·次), 共接种5次.(2) 多表位抗原DNA候选疫苗免疫小鼠: 健康BALB/c小鼠购于本校实验动物中心, 雌雄不限, 6周龄, 共12只, 体重(18.5±1.5) g, 设定实验组和对照组各6只. 实验组小鼠于双侧胫骨前肌肉注射质粒pV AX1.0-st-mfc, 每侧50 μL, 质粒浓度为2 μg/μL, 隔2周加强1次, 连续注射3次, 同时, 对照组注射PBS.1.6 多肽合成为了检测多表位抗原蛋白免疫动物后的效果, 评价特异性及保护性免疫反应, 从本实验室前期研350中国科学 C 辑 生命科学第36卷断标准为：P/N ≥2.1时为阳性; 反之为阴性.究结果及GenBank 中挑选自然HVR1变异株序列, 合成了10条具有代表性的HVR1多肽(见表1). 这些合成肽长度均为27aa(384～410 aa), 代表不同的HCV 变异株, 可用于检测免疫血清的交叉反应性.2 结 果2.1 多表位抗原基因的合成和候选DNA 疫苗的构建表1 HCV HVR1合成肽的氨基酸序列编号氮基酸序列P1 NTRITGGSAARTTGGFVGLFSFGAKQN P2 GTYTTGGAQGRATQGLTSLFSRGSAQK P3 STHVTGGVQGHSLQRLTSLFTFGPAQK P4 HTRTTGGVAARTTSGLTSLFSSGPSQK P5 GTRVTGGAQGRYHRSLTSLFTPGPTQR P6 ETHTSGGSVARAAFGLTSIFSPGAKQN P7 NTYVTGGSQGRAVAGRFAGLLQPGAKQN P8 ETHSVGGSAAHTTSRFTSLFSPGPQQN P9 STYSMGGAAAHNARGLTSLFSSGASQRP10 ETYIIGAATGRTTAGLFSLFSSGSQQN 将合成的mfc 基因克隆到pGEX-4T-1中, 构建成原核表达载体pGEX-4T-1-mfc . 用Bam H Ⅰ和Kpn Ⅰ以及Eco R Ⅰ和 Sal Ⅰ两组双酶切进行鉴定, 见图3(a), DNA 测序证明重组载体中的mfc 基因序列与设计的序列一致.重组真核细胞表达载体pVAX1.0-st -mfc 经Hin d Ⅲ和 Bam H Ⅰ双酶切后, 得到120 bp 的st 基因, 经Bam H Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后, 得到970 bp 的mfc 基因, 经Hin d Ⅲ和Xho Ⅰ双酶切后, 得到1090 bp 的st-mfc 基因. 酶切鉴定结果见图3(b), DNA 测序证实pVAX1.0-st -mfc 接头连接与读码框架正确、完整.1.7 动物免疫血清的检测(1) 诱生抗体的检测: 应用上述第1.4小节(1)的ELISA 方法, 待检免疫动物血清(1︰100稀释)作为一抗, HRP-羊抗兔或兔抗鼠IgG 作为二抗, 测定A 450nm 值. 同时, 应用上述第1.4小节(2)的Western blot 方法检测诱生抗体特异性识别GST 蛋白情况.2.2 多表位抗原蛋白的表达重组质粒pGEX-4T-1-mfc 转化的大肠杆菌BL21(DE3)经IPTG 诱导后, 多表位抗原蛋白GST-MFC 的表达量约占菌体蛋白的1%~5%, 从7 g 湿菌中可纯化出约 2 mg 蛋白质. 从纯化获得的GST- MFC 蛋白电泳图(图4(a))中可以看出, 纯化液中除包含相对分子量约为57.6 kD 的GST-MFC 蛋白外, 也含有较大量的GST 单体.(2) 诱生抗体与天然HVR1合成肽的交叉反应性检测: 采用ELISA 方法, 用包被缓冲液稀释多聚赖氨酸偶联(MAPs)的HVR1合成肽为100 μg/mL, 而后包被ELISA 板(Nunc). 免疫动物血清(1∶100稀释)作为一抗, HRP-羊抗兔或兔抗鼠IgG 作为二抗. 用无关合成肽作为对照. 