广西大学
硕士学位论文
产L-乳酸的大肠杆菌基因工程菌的构建
姓名：陈五九
申请学位级别：硕士
专业：发酵工程
指导教师：黄日波
20070601产Ｌ一乳酸的大肠杆菌ＢＷ２５１１３Ｄ基因工程菌的构建
摘要
利用含有质粒ｐＫＤ４６的大肠杆菌菌株ＢＷ２５１１３。在阿拉伯糖诱导后，表达
入噬菌体的３个重组蛋白Ｇ锄，Ｂｅｔ，和Ｅｘｏ。Ｇａ＝蛋白抑制了宿主的ＲｅｃＢＣＤ核酸
外切酶ｖ活性，而Ｂｅｔ和Ｅｘｏ参与了基因重组过程，因此宿主菌就具有了同源
重组的能力。设计的引物５’端有３９ｂｐ的拟敲除基因的同源臂，３７端为扩
增引物，以ｐＫＤ３（或ｐＫＤ４）为模板，扩增两侧含ＦＲＴ位点的氯霉素（或卡那霉
素抗性）基因．将此线性片段电转入具重组功能的感受态细胞，利用氯霉紊
（或卡那霉素抗性）平板就可以筛选到阳性转化体。再利用表达ＦＩＰ重组
酶的质粒ｐＣＰ２０，可将ＦＲＴ位点之间的氯霉素（或卡那霉素抗性）抗性基因
删除。利用该重组系统，构建了乙醇脱氢酶（ａｄｈＥ）、Ｄ一乳酸脱氢酶（ＩｄｈＡ）
双缺失的大肠杆菌工程菌株ＢＷ２５１１３０，乙酸激酶（ａｃｋＡ）缺失的大肠杆菌工
程菌株（ＢＷ２５１１３）。并将表达牛链球菌Ｌ一乳酸脱氢酶基因（ＩｄｈＬ）的ｐＳＥ３８０
质粒转化到踟２５１１３Ｄ菌株中．利用ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分析表明该基因在ＢＷ２５１１３Ｄ中
有蛋白表达，测定该酶的酶活力为１５５Ｕ／ｍＬ。ＢＷ２５１１３Ｄ／ｐＳＥ３８０－Ｉｄｈ菌株摇
瓶发酵培养３５ｈ，对发酵液进行过滤处理，用ＨＬＰＣ检测产物，尚未检测ＮＬ
一乳酸。
关键词：同源重组，ＦＲＴ位点，ＦＩＰ重组酶，Ｌ一乳酸ＤＥＬＥＴｌＯＮＯＦＡ￡ｌ，炬、￡ＤＦ拍、月（ｊｆ∽ＩＮＣＨＲＯＭＯＳＯＭＥＯＦＥＣＯＬｌＢＹ
ＲＥＤＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴｌ０Ｎ
ＡＢＳＴＲＡＣＴ
ＰｌａｍｉｄｐＫＤ４６ｃａｎｅｘｐｒｅｓｓｔｈｒｅｅｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｇａｍ，ＢｅｔａｎｄＥｘｏ．Ｇａｍｉｎｈｉｂｉｔｓ
ｔｈｅｈｏｓｔＲｅｃＢ∞ｅｘｃｎｕｃＩｅａｓｅＶ．ｓｏｔｈａｔＢｅｔａｎｄＥｘｏｃａｎ驴ｉｎａＧｃｅｓｓｔｏＤＭｅｎｄｓ
・１４８・ 中国抗生素杂志２００８年３月第３３卷第３期
文章编号：１００１．８６８９（２００８）０３．０１４８．０５
５．酮基ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎ基因工程茵的构建
马颖谡何建勇 张怡轩
（沈阳药科大学生命科学与生物制药学院， 沈阳１１００１６）
摘要：采用基因插入失活的方法，将１．５ｋｂ安普霉素抗性基因插入１．８ｋｂ ａｖｅＦ基因内部Ｓａｉｌ位点，构建重组质粒ｐＰＣ．５，并转 化除虫链霉菌Ｄ２—１４，获得基因工程菌株ＡＶ—Ｆ１。经ＨＰＬＣ分析，发现该菌株主要产生两个组分，分别为５．酮ａｖｅｒｍｅｅｔｉｎ １ａ和５．酮 ａｖｅｒｍｅｅｔｉｎ ２ａ，还产生一个小组分为ａｃｅｒｍｅｃｔｉｎ Ｂ１ａ ｏ５一酮ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎ基因工程菌株的构建成功，为化学合成新的ａｖｅｒｍｅｅｔｉｎ衍生物提
供了可利用的原料来源。
关键词： 除虫链霉菌； Ａｖｅｒｍｅｅｔｉｎ； ５一酮ａｖｅｒｍｅｅｔｉｎ；基因失活
中图分类号：Ｒ９７８．１ 文献标识码：Ａ
Ｔｈｅ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｓｔｒａｉｎ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ５－０－ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎｓ
Ｍａ Ｙｉｎｇ－ＳＵ，Ｈｅ Ｊｉａｎ－ｙｏｎｇ ａｎｄ Ｚｈａｎｇ Ｙｉ－ｘｕａｎ
（Ｔｈｅ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ １ １００１６）
