M0425.2185-ACTX1-T7菌液RAW:ELECT:从RA W看是双峰，展开图中看，不是套峰，像是碱移码（向前移），但有的碱基正常，如图中的绿色A碱基。
所以排除了引物降解。
初步判断是样品污染，只是另一套模板很少。
因持怀疑态度，而且结果不是很好，所以调整。
M0425.2225-KL8104-11-CHERRY-R菌液RAW:ELECT:从RA W看是前双峰，展开图看也是前双峰（从开端到251bp）考虑到是菌液样品，是用的自备引物，不知其引物结合位点，所以判M。
如用的是载体上的通用引物，双峰在150bp 之前，可判正常。
后宽峰（样品浓度高/仪器问题）甲基化现象掉C峰全双峰后双峰前双峰小片段丢失（前面无完整主峰，峰型杂乱）前双峰（前面有主峰，主峰下面有小套峰）中断菌液加测的峰图（菌液测序无终止峰，因其是一个环状的，如测到了终止，可能由于模板中存在结构）重复序列POLY钉子峰酒精峰无信号正常菌液样品中存在突变位点，如果是浓度高，导致的测序不准，展开图则有底峰很乱的样子？浓度高峰图正常PCR样品引物降解全双峰RAW看，前面有一个很高的峰，压低了后面的峰型，咋看像没信号，再看信号值挺高的，再看展开图，是套峰，所以判双峰。
小片段丢失（RAW前面拖得很长，后面出现的峰颜色浅淡，展开图峰型杂乱，没有主峰，再看QV值，没有可信的，可判无信号。
也可试调）后双峰（RAW图看是两个一模一样的的峰图一前一后，其实前面的峰才是想要的峰图，从展开图看，第一个A终止峰往前面是一个样品的峰图，可以看到从280bp处是后双峰，判后双峰即可。
至于其后的峰图，可能是在扩PCR时两个相同的片段连接在了一起，我们可以把第一个终止峰后的截掉）同一个菌液样品1500bp，分别用BGH和cmv_f测，cmv_f测序正常，BGH测序有POLY 结构，且有后双峰。
究竟后双峰是不是POLY引起的，要具体问题具体分析。
cmv_f测序正常RA W图mv_f测序正常展开图BGH测序，后双峰（POLY之后虽有移码但不影响序列读取，后双峰是从120bp开始的,可能是载体中插入了小片段，导致正反向引物（载体上的引物）测，一个方向正常，一个方向后双峰）BGH测序POLY结构导致后双峰（从POLY之后开始套峰）重复序列导致中断引物降解严重的引物降解(可能为引物污染)（RA W看基线不在一条直线上，有波动很大的钩钩，单个峰型不单一，整个像糊到一块。
一代测序常见问题及解决策略知识分享测序常见问题及解决策略一、PCR常见问题1.假阴性，不出现扩增条带PCR出现假阴性结果，可从以下几个方面来寻找原因：1）模板：①模板中有杂蛋白；②模板中有Taq酶抑制剂；③在提取制备模板时丢失过多；④模板核酸变性不彻底。
2）酶：酶失活或反应时忘了加酶。
3）Mg2+浓度：Mg2+浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
4）反应条件：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。
5）靶序列变异：靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
2.假阳性假阳性：出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
常见原因有：1）引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。
靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。
需重新设计引物。
2）靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。
这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。
可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。
3.出现非特异性扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。
非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。
二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。