测定各个合成肽同免疫血清反应的A 450nm 值, 每个检测设复孔取平均值. 结果判2.3 多表位抗原蛋白与丙肝患者血清反应Western blot 检测发现, 丙型肝炎患者血清可特图3 质粒pGEX-4T-1-mfc 和pVAX1.0-st -mfc 的酶切鉴定(a) 质粒pGEX-4T-1-mfc 的酶切鉴定. 1示λDNA/Hin dmarker Ⅲ; 2和3示质粒 pGEX-4T-mfc ; 4示pGEX-4T- mfc ( Bam H Ⅰ和 Kpn Ⅰ酶切); 5示pGEX-4T-1-mfc (EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ酶切). (b) 质粒pVAX1.0-st -mfc 的酶切鉴定. 1示pVAX1.0-st-mfc 被Hin d Ⅲ和Bam H Ⅰ酶切产生的 120 bp 和3970 bp 片段; 2示pVAX1.0-st -mfc 被Bam H Ⅰ和Xho Ⅰ酶切产生970 bp 和3120 bp 片段; 3示pVAX1.0-st -mfc 被Hin d Ⅲ和Xho Ⅰ酶切产生1090bp 和3000 bp 片段; 4示质粒pVAX1.0-st -mfc ; 5示DL15000 marker第4期高 军等: 丙型肝炎病毒多表位抗原基因的构建与免疫原性研究 351异性识别多表位抗原蛋白, 而不识别单纯的GST 蛋白(图4(b)). 表明MFC 蛋白具有模拟HCV 抗原表位的特性, 但实验中将丙型肝炎患者血清稀释到1︰200以上时, 几乎不能检测到杂交带, 提示丙肝患者血清中的抗HVR1抗体滴度较低.图4 HCV 多表位抗原蛋白及同丙型肝炎患者血清的反应(a) 1和2分别为0.5和1 μg 的纯化的多表位抗原蛋白; (b) 3为牛血清白蛋白对照, 4为0.5 μg 纯化的多表位抗原蛋白ELISA 检测发现, 多表位抗原蛋白能与20份丙型肝炎抗体阳性血清中的15份血清发生反应, 识别反应率(RF)为75%, 具体测定值见表2.2.4 多表位抗原蛋白和DNA 疫苗诱生抗体的检测结果(1) 抗体生成量的ELISA 检测结果: 多表位抗原蛋白免疫家兔后第2周即可检测到低水平的抗多表位抗原蛋白抗体, 自第6周开始明显升高, 至10周升达高峰, 抗体的动态变化见图5(a).质粒pVAX1.0-st -mfc 肌肉注射免疫小鼠后, 于第2周即可检到低水平的抗体, 与免疫前及对照小鼠相比有显著差异(P <0.05), 第3次注射后2周(即首次免疫后第6周), 抗体升至最高. 而后, 在首次免疫后8周特异性抗体滴度迅速下降(图5(b)). 在第12周再次注射质粒pVAX1.0-st -mfc 加强免疫后, 抗体在1周内迅速升高.(2) 抗体特异性的Western blot 印迹结果: 将多表位抗原蛋白与免疫动物的血清进行Western blot 杂交, 免疫家兔和小鼠的血清均能与多表位抗原蛋白GST-MFC 反应. 由于免疫家兔所用的抗原是亲和层析纯化的多表位抗原蛋白, 其中含有融合的GST 成分和单纯的GST 单体, 所以家兔免疫血清还能同GST 单体蛋白反应(见图5(c)), 而免疫小鼠的质粒pVAX1.0-st -mfc 表达的抗原不含有GST 成分, 所以DNA 免疫小鼠血清只表现出同多表位抗原蛋白GST-MFC 的杂交带.(3) 抗体与10条HVR1合成肽的交叉反应性检测结果: ELISA 检测结果显示, 以无关肽作为检测对照, 设定P/N 大于2.1为检测阳性, 多表位抗原蛋白免疫家兔后第8周血清(1︰1000稀释)和质粒pVAX1.0-st -mfc 免疫小鼠后第6周混合血清(1∶100稀释)均能同10条肽中的9条发生反应, 各条肽同血清的反应强度不尽相同, 其中第5条均不能被识别, 交叉反应率(CR)均为90%(图6). 