农杆菌介导水稻快速转化-Bio-protocol

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811544214.X(22)申请日 2018.12.17(71)申请人 靖西市秀美边城农业科技有限公司地址 533800 广西壮族自治区百色市靖西县新靖镇城东路宾山一小区18号(72)发明人 谢宗宜　(74)专利代理机构 北京天奇智新知识产权代理有限公司 11340代理人 牙斐颖(51)Int.Cl.C12N 15/82(2006.01)A01H 5/00(2018.01)A01H 6/46(2018.01)(54)发明名称一种提高农杆菌介导的水稻遗传转化效率的方法(57)摘要本发明涉及一种植物转基因技术领域，特别涉及一种提高农杆菌介导的水稻遗传转化效率的方法。

通过超声波处理种子获得萌动种子、含目的基因农杆菌的培养、侵染种子与共培养、脱菌与选择培养和转基因植株分子检测的步骤，获得转基因植株。

使用本发明方法可有效缩短转基因转化的时间，同时提高农杆菌介导的水稻遗传转化的效率。

权利要求书1页 说明书7页CN 109536523 A 2019.03.29C N 109536523A1.一种提高农杆菌介导的水稻遗传转化效率的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)种子的处理：水稻种子用清水浸泡12～16h后，捞出种子，放入浓度为0.1％～0.2％的高锰酸钾溶液中浸泡消毒20～30min，捞出种子，用无菌蒸馏水清洗2～3次，再用无菌滤纸吸干种子表面水分，将种子放入种子培养液中，于40℃～45℃下黑暗中超声波处理后，静置10～20min，捞出种子，放入40℃～45℃热水中浸泡6～10h，得到萌动种子；(2)农杆菌的培养：将含有目的基因的农杆菌单菌放入农杆菌培养液中，于25℃～30℃、220～280rmp下震荡培养，待OD 600至0.5～0.6时，于25℃～30℃、5000～6000rmp下离心10～20min后，弃上清液，得农杆菌悬浮液，将所述农杆菌悬浮液与等体积的甲液混均，配制成农杆菌侵染液；(3)侵染与共培养：用步骤(2)的农杆菌侵染液浸泡感染步骤(1)的萌动种子，捞出种子，用无菌滤纸将种子上的菌液吸干后，放在共培养液中，于25℃～30℃下共培养2～3d；(4)脱菌与选择培养：无菌双层纱布放入培养皿中，将步骤(3)共培养后的种子放在无菌纱布上，向纱布中倒入筛选培养液，使无菌纱布湿润，于人工气候箱25℃～30℃下培养6～8d，期间用筛选培养液浇湿纱布3～5次，筛选出能正常生根发芽的植株；(5)转基因植株分子检测：取步骤(4)植株的叶片，用CTAB法提取全基因组DNA，通过PCR 扩增和Southern杂交，检测目的基因片段是否成功导入植株。

农杆菌介导转化法的概述自从1983年转基因植物诞生以来，植物基因工程成为发展最快、应用潜力最大的生物技术领域之一。

植物转基因技术是指把从动物、植物或微生物中分离到的目的基因，通过各种方法转移到植物的基因组中，使之稳定遗传并赋予植物新的农艺性状，如抗虫、抗病、抗逆、高产、优质等。

[1]目前，应用于植物转基因较多的方法有基因枪轰击法和农杆菌介导法。

由于基因枪轰击的随机性，容易出现突变、丢失和引起基因沉默等不利于外源基因在宿主植物的稳定表达的缺点，而农杆菌介导法是一种天然的植物遗传转化系统,外源基因在转基因植物中的拷贝数低、遗传稳定，是最常用的转基因技术[2]。

农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化法在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。

本文对农杆菌介导转化法进行综述。

1 关于农杆菌农杆菌[3-5]是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性的感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。

与植物基因转化有关的有根瘤农杆菌和发根农杆菌这两种类型。

1.1根癌农杆菌根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)含有Ti质粒，能诱导被侵染的植物细胞形成肿瘤，即诱发冠瘿瘤；Ti质粒是农杆菌染色体外的遗传物质，为双链共价闭合环状DNA分子，大小约200-250kb。

依据Ti质粒诱导的植物细胞产生的冠瘿碱的种类不同，根癌农杆菌可分为4种类型：章鱼碱型（Octopine）、胭脂碱型（Nopaline）、农杆碱型（Agropine）和琥珀碱型（Succinamopine）。

原始的Ti质粒根据其功能的不同可分为4个区：1.1.1T-DNA区(Transfer—DNA region)：不同来源的菌株，T-DNA的长度在12~24 kb，它是在农杆菌侵染细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物基因组中的一段DNA，其携带的基因与肿瘤的形成有关，但与T-DNA本身的转移与整合无关．T-DNA上最重要的是T-DNA区两端的边界各为25 bp的重复序列．其中14 bp 是完全保守的，分10 bp(CAGGAATATAT)和4 bp(GTAA)不连续的2组．左右2个边界(LB和RB)是T—DNA转移所必需的，只要其存在，T-DNA可以将携带的任何基因转移并整合到植物基因组中，转移的方向是从右向左，T-DNA的右边界在T-DNA的整合中对于靶DNA位点的识别具有重要作用，因此，尤以右边界更为重要。

