仔猪睾丸间质细胞的分离和培养

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小鼠睾丸支持细胞分离培养

小鼠睾丸支持细胞分离培养一、材料和器械：1、材料：小白鼠（18~ 20 日龄）1只2、配液：PBS 1L，高压灭菌细胞洗液：DMEM+双抗消化液：0 25% ( 质量分数) 胰蛋白酶，0 1%( 质量分数) 胶原酶细胞培养液：DMEM+10%FBS+双抗3、器械：镊子、手术剪、手术刀各3-4把，高压灭菌500mL烧杯2个，高压灭菌25 mL离心管、5 mL离心管各20个，高压灭菌酒精棉一瓶细胞培养皿若干冰块若干二、操作步骤：1、处死小鼠颈椎脱臼法处死；2、消毒置于含75% ( 体积分数) 乙醇平皿中浸泡2 min, 然后置于超净台上；3、取睾丸用中剪剪开下腹部皮肤, 眼科剪从下腹部附睾部剪断精索, 取出双侧睾丸, 放入含预冷细胞洗液的培养皿中；4、取实质修剪睾丸附带的精索。

剥除睾丸被膜, 将睾丸实质剪成约1 mm 1 mm 1 mm 碎块, 静置3~ 4 min；5、消化转入25mL 离心管中。

吸出上层细胞洗液, 每只睾丸加入1 5mL 37 预温的0 25% ( 质量分数) 胰蛋白酶，37 高速振荡消化15~ 20min, 直到残存的间质消化成粘液状, 可见成片断的曲细精管；6、终止消化加入入少许血清终止消化,；7、离心1000 r/ min离心5 min, 倾去上层胰酶。

加入DMEM/ F12 培养基重悬, 1000r/min 离心5min。

倾去上层培养液；8、再消化每只睾丸加入1 mL 37 预温的0 1%( 质量分数) 胶原酶, 37 低速缓慢振荡消化20~ 25min；9、铜网过滤取滤液800 r/ min 离心5min, 2 次去除胶原酶, 用培养液洗涤；10、接种往离心管加入细胞培养液5ml左右，吹打均匀，接种到两个30细胞培养皿中，补加培养液到培养皿1/3~1/2,培养皿标记显微观察后放入36CO2培养箱培养。

