SHMT基因工程菌的构建方案设计
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基因工程菌构建的方法和步骤嗨,大家好!今天咱们要聊聊一个听起来可能有点高深的东西——基因工程菌的构建。
别担心,我会把这事儿说得简单明了,像在跟朋友闲聊一样。
如果你对基因工程一知半解,也不用急着担心,接下来的内容会把这事儿讲得像做菜一样简单易懂。
好了,咱们开始吧!1. 先来个热身:什么是基因工程菌?说白了,基因工程菌就是经过“动刀子”的细菌,咱们给它加了些新“配料”。
这就像是你喜欢的菜里突然多了点特别的调料,让它味道更好或者更特别。
这个“动刀子”其实是指把一些新的基因搞到细菌里去,这些新基因会让细菌做出一些你平时见不到的“特技”,比如说生产某种药物或者是分解污染物。
2. 基因工程菌的构建步骤好啦,进入正题。
咱们要一步步来,首先得搞明白整个过程都包括哪些步骤。
别担心,这个过程并不复杂,主要就是几个大步骤:2.1 设计基因首先,咱们得确定你想要的“特技”是什么。
比如你想让细菌制造某种药物,那么你就需要设计一个含有这个药物生产所需基因的“蓝图”。
这一步就像是做菜之前,你得先想好要做什么菜,准备好食谱。
设计的过程需要用到一些高科技的工具和软件,但大致上就是确定你要的基因序列。
2.2 制备载体有了基因的设计,接下来要做的就是把这些基因装进“载体”里。
载体就像是细菌的“旅行包”,它能帮助基因顺利进入细菌体内。
载体一般是一些小的环状DNA,这些DNA就像是装在“小盒子”里的基因,好比是给细菌送去的“外卖”。
这个载体要跟细菌的细胞膜亲密接触,才能顺利把基因送进去。
2.3 转化细菌接着,就是把装有基因的载体送到细菌里面,这个过程叫做“转化”。
把细菌和载体混在一起,再通过一些方法,比如热激、电击等,帮它们“融合”。
想象一下你在举办一场小派对,细菌就是客人,载体就是派对上的小礼物,我们要确保这两者能“相遇”。
2.4 筛选和验证好了,基因送进去了,接下来就得确认细菌是不是变得“乖乖”的了。
我们要做一些筛选工作,确保细菌里确实有咱们放进去的基因。
基因工程菌构建的方法和步骤哎呀,这可是个大话题啊!基因工程菌构建的方法和步骤,听起来就让人觉得高深莫测。
不过别担心,我这个话痨会尽量用简单易懂的语言来解释清楚的。
咱们就从头开始吧,一步一步地往前走。
我们得知道什么是基因工程菌。
简单来说,就是把一种生物体的基因提取出来,然后放到另一种生物体里,让它变得更强大、更有用。
这样一来,我们就可以生产出更多的药物、食物和其他有用的东西了。
那么,怎么才能构建出一个好的基因工程菌呢?这可是个技术活儿,需要掌握一些基本的方法和步骤。
咱们先来看看第一步:提取基因。
提取基因可不是一件容易的事情。
我们需要从一种生物体中提取出它的DNA,然后把它转移到另一种生物体里。
这个过程叫做转化。
转化的关键在于找到正确的方法和条件,让DNA能够成功地转移到目标生物体里。
这可是个技术活儿,需要耐心和细心。
好了,现在我们已经成功地把基因提取出来了。
接下来就是第二步:构建基因表达载体。
构建基因表达载体就是为了把基因放到目标生物体里去。
这个过程叫做克隆。
克隆的关键在于找到正确的方法和条件,让基因能够成功地转移到目标生物体里并且正确地表达出来。
这可是个技术活儿,需要耐心和细心。
好了,现在我们已经成功地把基因表达载体构建好了。
接下来就是第三步:转化目标生物体。
转化目标生物体就是为了把基因表达载体放到目标生物体里去。
这个过程叫做转化。
转化的关键在于找到正确的方法和条件,让基因表达载体能够成功地转移到目标生物体里并且正确地表达出来。
这可是个技术活儿,需要耐心和细心。
好了,现在我们已经成功地把基因表达载体转化到目标生物体里去了。
接下来就是第四步:筛选阳性细胞株。
筛选阳性细胞株就是为了选出那些能够成功表达出我们的基因表达载体的细胞株。
这个过程叫做筛选。
筛选的关键在于找到正确的方法和条件,让阳性细胞株能够被成功地筛选出来。
这可是个技术活儿,需要耐心和细心。
好了,现在我们已经成功地选出了阳性细胞株。
接下来就是第五步:扩大培养规模。
L-丝氨酸基因工程菌的构建及发酵条件优化L-丝氨酸作为一种组成蛋白质的基本氨基酸广泛应用于医药、食品、化妆品等行业,市场需求量不断增加。