农杆菌介导的水稻转化一．愈伤组织的培养1.愈伤组织的诱导成熟水稻种子去壳，用70%酒精处理2min，无菌水冲洗2~3次，再用25%次氯酸钠消毒处理15min，无菌水冲洗5~6次，将种子转到灭菌的培养皿上，于超净工作台上吹干。

接种到诱导培养基N6AD2.5上，28℃暗培养至长出愈伤组织（10 d左右）。

2.继代培养用无菌镊子将愈伤组织转移到继代培养基N6AD2上，28℃暗培养10 d。

继代培养两次后待用。

二．农杆菌的转化及培养1. 取农杆菌LBA4404感受态细胞于冰上融化，并在冰上取50uL感受态细胞于电击杯中，加入2.5uL pHB质粒，冰浴30min，电击，向电击杯中加入800uL SOC 混匀，将混匀后的液体转移至1.5mL离心管中，28℃，200rpm，振荡培养2h，13000rpm离心5min，去掉大部分上清液，用200uL枪头吹打悬浮，涂板于YEP(Rif 50mg/L, Kan 50mg/L)固体培养基上，28℃培养至长出菌落。

2. 挑取单菌落于5mL YEP(Rif 50mg/L, Kan 50mg/L)液体培养基中，200rpm振荡培养过夜，取2mL过夜培养的菌液于100mL相同的YEP液体培养基中扩大培养至OD600=0.5，5000rpm离心5min收集细胞，用N6A CO液体培养基重悬。

三．浸染与共培养1.选择生长状态良好的愈伤组织，用无菌镊子将其适当夹小，创造伤口，然后放在无菌烧杯中用菌液浸泡，一般浸染时间为10~30min，浸染时要不是摇动。

2.倒掉菌液，将愈伤组织放在无菌滤纸上吸去多余菌液。

3.将吸干菌液的愈伤组织置于铺有一层无菌滤纸的N6A CO固体培养基上，26℃暗培养2~3天，直至愈伤组织上出现少量菌斑为止。

四．脱菌与筛选1.共培养的愈伤组织放在广口瓶中，用无菌水清洗至清澈；2.浸泡于含500mg/L Cef 的N6A CO液体培养基中，在摇床上中速振荡30~60min；3.弃液，将愈伤组织用无菌滤纸吸干或放在超净工作台上吹干后接放在一筛培养基上，26℃暗培养3周，再转入二筛培养基上26℃暗培养3周。

农杆菌介导的高效水稻遗传转化体系的研究A Highly Efficient Agrobacterium - mediated Rice Transformation Method水稻是基因组研究的模式植物 ,近年来水稻基因组研究取得了很大进展 ,构建了遗传图谱和物理图谱 ,完成了籼稻和粳稻的全基因组草图测2 - 3序 ,以及第 1 号和第 4 号染色体的精细测4 - 5序 ,并对第 10 号染色体的结构进行了详细分析。

在此基础上 ,各实验室大规模地 ,系统地进行水稻功能基因研究 ,普遍采用的研究手段是基因标签技术。

基因标签技术包括 T - DNA 和转座子标签 ,创建大量的基因标签体是功能基因研究的材料平台。

而根癌农杆菌介导的水稻遗传转化是水稻基因标签技术中的重要步骤之一。

本研究完善了根癌农杆菌介导的水稻转化方法 ,以期为水稻功能基因研究提供丰富材料 , 为水稻重要农艺性状的改良开辟途径。

1材料以水稻品种日本晴(Oryza sativa L. ssp.japonica)为试验材料。

菌株类型为 EHA105 超毒力菌株 ,载体为增强子捕获载体 pFX- E24. 2 - 15R(见图 1) ,载体上带有 GUS报告基因、35 S的 CaMV 启动子序列和潮霉素选择标记基因(HYG) 。

农杆菌菌株为EHA105。

2方法2.1水稻愈伤组织的诱导诱导方法参照 HIEI7等。

将日本晴水稻种子去壳 ,用 75 %乙醇灭菌 5min ,再用2. 5 %的次氯酸钠灭菌处理不同时间(40min ,37 min ,30 min 和 25 min) ,以确定最佳灭菌时间 ,灭菌后用无菌水冲洗 6～8 次 ,于 MS 固体培养基上28 ℃避光培养 ,30 d 后 ,将愈伤组织进行继代培养 ,得到胚性愈伤组织。

2.2农杆菌转化愈伤组织用 AB 固体培养基+氯霉素 25 mg/L + 利福平 20 mg/L + AS 20 mg/L培养农杆菌 ,在20 ℃下培养5～6 d。