三、换液纯化，计数结果鉴定。

公牛间质细胞的分离培养与鉴定

公牛间质细胞的分离培养与鉴定首先呢，咱们得搞清楚这公牛间质细胞到底是个啥玩意儿。

想象一下，公牛的身体就像是一座复杂的大厦，里面住着各种各样的“居民”，而间质细胞就是其中比较特殊的一群。

它们就像是大厦里的维修工人和后勤保障人员，默默地为其他细胞创造一个良好的生活环境，还参与调节很多重要的生理功能呢。

那怎么把这些小家伙从公牛身体里“请”出来呢？这就涉及到分离的过程啦。

这可不是一件容易的事儿，就好比要从一堆五颜六色的珠子里挑出特定颜色的珠子一样，需要非常细心和耐心。

科学家们会运用各种巧妙的方法，就像是用一把神奇的小镊子，小心翼翼地把间质细胞从周围的细胞群中“揪”出来。

这个过程需要严格控制各种条件，温度、酸碱度什么的都得恰到好处，不然这些娇贵的小家伙可能就会发脾气，不给咱们好好配合啦。

分离出来之后，接下来就是培养它们啦。

这时候，间质细胞就像是一群刚离开家的小朋友，需要咱们给它们准备一个舒适的“新家”。

这个“新家”就是培养皿，里面装满了各种营养丰富的培养液，就像是为小朋友们准备的美味大餐，有蛋白质、维生素、矿物质等等，保证它们能茁壮成长。

而且，培养的环境也得精心调控，就像给小朋友们安排合适的房间温度和湿度一样，让它们能安心地在这个新环境里生活。

光培养还不够，咱们还得知道培养出来的到底是不是咱们想要的间质细胞呀，这就到了鉴定的环节。

这就好比是要给这些“小朋友”做个身份验证，看看它们是不是真的是间质细胞。

科学家们会运用各种高科技的“魔法工具”，比如显微镜、特殊的染色试剂等等。

通过显微镜，就像是给细胞们拍特写照片一样，能清楚地看到它们的形态结构是不是符合间质细胞的特征。

而染色试剂呢，就像是给细胞们穿上了有特殊标记的衣服，根据它们对试剂的反应，就能更加准确地判断它们的身份啦。

猪胰腺干细胞分离与培养

猪胰腺干细胞分离与培养王赟;窦忠英;乔海;赵婷;杨春荣【期刊名称】《中国农业科学》【年(卷),期】2008(041)008【摘要】[目的]探寻一种简单的胰腺干细胞的分离方法,以便为糖尿病的细胞治疗研究提供丰富的种子细胞.[方法]采用胰酶消化法分离获得细胞,利用仅含有5%的血清的RPMI 1640培养基培养细胞,低浓度的血清使得细胞大量死亡漂浮,只留下少数贴壁的小圆细胞.而后将血清浓度提高到15%以上继续培养;采用免疫组化方法对获得的细胞是否具有胰腺干细胞特征予以检测,并测定了细胞的生长曲线.[结果]在血清浓度提高后每个小圆细胞能快速增殖并形成一个克隆,经过这样增殖后的细胞可以连续传代,目前已传至60代.经免疫组化检测,细胞表达PDX-1、GLUT-2、vimentin等胰腺干细胞的标志;细胞也表达Glucagon、insulin、somatostatin、polypeptide等胰腺内分泌细胞的标志.[结论]通过本方法获得的细胞经检测确定为胰腺干细胞,在体外可自发分化形成胰胰内分泌部4种主要细胞.【总页数】9页(P2554-2562)【作者】王赟;窦忠英;乔海;赵婷;杨春荣【作者单位】西北农林科技大学国家干细胞生物技术中心陕西分中心,陕西杨凌,712100;西北农林科技大学国家干细胞生物技术中心陕西分中心,陕西杨凌,712100;西北农林科技大学国家干细胞生物技术中心陕西分中心,陕西杨凌,712100;西北农林科技大学国家干细胞生物技术中心陕西分中心,陕西杨凌,712100;西北农林科技大学国家干细胞生物技术中心陕西分中心,陕西杨凌,712100【正文语种】中文【中图分类】S8【相关文献】1.胎猪胰岛源胰腺干细胞分离培养与诱导分化试验 [J], 冯若鹏;张慧茹;窦忠英2.小鼠胰腺干细胞的分离、培养与鉴定 [J], 李军;孙毅;马荣;李勇3.新生昆明小鼠胰腺干细胞体外分离、培养及自然分化的潜能 [J], 岑妍慧;何国珍;黄波;黄荣师;贾微;彭岳;玉光强4.新生大鼠胰腺干细胞的分离和培养及初步鉴定 [J], 张巨彪;苏秀兰;欧阳晓晖5.胎猪胰腺干细胞的分离与鉴定 [J], 王赟;赵婷;乔海;杨春荣;张翊华;王华岩;窦忠英因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

国家级动物科学实验教学示范中心建设项目

李勤凡
兽医临床诊断学实验实习指导编写
杨增歧
预防兽医学实习指导编写
靳亚平
临床兽医学实习指导编写
.实验室开放模式与制度的建立
序号
主持人
项目名称
苏利红
教学实验室开放运行与管理
王立新
水产科学实验室开放模式与管理办法的探索
耿果霞
教学、科研实验室共享运行管理模式的探索
宁蓬勃
动物疫病预防平台开放管理模式与制度的建立
龙明秀
牧草栽培学实验指导（双语）
高景慧
牧草种子学实验实习指导
王高学
水产动物病害学及疾病学实验实习指导
吉红
养殖水域生态学实验实习指导
周继术
鱼类增养殖学实习指导
赵慧英
动物解剖学实验实习指导编写
卿素珠
动物组织胚胎学实验指导编写
李新平
动物生理学实验指导编写
杨鸣崎
动物病理生理学实验指导编写
童德文
动物病理解剖学实验实习指导编写
临床兽医学实习改革
.本科实验教材、实习教材建设
序号
主持人
教材名称
田秀娥
动物繁殖学实验实习指导
雷初朝
蓝贤勇
动物遗传学实验指导
张建勤
顾玉兰
动物育种学实验指导
宋宇轩
家畜环境卫生学实验指导
牛竹叶
家畜生态学实验指导
王平
饲料分析实验指导
陈玉林
畜产品品质测定技术实验指导
刘福柱
禽生产学实习指导
杨朝霞
羊生产学实习指导
陈宏
动物遗传学实验教学改革
刘小林
动物育种学实验教学改革
龚月生
饲料分析实验、配合饲料及加工工艺实习教学改革