此结果提示, 多表位抗原蛋白中包含的模拟表位可诱导出一定程度的交叉反应性中和抗体, 预示其作为疫苗应用时, 具有预防多数HCV 变异株感染的能力.表2 HCV 多表位抗原蛋白MFC 同20份丙型肝炎患者阳性血清的识别反应的ELISA 检测结果a)血清编号A 450 nm 值判定结果血清编号A 450 nm 值判定结果血清编号A 450 nm 值判定结果P1 0.144 + P9 1.00 + P17 0.045 − P2 0.132 + P10 0.15 + P18 0.051 − P3 0.065 −P11 0.12 + P19 0.034 −P4 0.382 + P12 0.20 + P20 0.131 + P5 0.657 + P13 0.13 + C1 0.032 − P6 0.041 −P14 0.11 + C2 0.042 −P7 0.111 + P15 0.84 + C3 0.035 − P8 0.163 + P16 0.90 + C4 0.028 − a) P1~P20为20份丙肝阳性血清, C1~C4为4份正常人血清, GST-MFC 为纯化的HCV 多表位抗原蛋白. A 450 nm 值为两次独立实验的平均值. “+”表示判定结果为阳性, “−”表示判定结果为阴性(检测标准为: 设4份正常人血清的平均A 450 nm 值为N, 各方格内的A 450 nm 检测值为P, P/N 大于2.1为检测阳性)352中国科学C辑生命科学第36卷图5 HCV多表位抗原蛋白及DNA疫苗pVAX1.0-st-mfc诱生抗体的ELISA和Western blot检测(a) 为HCV多表位抗原蛋白免疫家兔诱生抗体的变化图. ◆为兔1诱生抗体检测值, ●为兔2诱生抗体检测值, ▲表示接种时间; (b) 为HCV多表位抗原DNA疫苗pVAX1.0-st-mfc免疫小鼠诱生抗体的变化图. ◆为DNA注射免疫组诱生抗体检测值, ●为PBS注射对照组的诱生抗体检测值, ▲表示接种时间; (c) 为诱生抗体同纯化的HCV多表位抗原蛋白的Western blot杂交结果. T1图为DNA疫苗pVAX1.0-st-mfc免疫小鼠血清的杂交图, 1为BSA对照, 2为多表位抗原蛋白. T2图为纯化的HCV多表位抗原蛋白电泳图, 3为纯化的多表位抗原蛋白, 4为标准分子量Marker. T3为多表位抗原蛋白免疫家兔血清的杂交图, 5为多表位抗原蛋白, 6为BSA对照图6 HVR1合成肽与HCV多表位抗原诱生抗体的交叉反应结果(ELISA检测, 方格内为A450 nm值)P1~P10为10条自然HCV变异株的HVR1序列的合成肽, 方格内的数值为两次独立实验的A450nm值, 灰色方格表示检测结果为阳性(检测标准为: 以无关的合成肽作为N, 以各方格内的检测值为P, P/N大于2.1为检测阳性), 浅灰色为2.1<P/N<3, 深灰色为P/N>33 讨论众多研究及本实验室前期工作表明, HVR1区存在中和表位, 但高度的变异性限制了其疫苗应用研究[15]. 近年来对HVR1区免疫特性深入分析, 得到部分启示性结果. Penin等人[16]对EMBL收集的1382条和6个经IFN-α2a治疗前后的HVR1序列分析发现, 其27个氨基酸(384～410 aa)存在一定的功能保守性. Puntoriero等人[7]提出: HVR1的免疫原性变化较其基因结构变化小, 以变异的HVR1序列为基础, 设计出简并保守的HVR1氨基酸序列, 以此构建噬菌体展示肽库, 以不同丙型肝炎患者的血清对肽库进行筛选, 鉴定出了具有交叉反应性的模拟表位. 以此模拟表位免疫动物, 可诱导出能与不同株HVR1交叉反应的抗体. Watanable等人[17]发现天然的HVR1序列同Puntoriero提出的HVR1保守序列的相似性可决定与HCV患者血清的交叉反应性. 