农杆菌介导的水稻转化实验目的学习农杆菌介导的将目的基因导入水稻的方法。

实验原理随着分子生物学的发展，越来越多的参与植物抗病有关的基因被分离出来，如防卫反应有关的基因、参与抗病信号传导的基因，参与对病原物识别的基因等，要鉴定这些基因在植物抗病性中的作用和地位，就要构建转化植物的双元载体如超量表达、反义和RNA干涉的双元载体转化植物，来明确该基因在植物抗病中的作用。

水稻上常用的遗传转化方法分为DNA直接导入法和农杆菌介导的转化法。

DNA直接导入法主要包括PEG（polyethylene glycol）介导的转化法、电击转化法、基因枪转化法和花粉管通道转化法。

其中PEG法、电穿孔法以原生质体为受体，由于对原生质体再生的依赖而在应用上受到很大限制。

基因枪法优点是受体广泛，不受寄主范围的限制，转化率较高，但和其它DNA直接导入法一样存在共同的缺点：外源DNA的整合方式复杂，常常是多拷贝插入，较易出现转基因沉默现象，转化的外源基因片断不能太大（上限是16-20kb），转入基因的分离有时呈非孟德尔遗传等。

同DNA直接导入法相比，农杆菌介导的转化法不需要原生质体的培养，简便易行，能有效地转入较大的外源DNA片断；转化效率高，转化的外源基因整合位点比较稳定（一般在T-DNA 25bp处与植物基因组整合），整合的外源基因基本上保持其结构的完整性；整合的外源基因多为单拷贝或低拷贝；整合的外源基因在转基因植株中的显性表达率较高，共抑制现象相对较少；转入的外源基因通常以孟德尔遗传规律遗传。

所以已成为转化单子叶植物的首选方法。

一、目标基因对农杆菌的转化1.1农杆菌感受态细胞的制备1.取-70℃保存的农杆菌EHA105于含50μg/ml利福平YM平板划线，28℃黑暗培养。

2.挑取单菌落接种于5ml YM液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16小时。

3.取2ml菌液转接于100ml YM液体培养基中，28℃，220rpm振荡培养至OD600=0.5。

水稻遗传转化体系ProtocolIntroduction1．水稻的遗传转化研究历史与现状20 世纪80年代末, 水稻的遗传转化首获成功。

1988 年, 3 个不同的研究小组以水稻原生质体为受体,采用“电击法”或“PEG 介导法”等方法将外源3]。

1991 年, 基因枪转化的方法在水稻中基因导入到水稻中并获得再生植株[1~获得成功[4],随后成为水稻遗传转化的常用方法之一。

1993 年，Chan 等人[5]首先采用农杆菌介导的方法获得了转基因水稻。

Hiei 等人[6]以水稻成熟种子诱导的愈伤为受体, 建立了农杆菌介导的粳稻高效转化体系, 使得农杆菌介导法逐渐成为了水稻转化最常用的方法。

此后, 粳稻的转化方法被进一步优化, 使粳稻的遗传转化周期大幅缩短[7]。

虽然Hiei等[6]建立的农杆菌介导的转化体系使得粳稻的转化不再困难, 但是许多籼稻的转化依然存在障碍, 主要是转化效率低下。

因此, 一些研究者对籼稻的转化体系进行了一些优化, 使得籼稻的转化效率得到了一定的提高[8,9]。

最近, Hiei 和Komari[10]发表了一个粳稻和籼稻均适用的农杆菌高效转化的方法.根据他们的结果, 采用幼胚作为外植体, 籼13 个稻的转化可以在两个半月内完成，且转化效率非常高(一个幼胚可以得到5~独立的转化植株)。

2. 转基因技术在水稻上的研究与应用[11]a. 转基因抗虫水稻对于水稻最主要的害虫——螟虫(二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟等)在水稻中尚未发现有效的抗性种质资源. 目前,最有希望和前途的方法就是利用转基因技术把外源抗虫基因引入水稻中创造出新的抗虫品种。

虽然水稻中已经发现和鉴定了19 个抗褐飞虱的基因[12], 但是由于褐飞虱有多个生物型且易产生变异, 抗性品种往往推广数年后就会失去抗性。

b. 转基因抗病水稻见抗水稻病毒研究c. 转基因抗旱水稻d. 转基因营养高效利用水稻e. 转基因优质水稻f. 转基因高产水稻g. 转基因抗除草剂水稻3.转基因技术在水稻抗病毒基因工程上的应用随着RNA干扰技术（包括siRNA和miRNA介导的RNA干扰）在抗病毒18 ]，结合RNA干扰技术和水稻遗传转化技术基因工程上的广泛研究和应用[13~来研究水稻，获得对水稻病毒高抗的品系越来越受研究人员的重视，成为国内外水稻病毒研究的热点。