豚鼠前列腺Cajal间质细胞的分离、培养及其鉴定

豚鼠前列腺Cajal间质细胞的分离、培养及其鉴定李应龙;马路平;王江平;王勤章【期刊名称】《临床与实验病理学杂志》【年(卷),期】2016(32)8【摘要】目的探索豚鼠前列腺的Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal,ICCs)的原代分离、培养及鉴定方法.方法无菌条件下分离出前列腺组织,采用酶消化法分离细胞,将细胞悬液接种于含干细胞因子的DMEM培养基中进行培养.倒置显微镜下观察细胞贴壁和形态,用酪氨酸蛋白激酶受体c-Kit特异性抗体标记细胞,免疫荧光法鉴定.结果培养24 h后的细胞贴壁良好,可见胞体为梭形,有2个或多个突起.随着培养时间的增长,突起彼此相互连接形成网络结构.该类细胞c-Kit抗体荧光染色阳性.结论用酶消化法可成功分离和培养成年豚鼠前列腺ICCs,可用于前列腺ICCs 的电生理学研究.【总页数】3页(P911-913)【作者】李应龙;马路平;王江平;王勤章【作者单位】石河子大学医学院第一附属医院泌尿外科,石河子832008;华中科技大学同济医学院附属同济医院泌尿外科,武汉430000;石河子大学医学院第一附属医院泌尿外科,石河子832008;石河子大学医学院第一附属医院泌尿外科,石河子832008;石河子大学医学院第一附属医院泌尿外科,石河子832008【正文语种】中文【中图分类】R697.3;Q2-33【相关文献】1.豚鼠膀胱Cajal样间质细胞的分离、培养及其鉴定 [J], 王乾;王勤章;丁国富;李维仁;王文晓;王江平;李应龙2.成年SD大鼠胃窦Cajal间质细胞分离、培养及鉴定 [J], 张程程;彭艳;陈海交;杨建文;刘薇薇;刘丽3.体外培养豚鼠膀胱Cajal间质细胞的分离与鉴定 [J], 周逢海;迟强;王养民4.胆囊 Cajal 间质细胞的体外分离、培养与鉴定 [J], 谭宇彦;王晶敏;王栋;嵇振岭5.成年C57BL/6小鼠空肠Cajal间质细胞的分离、培养及鉴定 [J], 刘登群;龙爽;王军平;史春梦;冉新泽;粟永萍因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定

小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定摘要】目的分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。

方法采用贴壁培养法培养小鼠骨髓间充质干细胞，观察细胞的形态及生长特性，并应用流式细胞仪对细胞表面抗原CD34、CD45、CD29、CD44进行表型鉴定。

结果原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。

传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。

传至10代仍具有良好的增殖活性。

流式细胞仪检测第4代及第8代MSCs细胞均不表达CD34、CD45，但表达CD29、CD44，纯度分别为73.8% 、91.65%。

结论采用贴壁培养法可获得生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。

【关键词】骨髓间充质干细胞细胞培养流式细胞术表型鉴定【中图分类号】R392.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）01-0082-02间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）起源于中胚层，具有高度增殖和自我更新的能力，有向骨、软骨、脂肪、血管内皮细胞、神经星型胶质细胞等分化的潜能[1]，可分化成骨髓基质支持造血，并可分泌多种细胞因子促进造血干细胞增殖分化，同时它能抑制同种异体反应性T淋巴细胞，在同种异基因造血干细胞移植后的造血重建及免疫调节，预防移植物抗宿主病等方面有广阔的应用前景[2]，但骨髓间充质干细胞含量极低，仅占骨髓单个核细胞的0.001%-0.010%[3]，因此，培养出生长状态良好，足够数量的骨髓间充质干细胞是应用的前提。