目前蛋白质水解提取法、酶转化法、化学合成法和微生物发酵法等是生产L-Ser的主要方法,因为微生物发酵法具有原料价格便宜,产物纯度高,容易提取等诸多优点而备受关注。
本文通过定点突变解除了ser A的反馈抑制,构建了含有ser A、ser B、ser C、pgk四个基因的表达质粒,增加丝氨酸合成的代谢通量,再以实验室前期通过随机突变方法筛选获得的比酶活降低的SHMT突变基因gly Am突变菌株BJ-01为出发菌株,敲除其基因组上的sda A基因构建菌株BJ-02,在BJ-02基因组上分别敲除编码丝氨酸脱水酶的其它四个基因,构建了一系列L-Ser基因工程菌,最终获得高产L-Ser的菌株。
主要研究内容及结果具体如下:1.通过定点突变,使磷酸甘油酸脱氢酶(PDGH)编码基因ser A的反馈抑制被解除,将该突变基因与编码磷酸甘油酸激酶(PGK)的基因pgk、磷丝氨酸氨基转移酶(PSAT)的基因ser C、磷丝氨酸磷酸酶(PSP)的基因ser B这三个基因插入到一个低拷贝、温度诱导表达质粒p SC中,构建了重组表达质粒p SC-05。
2.运用Red同源重组的方法,敲除E.coli BJ-01基因组上编码丝氨酸脱水酶的基因sda A获得菌株BJ-02,将重组表达质粒p SC-05转化到E.coli BJ-01和E.coli BJ-02中,构建菌株BJ-01/p SC-05和BJ-02/p SC-05。
在5 L发酵罐上采用补料分批发酵的方式比较了BJ-01/p SC-05和BJ-02/p SC-05的L-Ser产量。
结果表明BJ-02/p SC-05在发酵过程中最高可积累11.4 g/L的L-Ser,说明sda A基因的敲除使菌株产L-Ser的能力显著提高。
3.运用Red同源重组的方法,分别单独敲除E.coli BJ-02基因组上除sda A外其余四个编码丝氨酸脱水酶的基因sda B、ilv A、tdc B和tdc G,将重组表达质粒p SC-05转化到这四个单基因敲除菌中,构建了4株L-Ser基因工程菌。
基因工程菌设计方案一、研究背景基因工程菌是指利用基因工程技术对微生物中的基因进行修改和调整,以实现特定功能或生产特定产物的微生物。
基因工程菌的应用范围非常广泛,可以用于生物药物的生产、生物能源的开发、环境修复等多个领域。
在生物药物领域,基因工程菌可以用于大规模生产蛋白质药物,如胰岛素、人类生长激素等。
在生物能源领域,基因工程菌可以用于合成生物柴油、生物乙醇等可再生能源。
在环境修复领域,基因工程菌可以用于处理污水中的有害物质,修复受污染的土壤等。
随着生物技术的不断发展,基因工程菌的应用前景越来越广阔。
因此,设计基因工程菌的研究显得尤为重要。
下面将以基因工程菌在生物能源领域的应用为例,介绍基因工程菌设计方案的具体步骤。
二、研究目的本研究旨在设计一种能够高效合成生物柴油的基因工程菌,通过调整其代谢通路,促进生物柴油合成酶的表达,从而实现高效生产生物柴油的目的。
三、实验步骤1. 选择合适的宿主菌在设计基因工程菌之前,首先需要选择一个适合的宿主菌。
宿主菌的选择需要考虑其生长速度、代谢特点、操作方便性等因素。
目前常用的宿主菌包括大肠杆菌、酿酒酵母、拟杆菌等。
在生物柴油合成方面,大肠杆菌是一种常用的宿主菌,具有快速生长、易操作等优点。
2. 确定目标基因生物柴油的合成需要多个酶参与,因此首先需要确定参与生物柴油合成的目标基因。
常用的目标基因包括脂肪酸合成酶、脂肪酸酶、脂酰辅酶A合成酶等。
3. 构建表达载体在确定目标基因后,需要将这些基因导入到宿主菌中进行表达。
为此,需要构建一个合适的表达载体。
表达载体的构建包括选择适当的启动子、选择合适的表达基因等。
同时,还需要考虑构建选择标记的载体,以便筛选转化成功的菌株。
4. 转化宿主菌构建好表达载体后,需要将其导入到宿主菌中进行转化。
转化可采用化学转化、电穿孔转化、电渗转化等方法。
在转化后,通过筛选标记来筛选出转化成功的菌株。
5. 验证目标基因表达转化成功的菌株中,目标基因是否能够成功表达是一个关键问题。
基因工程菌的构建过程
一、基因工程菌的构建过程
1.克隆
克隆技术是将目标基因从一种物种转移到另一种物种中的过程。