而且, Zucchelli等人[18]用HVR1模拟表位替换天然E2蛋白中的HVR1序列, 构建了多个模拟E2蛋白的核酸疫苗, 以单一和“鸡尾酒”形式免疫家兔, 提出了HVR1模拟表位联合性疫苗研究的新途径.由于分子生物学和免疫分子学的快速发展, 人工合成含多个抗原表位基因已逐步用于复合多价疫苗的研究. 本研究应用了多个HVR1模拟表位串联构建人工抗原基因, 以期增加模拟表位的涵盖范围及开发应用的方便性. 选用的9条模拟B细胞表位参照了Puntoriero等人[7]报道的噬菌体展示肽库中筛选得到的HVR1模拟表位. 为增加疫苗的免疫原性, 我们还参考有关文献选用了4条HCV保守的T细胞表第4期高 军等: 丙型肝炎病毒多表位抗原基因的构建与免疫原性研究353位, 主要是经HLA-A2转基因鼠和临床丙型肝炎患者外周血验证的两段C区35～45(YLLPRRGPRL)和132～140(DLMGYIPLV) CTL表位[11]、NS3区1073～1081(CVNGVCWTV)[12], 能同多种MHCⅡ类分子结合(HLA-DR4, HLA-DR11, HLA-DR12, HLA-DR13和HLA-DR16)的NS3区(1251～1259 aa, VLVLNPSVA)Th表位[13]. 这些表位的联合应用在某种程度上也集合模拟了HCV的主要保护性抗原表位.在分析体液免疫反应时, 我们进行了两方面的评价. 一方面评价了HCV感染者血清是否可以识别结合MFC蛋白, 即识别反应率RF的测定, 检测结果显示HCV抗体阳性血清能同MFC蛋白特异性结合, 推测结合位点应该是MFC包含的HVR1模拟B细胞表位, 具体哪些表位参与结合, 需进一步实验分析, 但从某种程度上说, MFC包含的HVR1模拟B细胞表位具有独立的免疫原性. 但实验中我们发现多数HCV感染者阳性血清同MFC反应性较弱, 而且有些不能发生反应, 分析可能的原因在于本研究选用的模拟B细胞表位模拟了HVR1中和表位的特性, 推测丙型肝炎慢性患者体内抗HVR1中和表位的抗体滴度一般较低或缺如, 这也从一个侧面说明为什么丙型肝炎容易慢性化. 另一方面评价了MFC蛋白诱生的抗体是否具有交叉结合中和活性, 即交叉反应性CR的测定, 因为国内外研究者普遍认为存在于HCV病毒HVR1区内的中和表位为线性表位, 所以, 参照自然感染的不同HCV病毒株HVR1序列, 人工肽合成的HVR1合成肽在某种程度上可以代替完整病毒, 用于评价免疫抗体的中和活性, 而且, 针对HVR1序列中每个位点上存在的氨基酸特性, 应用软件分析自然感染HCV变异株HVR1序列的相似性, 选取多条彼此存在较大差异性的HVR1序列, 组成评价交叉反应性的“评价肽组”, 对免疫抗体的交叉中和活性进行评价[7]. 本研究依据上述理论, 选用了10条HVR1合成肽组成自己的“评价肽组”, 其中5条来源于GenBank登录序列, 5条来源于本实验室前期报道的中国HCV变异株. 应用本研究的“评价肽组”检测表明MFC蛋白免疫血清具有90%的交叉反应性, 尤其全部可以同5条中国HCV变异株HVR1合成肽交叉结合, 预示本研究构建的HCV多表位抗原MFC具有用于预防中国人群HCV感染的前景. 我们还对质粒pVAX1.0-st-mfc DNA疫苗小鼠免疫后的脾细胞增殖、Th1型细胞因子分泌和迟发型超敏反应等细胞免疫反应进行了检测, 结果证实尚需在HLA转基因动物体内进一步证实.参考文献1 中华医学会肝病学分会, 中华医学会传染病与寄生虫学分会.丙型肝炎防治指南. 中华医学杂志, 2004, 84(9): 775—7802 戚中田, 杜平. 丙型肝炎病毒与丙型肝炎. 上海: 上海科学技术出版社, 1992. 1—103 Fried M W, Shiffman M L, Reddy R K, et al. 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