六味地黄汤辅助环磷酰胺对荷H22小鼠肝癌组织VEGF及VEGFR2蛋白表达的影响

江西中医药大学学报２０１　５年８月第２７卷第４期　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＪＩＡＮＧＸＩ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　ＯＦ　ＴＣＭ　２０１５　Ｖｏ１．２７　Ｎｏ．４　

六味地黄汤辅助环磷酰鹏　肝癌组织ＶＥＧＦ及ＶＥＧＦＩ　

★　谢斌　余功饶斌刘红宁　（江西中臣　摘要：目的：观察六味地黄汤辅助环磷酰胺对荷Ｈ２２肝癌・　小鼠４０只，随机分为模型组、化疗组、六味组、六味化疗联　ｌ　模前两周开始用药［剂量为２２　ｇ／（ｋｇ・ｄ）］，化疗组［剂量　处死小鼠称重，取瘤组织称重计算抑瘤率，取脾组织称重事

景　疗组与六味化疗联合组有良好的抑瘤作用；六味组脾指数　组ＶＥＧＦ蛋白表达明显减少，与化疗组比较，差异有统计乌　蚕　六味化疗联合组ＶＥＧＦＲ２蛋白表达减少，与模型组比较，，０．０１）。结论：六味地黄汤辅助环磷酰胺可抑制荷Ｈ２２肝　

蚕　而发挥辅助化疗作用。　ｌ　关键词：肝癌；７’－￣味地黄汤；环磷酰胺；ＶＥＧＦ；ＶＥＧＦＲ２　中图分类号：Ｒ２８５．５　文献标识码：Ａ　

Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｌｉｕｗｅｉ　Ｄｉｈｕａｎｇ　Ｄｅｃｏｃｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ａｓｓｉｓｔｉｎｇ　Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ　ｏｎ　ＶＥＧＦ，ＶＥＧＦＲ２　Ｅｘ－　ｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｈ２２　Ｔｕｍｏｒ——ｂｅａｒｉｎｇ　Ｒａｔｓ　

ＸＩＥ　Ｂｉｎ，ＹＵ　Ｇｏｎｇ，ＲＡＯ　Ｂｉｎ，ＬＩＵ　Ｈｏｎｇ—ｎｉｎｇ　Ｊｉａｎｇｘｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｎｃｈａｎｇ　３３０００４，Ｃｈｉｎａ．　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｏｂｓｅｒｖｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｌｉｕｗｅｉ　Ｄｉｈｕａｎｇ　ｄｅｃｏｃｔｉｏｎ（ＬＷ）ｆｏｒ　ａｓｓｉｓｔｉｎｇ　ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ（ＣＴＸ）ｏｎ　ＶＥＧＦ，ＶＥＧ—　ＦＲ２　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｈ２２　ｔｕｍｏｒ—ｂｅａｒｉｎｇ　ｍｉｃｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：４０　ｍａｌｅ　Ｋｕｎｍｉｎｇ　ｍｉｃｅ　ｗｅｒｅ　ｒａｎｄｏｍｌｙ　ｄｉｖｉｄｅｄ　ｉｎｔｏ　ｍｏｄｅｌ　ｇｒｏｕｐ，ＣＴＸ　ｇｒｏｕｐ，　ＬＷ　ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ　ＬＷ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ＣＴＸ　ｇｒｏｕｐ，１０　ｒａｔｓ　ｉｎ　ｅａｃｈ　ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈ２２　ｔｕｍｏｒ　ｍｏｄｅｌ　ｂｙ　ａｘｉｌｌａｒｙ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈ２２　ｃｅｌｌｓ，ＬＷ　ｇｒｏｕｐ　ｂｅｇａｎ　ｔｏ　ｕｓｅ　ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆｔｗｏ　ｗｅｅｋｓ　ｂｅｆｏｒｅ　ｍｏｌｄｉｎｇ　ｌｄｏｓｅ　ｏｆ２２　ｇ／（ｋｇ　ｄ）Ｊ，ＣＴＸ　ｇｒｏｕｐ　ｌａｔ　ａ　ｄｏｓｅ　ｏｆ　５０ｍｇ／（ｋｇ　‘ｄ），ｅｖｅｒｙ　ｏｔｈｅｒ　ｄａｙ　ｆｏｒ　１　ｔｉｍｅ］ａｎｄ　ＬＷ　ｇｒｏｕｐ　ｆｏｒ　ｄｒｕｇ　ａｆｔｅｒ　ｍｏｌｄｉｎｇ．Ｐｕｔ　ｔｈｅ　ｍｉｃｅ　ｔｏ　ｄｅａｔｈ　ａｆｔｅｒ　１４　ｄａｙｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｒｏｕｐ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ，　ｔｈｅｎ　ｔａｋｅ　ｗｅｉｇｈｉｎｇ，ｔａｋｅ　ｔｕｍｏｒ　ｔｉｓｓｕｅ　ｗｅｉｇｈｉｎｇ　ｔｏ　ｃａｌｃｕｌａｔｅ　ｔｕｍｏｒ—ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｒａｔｅ，ｓｐｌｅｅｎ　ｔｉｓｓｕｅ　ｗｅｉｇｈｉｎｇ　ｔｏ　ｃａｌｃｕｌａｔｅ　ｔｈｅ　ｓｐｌｅｅｎ　ｉｎ—　ｄｅｘ，ｍａｋｅ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｆｔｅｒ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＶＥＧＦ，ＶＥＧＦＲ２．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ｔｈｅ　ＣＴＸ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｇｒｏｕｐ　ｈａｄ　ａ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　ｔｕｍｏｒ；ＬＷ　ｇｒｏｕｐ　ｓｐｌｅｅｎ　ｉｎｄｅｘ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｂｅｉｎｇ　ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｍｏｄｅｌ　ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５），ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｇｒｏｕｐ￣ＶＥＧＦ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ，ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ＣＴＸ　ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒ—　ｅｎｃｅ　ｗａｓ　ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ（Ｐ＜０．０５），ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ＬＷ　ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｗａｓ　ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ（Ｐ＜０．０５）；ｃｏｍｂｉｎａ－　ｔｉｏｎ　ｇｒｏｕｐ　ＶＥＧＦＲ２　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ，ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｍｏｄｅｌ　ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｒｅ　ｗａｓ　ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ　ｄｉｆｆｅｒ－　