它由两个步骤组成:(1)将目标基因扩增到一种可以被容易地检测和分离的质粒中;(2)将扩增的基因质粒尽可能多地植入宿主细胞中,使宿主细胞拥有一个新的基因,为后续基因工程提供条件。
2.启动子定向突变
基因工程菌的定向突变是指在基因的启动子序列中引入突变,以改变其对基因表达的影响。
典型的定向突变包括插入、缺失或点突变,等等。
这些突变可以增强基因的表达,也可以减弱基因的表达,从而改变它的生物功能。
3.基因敲除
基因敲除技术是一种遗传改造技术,它是指将一个或多个基因从宿主的基因组中消除,以减少或完全抑制受体基因的表达。
基因敲除技术与基因表达调控技术一起衍生出了各种类型的基因工程菌,为基因研究提供了新的思路。
4.基因重组
基因重组技术是指在宿主细胞中重新连接两个不同的基因,以产生拥有新的功能的基因组。
通过基因重组,可以将一个基因的多个功能分解成多个更小的基因,从而丰富和改变生物的功能。
5.基因融合
基因融合技术是一种合成生物技术,它是把两个以上的基因连接在一起,形成一个新的基因,以改变基因组或改变其表达特征。
基因融合技术是基因工程的重要技术,能够改变宿主的生物功能,改变这种宿主的表达特征。
一种基因工程菌及其制备方法和应用与流程基因工程菌是指经过基因工程技术改造的微生物菌株,广泛应用于生物工程、医学和农业等领域。
本文将介绍一种基因工程菌及其制备方法和应用与流程。
一、基因工程菌的制备方法基因工程菌的制备方法主要包括以下几个步骤:1. 选择宿主菌株:根据所需的功能和目标,选择合适的菌株作为宿主,常见的宿主菌株有大肠杆菌、酵母菌等。
2. 提取目标基因:从源菌株中提取所需的目标基因,可以通过PCR 扩增、限制性内切酶切割等方法获取目标基因片段。
3. 载体构建:将目标基因片段与合适的载体进行连接,构建重组载体。
常用的载体有质粒、噬菌体等。
4. 转化:将重组载体导入宿主菌株中,使目标基因能够稳定表达。
5. 筛选和鉴定:经过转化的菌株进行筛选和鉴定,常用的方法有抗性筛选和PCR鉴定等。
6. 培养和扩大:经过筛选和鉴定的基因工程菌株进行培养和扩大,得到足够的菌体。
二、基因工程菌的应用与流程基因工程菌在生物工程、医学和农业等领域有广泛的应用。
下面以生物工程领域为例,介绍基因工程菌的应用与流程。
1. 目标基因的克隆与表达从源菌株中提取目标基因,并通过PCR扩增获取目标基因片段。
然后将目标基因片段与适当的载体连接,构建重组载体。
接下来,将重组载体导入宿主菌株中,经过筛选和鉴定,获得含有目标基因的基因工程菌株。
最后,通过培养和表达优化等步骤,使目标基因在基因工程菌中稳定表达,并获得足够的目标蛋白产物。
2. 代谢工程与合成生物学基因工程菌在代谢工程和合成生物学中起到重要作用。
通过基因工程技术,可以改造菌株的代谢途径,使其具有特定的代谢功能。
例如,通过引入外源基因,可以使菌株具备合成特定化合物的能力,如生物染料、药物等。
通过调控代谢途径中的关键基因表达水平,还可以实现代谢产物的高效合成。
3. 蛋白质工程与酶工程基因工程菌在蛋白质工程和酶工程中也有广泛应用。
通过基因工程技术,可以改变蛋白质的结构和功能,实现蛋白质的改良和优化。
一种基因工程菌及其制备方法和应用与流程基因工程菌是一种被广泛应用于生物技术领域的微生物。
它们通过基因工程技术的手段,对其自身的基因进行改造和调控,以实现特定的生物合成功能。
本文将介绍基因工程菌的制备方法和应用,并展示其在生物技术流程中的重要作用。
一、基因工程菌的制备方法基因工程菌的制备方法主要包括基因克隆、质粒构建、转化和筛选等步骤。
1. 基因克隆:首先,从目标物种中提取所需基因的DNA序列。
然后,利用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增目标基因。
接下来,将扩增得到的基因片段与载体DNA进行连接,形成重组质粒。
2. 质粒构建:将重组质粒导入到宿主菌中,通过细菌培养和质粒提取等步骤,得到含有目标基因的质粒。
3. 转化:将质粒导入到目标菌株中,使其拥有目标基因。
转化方法有多种,如电穿孔法、化学法和冷冻复苏法等。
4. 筛选:利用适当的筛选标记,如抗生素抗性基因,筛选出带有目标基因的转化菌株。
