层析工艺验证PPT

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pH 的重要性: 蛋白质净电荷随 pH 改变
滴定曲线
3
+
pH
10
稳定性范围
不同 pH 下的分离情况
1
蛋白质净电荷
用阳离子交换
用阴离子交换
2
-
1
2
9
pH 的重要性: 蛋白质净电荷随 pH 改变
流动相的 pH 选择性
Abs
Abs
Abs
Abs
V
V
V
V
+ 阳离子
表面净电荷
0
pH
阴离子
-
Abs
Abs
Abs
3
沉淀蛋白质的方法
(1) 盐析法 (2) 有机溶剂沉淀法 (3) 重金属盐沉淀法 (4) 加热变性沉淀法
4
蛋白质纯化策略
融合蛋白质
简单纯化
一步 亲和层析 90 - 97 % 纯度
更高纯度
多步纯化
表达
非融合蛋白质
5
粗提 中度纯化 精细纯化
三步纯化策略
高效纯化策略
分辩率 精细纯化
纯化
分解目标分子
17
预防措施
膜过滤、离心、匀 浆
离心、如可跟目标 分子兼容，可用有
机溶剂
添加硫酸链霉素、 硫酸精蛋白或锰盐 沉淀核酸、添加核
酸酶
添加蛋白酶抑制剂 、用亲和层析去除 蛋白酶、缩短粗分 时间、低温操作
粗提
目的
纯化粗样 快速浓缩 (减少体积) 和稳定样品 (去除蛋白
酶) 最适用层析技术: 离子交换 / 疏水层析
Step
12
三步纯化策略
层析填料的 颗粒大小
精细纯化 中度纯化

欲得产量较多目的物，则合并较宽部分。
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九、洗脱峰的纯度鉴定
▪ 由于检测系统的分辨率有限所以一个对称的洗脱峰并不 一定代表一个纯净的组分。
▪ 如果洗脱峰峰形不对称，或出现“肩”(shoulder)，则表 示混有杂质。
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▪ 对在一个特定的柱层析分 离条件下显示出的每个峰 要用几个纯度标准(一般23个高分辨率方法)来检验， 才能确定它的均一性。
和生物活性测定法等。
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▪ 如果某一化合物具有特征性物理特性，对可见光或紫 外光有吸收，如蛋白质在280nm，核酸在260nm处有最 大的吸收。可用核酸白质检测仪。
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▪ 洗脱液的合并方法对目的物质量和产量有较大的影响。
欲得高纯度的化合物，一般根据洗脱峰位置收集合并较窄的 部分；
例如，可采用SDS电泳法、 等电聚焦法、高效液相层析 法和测定N末端氨基酸残基 方法等。
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十、脱盐和浓缩
▪ 洗脱峰在纯度鉴定的基础上，将同一组分合并。 ▪ 若欲得到某一产品，有必要依次经过减压薄膜浓缩法或超
滤(去盐、去水)，透析去盐 ▪ 再用冰冻干燥或有机溶剂沉淀等方法处理，得到干粉或沉
▪ 对于分析性柱层析，加样量一般不超过床体积0.5-1％，制备性柱 层析加样量不超过1-3％。
▪ 离子交换剂的加样量远远大于分子筛。
▪ 如果要求高分辨率时，如分析性柱层析和精制要求高纯度产品时， 则样品的体积尽可能小。
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1．样品的准备
▪ 样品在上柱前必需经预处理，由于分离和制备的目的不 同，预处理的方法也往往不同。
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❖ 缺点：刚性差，不耐压，分离时间长
层析介质的性能
❖ 层析介质的形状：球形，不定形 ❖ 技术指标
粒度大小：粒度小，分离效果好，但流速慢 均匀度：均匀，流速快，峰值集中 机械强度：强度高，流速快，保留值小，柱效高 理化性质：稳定，非特异性吸附少，亲水性好，耐酸碱和有机溶剂 吸附容量：单位质量或体积的层析介质吸附流动相中溶质的质量。
❖ 纸上层析是用滤纸作为支持剂（载体）的一种色层 分析法，这种方法的基本原理一般认为主要是利用混和 物中各组分在流动相和固定相间的分配比的不同而使之 分离。
❖ 纸上层析可用于化学性质相近的混和物的分离，特 别适宜于微量物质的分离和鉴别。而且使用的仪器简单， 操作比较容易，重现性好。
三、层析前蛋白质处理
层析技术是一种分离技术，是混合物 最有效的分离、分析方法。
经典色谱（offline)
Tswett把植物绿叶的色素混合液加在一根装有干燥固体碳 酸钙颗粒（称固定相）的玻璃长管（称为填充色谱柱）上 端;
洗脱剂（亦称流动相）石油醚自上而下流过；
在石油醚不断冲洗下，原来在柱子上端的色素混合液向下 移动。由于色素中各组分的性质的差异，最后分离成不同 颜色的清晰色带；
检测器
固定相
❖ 固定相是不溶于溶剂和水的固定化颗粒，又 称为层析介质、层析填料、填充剂等。
❖ 包括：
无机材料：硅胶，氧化铝 有机材料：聚苯乙烯等 多糖类材料：葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺
层析介质与生物大分子的关系
❖ 大孔径的，亲水性好的球形材料。 ❖ 多糖类凝胶层析介质最常用
Sephadex Sepharose Bio-Gel
2、等电点沉淀
❖ 在溶液pH值等于蛋白质等电点时，蛋白 质的溶解度最小，容易互相吸引，聚合成沉 淀；加入盐离子会破坏这些吸引力，使分子 散开，溶入水中。

⒉加样与洗脱
加样：层析所用的样品应与起始缓冲液有相 同的pH和离子强度，所选定的pH值应落在 交换剂与被结合物有相反电荷的范围，同时 要注意离子强度应低，可用透析、凝胶过滤 或稀释法达此目的。样品中的不溶物应在透 析后或凝胶过滤前，以离心法除去。为了达 到满意的分离效果，上样量要适当，不要超 过柱的负荷能力。柱的负荷能力可用交换容 量来推算，通常上样量为交换剂交换总量的 1％-5％。
C＝C2－（C2－C1）（1－V）A2/A1
洗脱时应满足以下要求：①洗脱液体 积应足够大，一般要几十倍于床体 积，从而使分离的各峰不致于太拥 挤。②梯度的上限要足够高，使紧密 吸附的物质能被洗脱下来。③梯度不 要上升太快，要恰好使移动的区带在 快到柱末端时达到解吸状态。目的物 的过早解吸，会引起区带扩散；而目 的物的过晚解吸会使峰形过宽。
液-固层析（liquid-solid chromatography）
液-液层析（liquid-liquid chromatography）
2.按层析过程的机制可分为
.吸附层析(adsorption chromatography ) ----利用吸附剂对不同组分吸附 能力的不同加以分离的方法。
.分配层析(partition chromatography ) ----利用不同组分在流动相和固定相中的 分配系数不同而进行分离的方法。
其固定相也可有两种状态，一种是以 固体作为吸附剂的固定相，另一种是以涂 布在固体载体表面的液体作为固定相。
层析
气相层析（gaschromatography）
气-固层析（gas-solid chromatography）
气-液层析（gas-liquid chromatography）
液相层析（liquidchromatography）