1 材料和方法1.1 材料1.1.1 实验动物雄性，C57B L/6小鼠，清洁级，8周龄，体重18-20g，购于吴氏动物实验中心。

仔猪心肌细胞分离及培养方法研究

仔猪心肌细胞分离及培养方法研究
吴旭颖;郭亮
【期刊名称】《中国畜牧兽医》
【年(卷),期】2010(037)003
【摘要】为探讨仔猪心肌细胞的分离及培养方法,采用胶原酶Ⅳ型和胰酶同时消化心肌组织,用10%胎牛血清终止消化,并用100目细胞筛过滤后,1200 r/min离心沉淀细胞,再加入培养液重悬细胞.采用差速贴壁法纯化心肌细胞后置CO2培养箱孵育.结果显示,未贴壁时心肌细胞呈圆形,培养12～24 h心肌细胞开始贴壁生长,细胞伸出伪足呈梭形、多角形,3～4 d后形成细胞簇,5～7 d后细胞汇合成片.因此,同时使用胶原酶Ⅳ型和胰酶消化仔猪心肌可简便、快速地获得高活力的心肌细胞.【总页数】3页(P52-54)
【作者】吴旭颖;郭亮
【作者单位】天津农学院动物科学系,天津,300384;天津农学院动物科学系,天津,300384
【正文语种】中文
【中图分类】S816.79
【相关文献】
1.大鼠心肌细胞条件培养基对兔胚胎干细胞分离培养效果的影响 [J], 郭志林;王新庄;张涌;王木;王轶敏;胡文举
2.大鼠心肌条件培养基在昆明白小鼠胚胎干细胞分离培养中的效果 [J], 刘俊平;曹
鸿国;郑月茂;赵慧英;温叶飞;张涌
3.新生SD大鼠心肌细胞分离培养及纯化的快速便捷方法及鉴定 [J], 付微;刘飞;乔陆明;张绪东
4.适合膜片钳实验的心肌细胞分离方法研究 [J], 赵临;汪玲芳;尹永强;吴红;康毅;娄建石
5.原代SD仔鼠心肌成纤维细胞分离与培养方法的改进 [J], 张平;谭延振;张冰;赵荣;金振晓;易定华;孙阳;易蔚;李香敏
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猪小肠粘膜上皮细胞的分离及体外原代培养模型的建立

取生长良好的细胞，吸去培养液，用 PBS 洗细胞
3 次；80％冷丙酮固定 10 min，吸弃，PBS 洗 3 次；加入酶
a
反应基质液（2％巴比妥钠 1 ml、3％ β-甘油磷酸钠1 ml、
2％硝酸钙 2 ml、2％硫酸镁 1 ml、蒸馏水 5 ml,pH=9.2～
9.4）37 ℃反应 2 h,吸弃，PBS 洗 3 次；加入 2％硝酸钙
PBS 洗细胞 2 min×3 次；吸去多余的 PBST,加 50 μl 封闭液于孔中,37 ℃孵育 10 min；吸干液体, 并用 PBST 洗 2 min×3 次；每孔细胞加 100 μl 的一抗（鼠抗人角蛋白 8 单抗）,37 ℃温育 30 min；PBST 洗 2 min×3 次; 每孔加 50 μl 抗小鼠生物素二抗 ,37 ℃ 孵育 20 min; PBS 洗 2 min×3 次；每孔加 50 μl HRP 标记链亲和素， 37 ℃ 孵育 20 min；PBS 洗 2 min×3 次现用现配 DAB
疫酶联反应，以肌细胞作为阴性对照。具体操作步骤
b
如下：80%冷丙酮固定 10 min, 吸干多余的冷丙酮；用
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营养研究
职爱民等：猪小肠粘膜上皮细胞的分离及体外原代培养模型的建立
c
d 注：a. 肠绒毛，40 × ；b. 48 h 内贴壁的 IEC，100 × ；c. 正在生长的 IEC，100×；d. 铺路石样的 IEC，100×。
按照说明书配制 DMEM -F12 不完全培养基， 0.22 μm 过滤除菌，分装，4 ℃避光保存备用。 1 g Ⅱ型胶原酶干粉溶于 100 ml 上述配好的 DMEM-F12 不完