同时,可以利用聚合酶链式反应(PCR)技术对转化菌株进行检测和确认。
二、基因工程菌的应用与流程基因工程菌在生物技术领域有着广泛的应用,涉及到药物生产、生物燃料生产、环境修复等多个领域。
1. 药物生产:基因工程菌可以被用于合成药物原料。
通过引入相应的基因,使宿主菌株具备合成目标化合物的能力。
例如,利用基因工程菌可以合成抗生素、抗癌药物等。
2. 生物燃料生产:基因工程菌可以通过代谢途径的改造,使其能够高效地合成生物燃料。
例如,利用基因工程菌可以将废弃物转化为乙醇、丁醇等可燃烧的化合物。
3. 环境修复:基因工程菌可以被用于环境修复,以清除有毒或有害物质。
通过引入特定的基因,使基因工程菌具备降解有害物质的能力。
例如,利用基因工程菌可以降解石油污染物、农药等。
基因工程菌的应用流程一般包括以下几个步骤:1. 基因选择:根据目标产物的要求,选择合适的基因进行克隆。
2. 基因克隆:将目标基因克隆到适当的载体上,构建重组质粒。
3. 转化:将重组质粒导入到宿主菌中,使其拥有目标基因。
基因工程菌构建流程1. 目标基因的获取- 哎呀呀,这就像是在一个巨大的基因宝库中寻宝一样!比如说,我们想要构建一个能生产某种特殊蛋白质的基因工程菌,那首先得找到编码这个蛋白质的基因呀。
就好比你要找一本特定的书,你得先知道它叫啥名字,然后去书架上把它找出来!可以通过从生物基因组中提取,或者人工合成等方法来得到这个目标基因呢。
2. 载体的选择- 嘿,这载体就像是一辆小货车,得选个合适的呀!它要能把我们的目标基因安全地运送到目的地呢。
常见的载体有质粒呀等等。
就像你要运一个宝贝,得找个结实又合适的箱子来装它,不能太大也不能太小,还得保证在运输过程中不会损坏宝贝,对吧?比如我们选一个能在细菌中稳定存在的质粒来当这个“小货车”。
3. 基因与载体的连接- 哇哦,这一步可重要啦!就好像把宝贝装进箱子后,还得把箱子封好呀。
我们要把目标基因和载体连接起来,形成一个重组载体。
这就好比把钥匙插进锁孔里,得严丝合缝才行呢。
比如用特定的酶把基因和载体切好,再通过化学反应让它们连接在一起,形成一个稳定的整体。
4. 将重组载体导入受体细胞- 哈哈,这就像是把装着宝贝的箱子送到目的地一样!我们要把重组载体导入到受体细胞中,让它在里面发挥作用。
可以用一些方法,像转化呀、转染呀等等。
就好像你要把一个礼物送给别人,你得想办法让它到达那个人手里呀。
比如说用氯化钙处理细菌,让细菌更容易接受重组载体。
5. 筛选含有重组载体的受体细胞- 哟呵,这可不能马虎呀!我们得从一堆细胞中找出那些成功接收了我们的重组载体的细胞呢。
这就像在一堆苹果中找出那个最红最大的一样。
可以通过一些标记呀、抗性呀等等来筛选。
比如说我们的载体上带有一个抗生素抗性基因,那能在含有这种抗生素的培养基上生长的细胞,很可能就是我们要找的含有重组载体的细胞啦。
6. 培养和鉴定基因工程菌- 哈哈,最后一步啦!我们要把筛选出来的细胞培养起来,让它们大量繁殖,成为我们的基因工程菌。
还要对它们进行鉴定,看看是不是真的符合我们的要求呢。
SHMT基因工程菌的构建第四组一、实验相关知识1、丝氨酸羟甲基转移酶是丝氨酸合成中的关键酶,能催化甘氨酸和丝氨酸的相互转化,具体的催化反应如下:SHMT甘氨酸+N5,N10-亚甲基四氢叶酸L-丝氨酸+四氢叶酸在丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)作用下,甘氨酸同亚甲基四氢叶酸反应生成L-丝氨酸。
该反应需要5-磷酸吡哆醛作为辅酶。
N5,N10-亚甲基四氢叶酸上亚甲基可以来自于甘氨酸、甲醛、甲酸、蛋氨酸、胆碱和肌氨酸,它们同四氢叶酸反应生成N5,N10-亚甲基四氢叶酸。
本实验以甘氨酸和甲醇为前体物发酵生产L-丝氨酸时,菌体积累L-丝氨酸与菌体含有的SHMT的活性直接相关,但由于SHMT的催化作用理论上是双向的,有必要了解在相同的培养条件或者在本文所用的菌株SHMT是否具有双向催化作用。
2、基因工程(genetic engineering)又称基因拼接技术和DNA重组技术,是以分子遗传学为理论基础,以分子生物学和微生物学的现代法为手段,将不同来源的基因按预先设计的蓝图,在体外构建杂种DNA分子,然后导入活细胞,以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。