基金项目：国家自然科学基金项目（８１２６０５２３）；江西省研究生创新基金项目（ＹＣ２０１４一￥２７５）；江西中医药大学研究生创新基金项目　（ＪＺＹＣ１４Ａ０２）。　第一作者：谢斌，博士，副教授，硕士生导师。研究方向：中医药抗肿瘤。　通信作者：刘红宁，博士，教授。研究方向：中医基础理论。Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｈｏｎｇｎｉｎ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ。　

・７２・　谢斌等：六味地黄汤辅助环磷酰胺　荷Ｈ２２小鼠肝癌组织ＶＥＧＦ及ＶＥＧＦＲ２蛋白表达的影响　

ｅｎｃｅ（Ｐ＜０．０５）；ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ＬＷ　ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｒｅ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＜０．０１）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅ　ＬＷ　ｃｏｕｌｄ　ｅｎｈａｎｃｅ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｔｕ—　ｍｏｔ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＣＴＸ．Ｉｔｓ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｍａｙ　ｂｅ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｗｈｉｃｈ　ｃａｎ　ｒｅａｃｈ　ｔｈｅ　ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＶＥＧＦ　ａｎｄ　ＶＥＧＦＲ２　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｃａｎｃｅｒ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｌｉｖｅｒ；Ｌｉｕｗｅｉ　Ｄｉｈｕａｎｇ　Ｄｅｃｏｃｔｉｏｎ；Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ；ＶＥＧＦ；ＶＥＧＦＲ２　