Cajal间质细胞的分离、培养方法探讨

我们发现给小鼠绝对禁食12h用含抗生素的d2hanks冲洗小肠以及严格的无菌操作都是保证细胞不受污染的关键国外学者在培养基中加入了少量青霉素链霉素和二性霉素以防止污染本实验在培养基中也加入了antibi2antibiotic以防止细胞污染我们在实验中发现一旦细胞污染光镜下细胞伸展贴壁功能丧失大部分细胞折光性降低进而发生固缩裂解以及死亡
%&’la()’*a*+,-l(-./’0)*(/.&()()al,/ll&’0Cajal"LiChun’u(,)*n+ ,(i-*n+,Liu./*hu/,0h/n+ Li/n1/n+,0h/n+ 2n3in+45(3/678(n7*9 :(n(6/;<u6+(61,5/3in+ =*>3i7/;,)hi6- ?i;i7/61 ?(-i@/;AniB(6>i71,*@5/:A./:%(((%’ " " (12&(.a,()"32j/,()4/"B5C.34D330@1E10@5C652.35-+0.5/+/C4D-0D2156./01230.0.+-41--356*+,+(7**)>5/(6’+&"7** F121.35-+01C625E0@1.-1+-31:E1/056E.41>G/HIE+0.4C.3354.+0.5/+/CJ.45-C1/3.0I41/02.6D:+0.5/F121D31C054D-0D217**>J+40523166140./:0@13D441336D-4D-0D21567**,3D4@ +345/0+E./+0.5/,0@135-D0.5/F.0@5D0*+’8 ,9:’8 +/C45--+:1/+31F121./K130.:+01CCD2./:0@130DC; I>B@14D-0D21C7**F12130+./1CF.0@4;<.0.EED/56-D521341/41+/0.L5CI+/C.C1/0.6.1CD/C120@145/; 654+-E.425345MI>7/&-l(&" N1 @+K1 3D441336D--I LD.-0 DM 0@1 E10@5C 6520@1 4D-0D21 567**> C’*,l-&)’*&"9+/I6+40523F@.4@+211331/0.+-6520@14D-0D21567**3@5D-CL1 E1/0.5/1C,3D4@+3 M21K1/0./:45/0+E./+0.5/,21CD4./:1OM53D210535-D0.5/F.0@5D0*+’8 ,9:’8 +/C+MM25M2.+0145--+:1; /+31C.:130.5/> " " (8/9:’.+&)"./01230.0.+-41--356*+,+-" "4D-0D21" ".EED/56-D521341/41

鸡睾丸细胞体外分离培养初探

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O+三酶二步%胶原蛋白酶B透明质酸酶Z胰蛋白酶+消化法A先将初步处理过的睾丸组织加入 CD倍体积$浓度为 C8)R8STC的@型胶原蛋白酶的培养液中,在 QGU$HE VWO 条件下作用 HP G87(%期间晃动数次+,离心弃去上清液终止消化>剩余组织重复上述过程 C次>第 O步用 C"H)RSTC的透明质酸酶 C8S和 D"OHE胰蛋白酶 C"H8S联合消化,同一条件下轻微吹打 HPY87(,置显微镜下观察,可见曲精细管软散及单细胞或细胞团出现 >取上清液于试管中 ,加入小牛血清终止消化 >剩余组织重复上述过程 C次>细胞悬液用 D[DXC88 过滤筛过滤,YDD4R87(TC离心 H87(,弃去上清液,沉淀的细胞团用 HDD\S .:-: 液重新悬浮>取 D[DH8S单细胞悬液,台盼蓝染色鉴别细胞死活数> !"] 鸡睾丸细胞的提纯

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收集滤液
离心、弃上清
得沉淀
培养液溶解、吹打
PBS清洗，再离心，弃上清
得沉淀
200目铜网过筛
分散为单细胞
滤液
细胞进行3β-H SD酶活检测
37℃，5%CO2，饱和湿度下培养
稀释至108细胞/mL
胰蛋白酶
（水解细胞间的蛋白质，长时间的胰酶
环境会使细胞受到损伤）
酶消化法
I、II、IV型胶原酶（水解结缔组织中胶原蛋白成分，分离结缔组织、肌肉组织方面效果较好）
影响间质细胞培养的其他因素
培养液的选择、接种密度、培养液的量及更换、实验操作等。
仔猪睾丸间质细胞的分离和培养
睾丸间质细胞(Leydig Cel1s, LCs)是分布于曲细精管间疏松结缔组织的一种内分泌细胞，主要生物功能是合成并分泌睾酮。
分离、纯化 1、仔猪睾丸间质细胞的分离和培养
采集3周龄的仔猪睾丸
破碎、消化、过滤
铜网过筛间质细胞过筛可以获得较好的分离纯化效果，易贴壁，纯度较高。
活力较低，可能因为铜网过筛对细胞有一定的机械损伤。
活力检测
将细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以9:1比例混匀。计数板计数蓝色的死细胞数和无色透明的活细胞数，以活细胞率来表示细胞活力。
台盼蓝可穿过变性的细胞膜进入细胞内，与解体的DNA结合使其着色，细胞变蓝，即为坏死
纯度检测
3β-HSD染色检测细胞纯度
3β-HSD染色液： A液：DMSO、DHA、NBT. B液：β-NAD、PBS
在睾丸组织中仅睾丸间质细胞内含有3β-羟类固醇脱氢酶显微镜下细胞质中有蓝色颗粒的阳性细胞即为间质细胞
间质细胞形态学观察
培养24h的睾丸间质细胞(×400)
培养48h的睾丸间质细胞(×400)