基因工程是生物工程的一个重要分支,它和细胞工程、酶工程、蛋白质工程和微生物工程共同组成了生物工程。
所谓基因工程是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术。
它是用人为的法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中,以让外源物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从而获得新物种的一种崭新技术。
它克服了远缘杂交的不亲和障碍。
3、丝氨酸是一种非必需氨基酸,它在脂肪和脂肪酸的新代及肌肉的生长中发挥着作用,因为它有助于免疫血球素和抗体的产生,维持健康的免疫系统也需要丝氨酸。
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基因工程菌构建的方法和步骤1. 了解基因工程菌嘿,伙计们,今天我们要聊聊“基因工程菌”这个话题,别担心,我不会用什么高深的术语把你绕晕。
我们先来把概念捋一捋。
基因工程菌,简单来说,就是把外来的基因“送”进某种细菌的体内,让这些细菌变成小小的生物工厂,生产我们需要的物质。
就像你在厨房里加点调料,能把菜肴的味道改变一样。
基因工程菌的目的是通过这种“改造”,让细菌能够合成有用的蛋白质、酶或者其他的化学物质。
这样一来,它们就能帮助我们解决各种问题,比如生产药物、清理污染或者改良作物。
2. 构建基因工程菌的步骤要构建基因工程菌,我们得经过几个步骤,哎呀,这可不简单,但也不至于让人望而却步。
接下来,我就给你细细道来,千万别走神哦!2.1 选择目标基因首先,我们得决定要插入哪个基因。
这个基因可以来自其他生物,比如植物、动物,甚至是其他细菌。
想象一下,你要给你的微型生物工厂添加一项新技能,就像给它升级一个新功能。
这一步就像是挑选你最喜欢的配料,关键在于找出最适合你需求的那个基因。
2.2 构建载体接下来,我们要搞个“载体”,也就是用来运输目标基因的工具。
可以把它想象成快递公司,我们的目标基因就像包裹,载体就是快递员。
常见的载体有质粒(就是一种小小的DNA环)或病毒载体。
载体的选择,基本上是看你的目标基因是小巧玲珑还是“大块头”,当然也要看它的安全性和有效性。
2.3 转化细菌现在,咱们得把装载着目标基因的载体“送”进细菌里。
这一步就像把新员工介绍给公司的老员工,确保他们能顺利融入团队。
我们用的技术有几种,比如化学转化、热激转化和电转化。
每种方法都有自己的“拿手绝活”,这时就得看情况选择最合适的了。
2.4 筛选和鉴定好了,目标基因成功送到细菌体内后,我们得确认它是否真的“安家”了。
这个步骤就像是检查你的新配方在实际操作中是否真的有效。
我们会用一些方法来筛选出那些成功转化的细菌,比如抗生素筛选、荧光标记等。
搞定这些之后,我们还需要用一些高大上的技术,如PCR、测序,来确认基因的确切位置和表达情况。
SHMT基因工程菌的构建方案SHMT(Serine Hydroxymethyltransferase)基因工程菌是一种被广泛应用于产酶及代谢工程研究中的工具菌。
SHMT基因工程菌可通过改造SHMT基因的表达水平来调控相关代谢途径,从而改变产物的合成效率和同时提高细胞代谢的稳定性。
SHMT基因在生物体内参与丝氨酸和甘氨酸代谢途径,并通过将甘氨酸脱羧生成对甘氨酸代谢途径至关重要的产物,同时还提供丝氨酸代谢途径的重要中间体。
因此,通过调控SHMT基因的表达水平,可以实现对这两条代谢途径的效率调控,并从而对相关代谢产物的产量和组成进行控制。
下面是一种基于大肠杆菌(Escherichia coli)作为宿主菌的SHMT基因工程菌构建方案:2.载体转化:将经过重组的表达载体转化到大肠杆菌的宿主菌中。
通过热激转化、电转化或化学转化等方法,将表达载体导入大肠杆菌宿主。
3.诱导表达和培养条件优化:在转化的大肠杆菌中,使用适合的培养条件,如培养基成分、培养温度、培养时间等,使得SHMT基因被表达出来。
同时,可以使用合适的诱导剂(如异丙基β-D-硫代半乳糖苷)来调控SHMT基因的表达水平。
