实验九 植物遗传转化——农杆菌介导法
一、目的
了解农杆菌转化的机理；掌握农杆菌介导转化水稻的技术
二、原理
根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)具有跨界转移DNA的能力。下列因子与转化过程有关：
1. Ti 质粒 (tumor-inducing plasmid)上的T-DNA (transferred DNA)
T-DNA是农杆菌Ti质粒上能够转移到植物基因组的一段DNA序列。T-DNA含有RB和
LB两个边界，它们是25bp的正向重复序列，是T-DNA 转移的顺式作用元件。不同类型的农杆菌其边界序列有所不同，但划线部分为完全保守序列。置于该边界内的任何外源基因均可被转化。LB缺失突变后农杆菌仍能致瘤，但RB缺失会导致致瘤能力丧失，这时几乎完全没有T-DNA的转移。
LB（－链）5’GTTTACACCACAATATATCCTGCCA 3’
RB（＋链）5’TGACAGGATATATTGGCGGGTAAAC 3’
2. Ti质粒上的Vir区（virulence region）操纵子
转化所必需的基因有virA、B、C、D、E、G。其中蛋白VirD1/D2识别T-DNA边界RB和LB；VirC识别T-DNA右边界的超驱增强子；VirD2在T-DNA底链起内切酶作用造成切刻，并与T－链 5’ 共价结合，带有1个核定位信号NLS；VirB形成转移复合通道；VirE2为单链DNA结合蛋白，有2个NLS。该操纵子的表达顺序如下：
virA和virG组成型表达形成VirA和VirG蛋白 →VirA被植物创伤信号分子激活→激活的VirA使VirG激活 →激活的VirG 诱导virC、D、E、B、F、H表达。
3. 农杆菌染色体基因组相关基因：chvA、chvB（农杆菌运动、附着）、chvD、chvE（编码单糖结合蛋白、趋化性）、pscA、att、cel（合成纤维素丝，附着）。它们与农杆菌的趋化性和识别附着植物细胞有关。
农杆菌转化法操作流程
下载温馨提示：该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。本文下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用。
并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!
Downloaded tips: This document is carefully compiled by the
editor. I hope that after you download them, they can help you
solve practical problems. The documents can be customized and
modified after downloading, please adjust and use it according to
actual needs, thank you!
In addition, our shop provides you with various types of
practical materials, such as educational essays, diary
appreciation, sentence excerpts, ancient poems, classic articles,
topic composition, work summary, word parsing, copy excerpts,
other materials and so on, want to know different data formats and
writing methods, please pay attention!
在现代生物技术领域，农杆菌转化法是一项广泛应用的重要技术，它被用于将外源基因导入到植物细胞中，从而实现对植物基因组的改良和调控。本文将系统介绍农杆菌转化法的操作流程，以帮助读者全面了解该技术的原理和步骤。
农杆菌介导的水稻转化
实验目的
学习农杆菌介导的将目的基因导入水稻的方法。
实验原理
随着分子生物学的发展，越来越多的参与植物抗病有关的基因被分离出来，如防卫反应有关的基因、参与抗病信号传导的基因，参与对病原物识别的基因等，要鉴定这些基因在植物抗病性中的作用和地位，就要构建转化植物的双元载体如超量表达、反义和RNA干涉的双元载体转化植物，来明确该基因在植物抗病中的作用。
水稻上常用的遗传转化方法分为DNA直接导入法和农杆菌介导的转化法。DNA直接导入法主要包括PEG（polyethylene glycol）介导的转化法、电击转化法、基因枪转化法和花粉管通道转化法。其中PEG法、电穿孔法以原生质体为受体，由于对原生质体再生的依赖而在应用上受到很大限制。基因枪法优点是受体广泛，不受寄主范围的限制，转化率较高，但和其它DNA直接导入法一样存在共同的缺点：外源DNA的整合方式复杂，常常是多拷贝插入，较易出现转基因沉默现象，转化的外源基因片断不能太大（上限是16-20kb），转入基因的分离有时呈非孟德尔遗传等。同DNA直接导入法相比，农杆菌介导的转化法不需要原生质体的培养，简便易行，能有效地转入较大的外源DNA片断；转化效率高，转化的外源基因整合位点比较稳定（一般在T-DNA 25bp处与植物基因组整合），整合的外源基因基本上保持其结构的完整性；整合的外源基因多为单拷贝或低拷贝；整合的外源基因在转基因植株中的显性表达率较高，共抑制现象相对较少；转入的外源基因通常以孟德尔遗传规律遗传。所以已成为转化单子叶植物的首选方法。
一、目标基因对农杆菌的转化
1.1农杆菌感受态细胞的制备
1. 取-70℃保存的农杆菌EHA105于含50μg/ml利福平YM平板划线，28℃黑暗培养。
2. 挑取单菌落接种于5ml YM液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16小时。
3. 取2ml菌液转接于100ml YM液体培养基中，28℃，220rpm振荡培养至OD600=0.5。
农杆菌转化法的过程
农杆菌转化法（Agrobacterium-mediated transformation）是一种广泛应用于农业科学和生物技术研究的基因转化方法。该方法利用一种土壤细菌，农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）将外源基因转移到植物细胞中。农杆菌转化法具有转化效率高、适用广泛、转基因稳定等优点，已被广泛应用于农作物和果树的遗传改良、抗病抗虫育种等领域。
1.细胞培养
首先，需要从植物中获得要进行基因转化的组织细胞（通常是幼苗的果荚或子叶）。这些组织细胞被培养在含有植物生长激素的富营养培养基中，使其加速分裂和生长。
2.农杆菌培养
将农杆菌菌株（通常是含有外源基因的农杆菌株）培养在液体培养基中。培养基中含有特定的营养物质和抗生素，以促进菌株的生长和维持菌株稳定。
3.动态系统
将培养好的植物细胞和农杆菌菌液混合，形成动态系统。混合液中的植物组织和农杆菌菌株会发生暂时性的融合并进入植物细胞。
4.感染阶段
通过共培养或注射等方式，使动态系统中的农杆菌菌株进入植物细胞。农杆菌会通过特定的受体识别和感染植物细胞。
5.DNA传递 一旦农杆菌菌株感染了植物细胞，它会将其含有外源基因的DNA片段传递给植物细胞。这个DNA片段通常是携带目标基因和选择标记基因的载体。选择标记基因可以使得转化后的植物细胞在包含选择抗生素的培养基上存活。
6.培养和筛选
转化后的植物细胞被转移到含有选择抗生素的培养基中，使得只有携带外源基因的细胞可以生长和分裂。这样就可以筛选出带有目标基因的转化植物细胞。
7.植株再生
将筛选出的转化细胞培养到适当的大小和形态后，再将其转移到含有特定激素的培养基中，以促使其分化为整个植株。经过适当的培养和生长，就可以获得转基因植物。
总结来说，农杆菌转化法通过将植物细胞和农杆菌菌株进行共培养，使农杆菌将外源基因传递到植物细胞中，然后通过筛选和培养，最终获得转基因植物。这种方法在农业科学和生物技术研究中具有广泛的应用前景。