ＡＢＳＴＲＡＣＴ Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｇｅｎｅ ｉｎｓｅｒｔ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ，ａ １．５ ｋｂ ａｐｒａｍｙｃｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｗａｓ
ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ＳａｌＩ ｓｉｔｅ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ａｖｅＦ ｇｅｎｅ，Ａｓ ａ ｒｅｓｕｌｔ，ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＰＣ一５ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ—
工程菌构建的基本过程
工程菌构建是一种利用基因工程技术将微生物菌株改造成具有特定功能的生物工厂的过程。该过程包括以下几个基本步骤：菌株选择、基因克隆、基因编辑和菌株表达。
在工程菌构建的过程中，菌株选择是非常重要的一步。科学家们需要根据所需产物的特性和生产环境的要求，选择合适的菌株作为基础。常用的菌株包括大肠杆菌、酵母菌等，它们具有较高的生长速度和较好的基因操作性能。
接下来，基因克隆是工程菌构建的关键步骤之一。科学家们需要将目标基因从原有的生物体中剪切下来，然后通过PCR等方法扩增得到大量的目标基因。接着，将目标基因与载体DNA连接，形成重组DNA。通过转化或转染等方法将重组DNA导入到宿主菌中，使宿主菌获得目标基因。
基因编辑是工程菌构建的另一个重要步骤。在完成基因克隆后，科学家们需要对目标基因进行编辑，以实现所需的功能。常用的编辑方法包括基因敲除、基因插入、基因点突变等。通过这些方法，科学家们可以改变菌株的代谢途径、增强菌株的生物合成能力，从而实现产物的高效生产。
菌株表达是工程菌构建的最后一步。在编辑完成后，科学家们需要将菌株培养在适当的培养基中，提供所需的营养物质和培养条件，促进目标基因的表达和产物的积累。同时，科学家们也需要对菌株进行监测和调控，确保产物的质量和产量达到预期的要求。
总结起来，工程菌构建的基本过程包括菌株选择、基因克隆、基因编辑和菌株表达。通过这一过程，科学家们可以构建具有特定功能的工程菌，并利用其高效地生产各种有用的产物。这一技术在医药、能源、环境保护等领域具有广阔的应用前景，为人类社会的可持续发展提供了新的思路和方法。
1, 5-戊二胺谷氨酸棒杆菌基因工程菌的构建
材化081 燕飞龙 081097
摘要1, 5-戊二胺是一种重要的化工原料, 发酵法生产1, 5-戊二胺是一条新颖且具有潜在竞争力的生产途径。以蜂房哈夫尼菌AS1. 1009基因组为模板, 通过PCR
扩增, 得到大小约为22 kb的赖氨酸脱羧酶基因ldc。以大肠杆菌/谷氨酸棒杆菌穿梭质粒pXM Jl9为载体, 将扩增得到的目的基因片段克隆至谷氨酸棒杆菌C.
glu tam icum TK260512, 获得重组菌株C. glutam icum TK260512 /pXMJl9-ldc. 在摇瓶发酵水平上, 通过IPTG 诱导ldc基因的表达, 并采用反相高效液相色谱方法测定了发酵液中1, 5-戊二胺的含量, 结果显示, 经36h发酵, 工程菌C. g lu
tam icum TK260512 /pXMJ19-ldc的1, 5-戊二胺产量为0.96 g/L。
关键词赖氨酸脱羧酶谷氨酸棒杆菌1, 5-戊二胺
正文1, 5-戊二胺, 即尸胺是生物体内广泛存在的具有生物活性的含氮碱, 为蛋白质腐败时赖氨酸在脱羧酶作用下发生脱羧反应时生成。在农业上, 产物1, 5-戊二胺可用于调控植物衰老过程、促进雌雄蕊的发育, 改善植物果实发育, 提高果实产量[ 1, 2] ; 在医学上, 它也可作为一种有效治疗痢疾的药物[3]; 在工业上,
将1, 5-戊二胺与二元酸进行聚合反应可合成优质高分子材料——新型尼龙[4]。此外, 1, 5-戊二胺是微生物细胞内调节铁离子浓度的“铁亲和系统”的主要组成成分[5] ; 1, 5-戊二胺在关闭孔蛋白通道方面也起着重要的作用[6] ; 而且它还是反刍兽新月单胞菌(Selenom onasrum inantium )、嗜碱性韦荣球菌( Veillonella alcalescens),小韦荣球菌( V. parvula), 和解脂厌氧弧菌(A