4.代谢途径调控:通过对SHMT基因工程菌的代谢途径进行调控,可以实现对相关代谢产物的合成效率的调节。
例如,可以通过调控SHMT基因表达水平,使其在丝氨酸和甘氨酸代谢途径中的作用强弱发生变化,从而调控相关代谢产物的产量。
5.代谢产物分析和评估:通过适用的分析方法,如高效液相色谱法(HPLC)或气相色谱法(GC),对SHMT基因工程菌中的代谢产物进行检测和定量。
此外,也可以通过测定菌体生长曲线、测量酶活性等方法对SHMT基因工程菌的代谢特性进行评估。
总结起来,SHMT基因工程菌的构建主要包括基因克隆、载体转化、诱导表达和培养条件优化、代谢途径调控以及代谢产物分析和评估等步骤。
通过改变SHMT基因的表达水平,可以实现对丝氨酸和甘氨酸代谢途径的调控,从而调节相关代谢产物的产量和组成,实现对细胞代谢的调控。
基因工程菌构建的方法和步骤基因工程菌,听起来是不是像科幻电影里那些高科技生物?别急,咱们先从“基因”开始说起。
基因就像是DNA的密码,而工程菌呢,就是那些能读懂这些密码、把信息变成实际成果的小精灵。
想象一下,你是一位科学家,手里有一堆神秘的DNA序列,想要把它们变成有用的蛋白,这不就是一场神奇的旅程吗?你得有个好伙伴——那就是你的工程菌。
选一个合适的菌种吧,就像挑一个合适的朋友一样重要。
有的菌种擅长生产抗生素,有的则擅长合成维生素,还有的能把废物变黄金。
选对菌种,就像找到了宝藏,接下来就是搭建实验室了。
实验室里得有个小舞台,让菌子们尽情表演。
你得准备好培养基,这可是微生物的“饭”,得营养均衡才能长得壮。
还得给它们准备个舒适的家——摇床或者恒温箱,让它们在最适宜的温度下安家落户。
别忘了,还得时不时来点“表演”的观众——显微镜和各种检测工具,看看它们长成什么样,有没有出错。
接下来是最关键的一步:将DNA序列注入到工程菌中。
这个过程就像把一段段代码输入电脑,让它们变成可以执行的程序。
记得要慢慢来,别急,就像我们慢慢学走路一样,一步步来,才不会摔倒。
当看到那些小小的菌子们在显微镜下闪闪发光,就知道成功了。
不过,别急着庆祝,还得继续观察它们的“表演”。
看看它们是否按照预期工作,有没有出现什么“小插曲”。
如果有问题,就像遇到了一个小麻烦,需要耐心解决。
把这些有趣的小家伙们送到市场上去,让更多的人知道它们的价值。
就像我们的产品经过测试后上市一样,让更多人享受到科技带来的便利。
这就是构建基因工程菌的全过程,虽然听起来有点复杂,但每一步都是那么有趣。
就像我们小时候玩积木一样,虽然一开始会弄得一团糟,但最终能看到自己的作品,那种成就感真是无法言喻。
所以,下次当你看到那些小小的生物时,不妨想想自己在这个过程中扮演的角色,也许你会发现更多的乐趣呢!。
SHMT基因工程菌的构建第四组一、实验相关知识1、丝氨酸羟甲基转移酶是丝氨酸合成中的关键酶,能催化甘氨酸和丝氨酸的相互转化,具体的催化反应如下:SHMT甘氨酸+N5,N10-亚甲基四氢叶酸L-丝氨酸+四氢叶酸在丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)作用下,甘氨酸同亚甲基四氢叶酸反应生成L-丝氨酸。
该反应需要5-磷酸吡哆醛作为辅酶。
N5,N10-亚甲基四氢叶酸上亚甲基可以来自于甘氨酸、甲醛、甲酸、蛋氨酸、胆碱和肌氨酸,它们同四氢叶酸反应生成N5,N10-亚甲基四氢叶酸。
本实验以甘氨酸和甲醇为前体物发酵生产L-丝氨酸时,菌体积累L-丝氨酸与菌体含有的SHMT的活性直接相关,但由于SHMT的催化作用理论上是双向的,有必要了解在相同的培养条件或者在本文所用的菌株SHMT是否具有双向催化作用。
2、基因工程(genetic engineering)又称基因拼接技术和DNA重组技术,是以分子遗传学为理论基础,以分子生物学和微生物学的现代方法为手段,将不同来源的基因按预先设计的蓝图,在体外构建杂种DNA分子,然后导入活细胞,以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。
基因工程是生物工程的一个重要分支,它和细胞工程、酶工程、蛋白质工程和微生物工程共同组成了生物工程。
所谓基因工程是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术。