临床上六味地黄汤与化疗药物联合应用既可使　化疗药物增效，又能降低各种化疗毒副作用，具有良　好的对症辅助治疗效果　。然而，六味地黄汤辅　助化疗药物的作用机理却鲜有报导，本课题前期研　究表明，六味地黄丸与化疗药物联合应用有较好的　抑瘤作用，故在前期研究基础之上，进一步探究六味　地黄汤辅助环磷酰胺对荷Ｈ２２肝癌小鼠ＶＥＧＦ与　ＶＥＧＦＲ２蛋白表达的影响，从抑制肿瘤血管增殖生　的角度，探讨该方对化疗药物辅助作用的起效机制。　１材料和方法　１．１动物及瘤株动物：ＳＰＦ级雄性ＫＭ小鼠，体　重（２０±２）ｇ，江西中医药大学实验动物中心提供，　许可证号：ＳＣＸＫ（赣）２０１１～０００１。　瘤株：小鼠Ｈ２２肝癌细胞，中国医学科学院肿　瘤细胞库提供。　１．２药物及制备六味地黄汤：熟地１５　ｇ，山茱萸　１２　ｇ，山药１２　ｇ，丹皮１０　ｇ，泽泻ｌＯ　ｇ，茯苓１０　ｇ（购自　江西省中医院中药房）。将以上中药加１０倍量的　清水浸泡１　ｈ，然后煎煮，水沸后以小火煎４０　ｍｉｎ，过　滤；第二次加８倍量的清水煎熬，水沸后小火煎４Ｏ　ｍｉｎ，过滤，合并滤液，常压浓缩至６９　ｍＬ（即每毫升　药液含１　ｇ原药），冷却后密封，４℃保存备用。实　验药物浓度２２　（ｋｇ・ｄ）。阳性药物为注射用环　磷酰胺（Ｃｙｃｌ０ｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ，ＣＴＸ，批号：１３１１１３２５，　０．２　ｇ／瓶，江苏恒瑞医药股份有限公司提供）。ＣＴＸ　药物浓度为５０　ｍｇ／（ｋｇ・ｄ），隔日１次。　１．３试剂及仪器抗兔／鼠通用型免疫组化试剂盒　（Ｄａｋｏ　Ｄｅｎｍａｒｋ　Ａ／Ｓ，批号：２０１４０４２５）；ＶＥＧＦＲ２一　抗（Ａｆｆｎｉｔｙ，批号：０００１７０１２）；ＶＥＧＦ一抗（Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｔｅｅｈ，批号：１９００３—１一ＡＰ）；二抗ＨＲＰ标记山羊抗　兔（谷歌生物，批号：２０１４０４１５）；ＢＳＡ（Ｒｏｃｈｅ，批号：　３２００６８７）；倒置显微镜（ＬＥＩＣＡ，ＤＭＩ３０００Ｂ）；切片机　（上海徕卡仪器有限公司，ＲＭ２０１６）；烘箱（上海福　玛实验设备有限公司，ＤＧＸ一９００３Ｂ）；脱色摇床（北　京六一仪器厂，ＷＤ一９４０５Ａ）；普通光学显微镜（重　庆光电仪器有限公司，ＸＳＰ—Ｃ２０４）。　１．４动物处理　１．４．１　肝癌Ｈ２２细胞接种方法小鼠肝癌Ｈ２２细　胞的培养及传代：将腹水型小鼠肝癌Ｈ２２细胞，于　３７　ｏＣ、５％ＣＯ　培养箱，用含１０％ＦＣＳ的ＲＰＭＩ１６４０　完全培养基悬浮培养。取最佳生长状态的小鼠肝癌　Ｈ２２细胞，浓度调为５×１０。个／ｍＬ，以０．２　ｍＬ／只（１　×１０　个细胞／只）无菌注入小鼠腹腔进行接种传　代，于接种７～９　ｄ，小鼠腹部膨隆出现腹，可用于小　鼠皮下移植瘤的接种。　１．４．２动物模型制作荷Ｈ２２肝癌小鼠模型的建　立：将接种Ｈ２２瘤种７～９　ｄ，腹部隆起明显的腹水　瘤小鼠以脱颈法处死，无菌条件下从腹腔抽出瘤液，　以无菌生理盐水稀释后，１５００　ｒ／ｍｉｎ离心５　ｍｉｎ，调　整瘤细胞浓度为５×１０。爪／ｍＬ，于小鼠右腋下行皮　下无菌接种，接种量为每只０．２　ｍＬ／只。　１．４．３　动物分组造模结束后，小鼠随机分为模型　组、化疗组、六味组、六味化疗联合组，每组１０只。　１．４．４给药模型组：接种２４　ｈ后，以０．２　ｍＬ生　理盐水灌胃，ｑ１２　ｈ；化疗组：接种２４　ｈ后，ＣＴＸ以５０　ｍｇ／（ｋｇ・ｄ）剂量隔日腹腔注射；六味组：造模前两　周即开始按２２ｇ／（ｋｇ・ｄ）灌胃给药，ｑ１２　ｈ；六味化　疗联合组：接种２４　ｈ后，六味按２２　（ｋｇ・ｄ）灌胃　给药，ｑ１２　ｈ，ＣＴＸ以５０　ｍｇ／（ｋｇ・ｄ）剂量隔日腹腔　注射。２　Ｗ后处死各组小鼠并称重，取瘤组织及脾　脏称重。　１．５　免疫组织化学法肿瘤组织检测ＶＥＧＦ，ＶＥＧ—　ＦＲ２蛋白的表达水平　方法如下：组织切片、脱蜡、　水化、洗涤、抗原修复、洗涤、灭活酶、洗涤、５％ＢＳＡ　封闭、一抗分别为ＶＥＧＦ（１：１００）、ＶＥＧＦＲ２（１：　１００），４℃过夜孵育１４　ｈ；第２　Ｅｌ室温复温３　ｈ后，　ＰＢＳ漂洗３×５　ｍｉｎ；加入二抗，４℃孵育５０　ｍｉｎ；漂　洗，ＤＡＢ显色；漂洗，苏木素复染，贴片，脱水和透　明，中性树胶封片。以ＬＥＩＣＡ倒置显微镜拍照，每　张标本按顺序选５个视野，使用Ｉｍａｇｅ—Ｐｒｏ　Ｐｌｕｓ　６．０软件分析，用平均光密度（Ｄ）表示阳性物质的　相对含量。　１．６统计方法实验完全随机设计，结果以孟±ｓ　表示，ＳＰＳＳ１６．０软件分析，多组均数比较采用单因　素方差分析。　２结果　２．１　六味地黄汤辅助ＣＴＸ对荷Ｈ２２肝癌小鼠抑瘤　率及脾指数的影响结果见表１。结果表明：化疗　组及六味化疗联合组均具有明显的抑瘤作用；六味　组脾指数增大，与模型组比较差异具有统计学意义