它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中,以让外源物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从而获得新物种的一种崭新技术。
它克服了远缘杂交的不亲和障碍。
3、丝氨酸是一种非必需氨基酸,它在脂肪和脂肪酸的新代谢及肌肉的生长中发挥着作用,因为它有助于免疫血球素和抗体的产生,维持健康的免疫系统也需要丝氨酸。
SHMT基因工程菌的构建
第四组
一、实验相关知识
1、丝氨酸羟甲基转移酶是丝氨酸合成中的关键酶,能催化甘氨酸和丝氨酸的相互转化,具体的催化反应如下:
SHMT
甘氨酸+N5,N10-亚甲基四氢叶酸L-丝氨酸+四氢叶酸
在丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)作用下,甘氨酸同亚甲基四氢叶酸反应生成L-丝氨酸。
该反应需要5-磷酸吡哆醛作为辅酶。
N5,N10-亚甲基四氢叶酸上亚甲基可以来自于甘氨酸、甲醛、甲酸、蛋氨酸、胆碱和肌氨酸,它们同四氢叶酸反应生成N5,N10-亚甲基四氢叶酸。
本实验以甘氨酸和甲醇为前体物发酵生产L-丝氨酸时,菌体积累L-丝氨酸与菌体含有的SHMT的活性直接相关,但由于SHMT的催化作用理论上是双向的,有必要了解在相同的培养条件或者在本文所用的菌株SHMT是否具有双向催化作用。
2、基因工程(genetic engineering)又称基因拼接技术和DNA重组技术,是以分子遗传学为理论基础,以分子生物学和微生物学的现代方法为手段,将不同来源的基因按预先设计的蓝图,在体外构建杂种DNA分子,然后导入活细胞,以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。
基因工程是生物工程的一个重要分支,它和细胞工程、酶工程、蛋白质工程和微生物工程共同组成了生物工程。
所谓基因工程是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术。
它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中,以让外源物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从而获得新物种的一种崭新技术。
它克服了远缘杂交的不亲和障碍。
3、丝氨酸是一种非必需氨基酸,它在脂肪和脂肪酸的新代谢及肌肉的生长中发挥着作用,因为它有助于免疫血球素和抗体的产生,维持健康的免疫系统也需要丝氨酸。
丝氨酸在细胞膜的制造加工、肌肉组织和包围神经细胞的鞘的合成中都发挥着作用。
[大肠杆菌] 细菌染色体DNA 的制备(预习方案)一.实训目的
.学习并掌握细菌基因组的基本知识和提取方法
二.实训原理及相关知识
1.大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)革兰氏阴性短杆菌,大小
0.5×1~3微米。
周身鞭毛,能运动,无芽孢。
能发酵多种糖
类产酸、产气,是人和动物肠道中的正常栖居菌,婴儿出生后
即随哺乳进入肠道,与人终身相伴,几占粪便干重的1/3。
国
家规定,每升饮用水肠杆菌数不应超过3个大肠杆菌的抗原成
分复杂,可分为菌体抗原(O)、鞭毛抗原(H)和表面抗原(K),后者有抗机体吞噬和抗补体的能力。
2.大肠杆菌常引起流行性婴儿腹泄和成人肋膜炎等等。
侵入人体
一些部位时,可引起感染,如腹膜炎、胆囊炎、膀胱炎及腹泻等。
人在感染大肠杆菌后的症状为胃痛、呕吐、腹泻和发热。
感染可能是致命性的,尤其是对孩子及老人。
3.大肠杆菌是细菌,属于原核生物;具有由肽聚糖组成的细胞壁,
只含有核糖体简单的细胞器,没有细胞核有拟核;细胞质中的质粒常用作基因工程中的运载体。
大肠杆菌的代谢类型是异养兼性厌氧型。
4.大肠杆菌在生物技术中的应用:大肠杆菌作为外源基因表达的
宿主,遗传背景清楚,技术操作简单,培养条件简单,大规模发酵经济,倍受遗传工程专家的重视。
目前大肠杆菌是应用最广泛,最成功的表达体系,常做高效表达的首选体系。
5.核酸:
6.
7.基因组是指细胞或生物体中,一套完整单倍体的遗传物质的总
和,或原核生物染色体、质粒、真核生物的单倍染色体组、细胞器、病毒中所含有的一整套基因。
8.[实训原理]提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含十
二烷基硫酸钠(SDS)和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质,再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质,得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。
SDS的作用机理是由于其能结合蛋白,中和蛋白的电性,使蛋白质的非共价键受到破坏,失去二级结构,从而变形失活,蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA(乙二胺四乙酸二钠)存在的情况下保持很高的活性。
在匀浆后提取DNA的反应体系中,SDS可通过失活蛋白破坏细胞膜、核膜,并使组织蛋白与DNA分离;而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸,使DNA分子完整地分离出来。
CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)是一种去污剂,可溶解细胞膜,它能与核酸形成复合物,在高盐溶液中((0.7 mol/L NaCl)是可溶的,当降低溶液盐浓度到一定程度(0.3 mol/L NaCl)时,从溶液中沉淀,通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白,多糖类物
质分开。
最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA,而CTAB溶于乙醇
或异丙醇而除去。
三.实训试剂
LB液体培养基,LB固体培养基,TE溶液,10%SDS,蛋白酶K,5mol/L NaCl,CTAB/NaCl溶液,酚/氯仿/异戊醇,异丙醇,70%乙醇
四.仪器设备
超净台、高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、恒温摇床、台式高速冷冻离心机、恒温水浴锅、循环水真空泵、电子天平、冰箱、精密pH试纸、微量移液器、离心管、试剂平、tip头、吸水纸、标签纸、记号笔等。
五.实训步骤
1.菌种培养
固体培养基:从活化的大肠杆菌斜面上挑取少量菌种,接种到
一只新鲜的LB固体平板上,倒置在恒温培养箱中,37度培养
16~18h。
液体培养基:从活化的大肠杆菌斜面上挑取少量菌种,接种到
一只装有5ml LB液体培养基的250ml三角瓶中,置于恒温摇床
中,37度振荡培养过夜。
2.试剂的配置
(1)、LB液体培养基:蛋白胨1.0g ,酵母膏0.5g ,NaCl1.0g ,加蒸馏水使之充分溶解,滴加5mol/ LNaOH调pH至7.0 ,
补足水分至100ml,121度高压蒸汽灭菌20min,冷却待用。
(2)、LB固体培养基:蛋白胨1.0g ,酵母膏0.5g ,NaCl1.0g ,加蒸馏水使之充分溶解,再加琼脂粉1.5g ,加热融化,补足水分至100ml,调pH至7.0 ,121度高压蒸汽灭菌20min,冷却待用。
(3)TE溶液:实验室所用的TE缓冲液是终浓度分别为10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)和1mmol/L EDTA(Ph8.0)的混合液。
(4)10%SDS:称取10.0g SDS 慢慢转移到约含80ml水的烧杯中,用磁力搅拌器或加热至68度助溶,搅拌至完全溶解,用水定容至100ml 。
(5)蛋白酶K:将200mg蛋白酶K加入到8.0ml无菌双蒸水中,轻轻摇动,直至蛋白酶K完全溶解。
不要漩涡混合,加水定容到10ml,不需灭菌分装成小分,储存于-20度。
(6)5mol/L NaCl:在80ml蒸馏水中溶解29.22g NaCl,加水定容至100ml,分装后高压灭菌。
(7)CTAB/NaCl溶液:称取4.1g NaCl溶解于80ml蒸馏水中,缓慢加入10g CTAB ,可加热至65度溶解,定容至100mL。
(8)酚/氯仿/异戊醇(25:24:1):按1:1的比例混合用Tris 饱和的酚与氯仿/异戊醇(24:1)。
(9)其他试剂:异丙醇,70%乙醇等。
3.制备细菌基因组
(1)菌体收集:将2mL培养至对数期的大肠杆菌DH5α菌
液5000rpm冷冻离心10min弃上清;
(2)加190μL TE悬浮沉淀,并加10μL 10%SDS,1μL 20mg/mL蛋白酶K,混匀,37℃保温1h;
(3)加30μL 5mol/L NaCl,混匀;
(4)加30μL CTAB/NaCl溶液,混匀,65℃保温20min;
(5)加入300μL酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)抽提,5000rpm 离心10min,将上清液移至干净离心管;
(6)加入300μL氯仿/异戊醇(24:1)抽提,取上清液移至干净管中;
(7)加300μL异丙醇,颠倒混合,室温下静止10min,沉淀DNA;
(8)5000rpm离心10min,沉淀DNA,加入500μL70%乙醇,5000rpm离心10min,弃乙醇,吸干;
(9)溶解于20μLTE,取3μL 用于琼脂糖凝胶电泳验证,其余-20℃保存。
六、实训注意事项
1.称量时严防试剂混杂,一把牛角匙用于一种试剂(或称取一种试剂后,洗净、擦干,再称取另一种试剂。
)瓶盖不要盖错,及时贴上标签。
2. 酚腐蚀性很强,并可引起严重灼伤,操作时应戴手套及防护镜,穿防护服。
所有操作应在化学通风橱中进行。
与酚接触过的皮肤应立即用大量的水清洗,忌用乙醇。
3.SDS的微细晶粒易扩,因此称量时要带面罩,称量完毕后要清除残留在称量工作区和天平上的SDS。
10%的SDS溶液无需灭菌。
SDS 在低温下易析出结晶,用前微热,使其完全溶解。
4.染色体DNA分子量大,受热易变性,复性困难,受剪切力作用容易断裂,所以操作时要注意避免。