当前位置：文档之家 › 猪卵泡液和促性腺激素处理时间对猪卵母细胞体外成熟的影响

猪卵泡液和促性腺激素处理时间对猪卵母细胞体外成熟的影响

  • 格式：pdf
  • 大小：154.38 KB
  • 文档页数：4

安徽农业大学学报,2005,32(3):289~292JournalofAnhuiAgriculturalUniversity

猪卵泡液和促性腺激素处理时间对猪卵母细胞体外成熟的影响¹

卢晟盛1,2,3,魏 凤3,房慧伶3,王爱德3,卢克焕1,2(11广西亚热带生物资源保护利用重点实验室,南宁530005;21广西大学动物繁殖研究所,南宁530005;31广西大学动物科技学院,南宁530005)

摘 要:研究猪卵泡液(pFF)的浓度和促性腺激素(FSH和LH)处理时间对猪卵泡卵母细胞体外成熟的影响。结果表明,在猪卵丘细胞-卵母细胞复合体体外成熟培养46~48h中的后23~24h去除促性腺激素可有利于卵丘细胞的扩散,但对卵细胞的核成熟无显著影响(P>0105);添加适量(10%)的pFF对猪卵母细胞体外成熟有一定的促进作用,但添加浓度太高则相对抑制卵子核成熟进程。关键词:猪;卵母细胞;体外成熟;卵泡液;促性腺激素 中图分类号:S82813文献标识码:A文章编号:1672-352X(2005)03-0289-04

在体内,卵母细胞胞质的成熟过程受激素水平变化的调节[1],排卵前促性腺激素峰可以通过颗粒细胞诱导卵母细胞成熟[2],并引起卵丘细胞扩散[3]。因而促性腺激素水平的变化对卵丘细胞的分泌功能具有一定的调节作用,卵丘细胞受激素作用的时间由此也可能直接地或间接影响卵母细胞的核和胞质成熟。卵泡液是卵泡中血清渗出物经过新陈代谢活动改变过的产物,包含有特殊成分,如卵泡壁细胞合成的类固醇和糖蛋白。猪卵泡液(pFF)中含有一种分子量介于10000~200000u的酸性基质,可促进猪卵母细胞的成熟[4,5]。在牛卵母细胞体外成熟液中添加10%~20%的牛卵泡液可促进卵母细胞胞质的成熟,并促进以后胚胎早期的发育,同时10%~20%的牛卵泡液还是相同浓度血清的替代品[6]。而本研究旨在探讨不同浓度的pFF和促性腺激素(FSH和LH)处理时间对猪卵泡卵母细胞体外成熟的影响。

1 材料和方法111 试剂和培养液TCM-199粉剂购自美国Gibco公司,按说明配制成培养液。其余药品购自美国Sigma公司。配制培养液的用水为南宁当地自来水经3次蒸馏,再经Mil-iQ器过滤,最后经石英蒸馏器蒸馏的超纯水。FSH和LH为中国科学院动物研究所生产。成熟培养液为改良TCM-199液,洗卵液为TL-Hepes-PVA液,其成分见文献[7]。成熟液使用之前在含5%CO2的空气、饱和湿度的39e培养箱中预热、平衡4h以上。洗卵液使用之前在不含CO2的39e恒温箱中预热4h以上。猪卵母细胞的体外成熟培养条件为39e、5%CO2

和饱和湿度。

112 卵母细胞的收集从当地屠宰场收集母猪卵巢,置于25~37e的添加抗菌素的生理盐水中于6h内运回实验室,用生理盐水冲洗3次。用带12号针头的10mL注射器抽取卵巢表面上直径2~6mm卵泡的卵母细胞,在实体显微镜下用玻璃吸管吸取带有2层以上卵丘细胞、胞质均匀的卵丘细胞-卵母细胞复合体(COCs),在改良TL-Hepes-PVA中洗3次,再用经平衡4h以上添加了011%聚乙烯醇(PVA)改良TCM-199液清洗3次。

¹收稿日期:2004-09-15基金项目:广西科技攻关项目(桂科攻0330004-14和0428011-1),广西大学谭锦球青年科研基金项目(X022050)以及广西大学2003年博士科研启动基金项目共同资助。作者简介:卢晟盛(1971-),男,博士,副研究员。113 猪卵泡液的制备从猪卵巢表面抽取直径3~5mm卵泡,捡出卵母细胞后在4000r#min-1下离心10min,每次吸取上清液,重复2次,以除去颗粒细胞和血细胞。然后用0145Lm微孔滤膜除去异物,再用0122Lm的微孔滤膜除菌。最后将除菌后的卵泡液分装于微管,置于-20e冰箱中冻存备用。114 试验设计试验1:探讨FSH和LH处理时间(24和48h)对猪卵泡卵母细胞体外成熟的影响。成熟液为添加011%PVA的改良TCM-199液,置于四孔培养板(丹麦Nunc)中,每孔含500LL成熟液,培养COCs30~60枚#孔-1,上盖矿物油,再加入终浓度为110Lg#mL-1的FSH和LH。COCs经成熟培养23~24h后,再作以下处理,(1)对照组,移至含相同浓度FSH和LH的成熟液中继续培养23~24h;(2)处理组,移至无FSH和LH的成熟液中继续培养23~24h。完成46~48h成熟培养后,将COCs置于实体显微镜下评估卵丘细胞扩散情况。卵丘细胞扩散分为4类,第1类,卵丘细胞基本没有扩散;第2类,75%以上COCs约有25%的卵丘细胞扩散;第3类,75%以上COCs约有50%的卵丘细胞扩散;第4类,75%以上COCs约有100%的卵丘细胞扩散。试验重复6次。试验2:探讨猪卵泡液(pFF)浓度(0~40%)对猪卵泡卵母细胞体外成熟的影响。将COCs以15~35枚为1组随机置于添加不同浓度pFF的改良TCM-199成熟液中,(1)对照组,不添加pFF;(2)处理组1,添加10%pFF;(3)处理组2,添加20%pFF;(4)处理组3,添加40%pFF。成熟液为100LL的微滴,置于美国产的Falcon培养皿(60mm@15mm)内,矿物油覆盖,再加入最终浓度为110Lg#mL-1的FSH和LH。COCs成熟培养23~24h后,再移至相应的无FSH和LH的成熟液中培养23~24h。试验重复4次。115 卵母细胞核成熟的检查经过44~48h体外成熟培养后,2个试验的COCs均用含011%透明质酸酶的洗卵液在旋涡震荡器上除去卵丘细胞,置于1B3的醋酸/酒精中于室温固定36h以上。然后置于载玻片和盖玻片之间用溶于45%醋酸的1%间苯二酚蓝染色,在200倍和400倍的相差显微镜下观察卵母细胞减数分裂阶段。根据HunterandPolge的方法[8]评估卵母细胞减数分裂的各个时期,染色体发育到第二次减数分裂中期即评定为核成熟。116 统计分析用卡方(V2)检验来检查各组卵母细胞减数分裂阶段之间的差异显著性。

2 结果与分析211 促性腺激素处理时间对猪卵母细胞体外成熟的影响试验1的结果显示,猪COCs经46~48h成熟培养后,进行形态学观察,对照组75%以上COCs的外周约25%卵丘细胞扩散,而处理组75%以上COCs的外周约50%卵丘细胞扩散;染色观察发现,处理组与对照组相比,卵母细胞核的各个发育阶段[生发泡~第一次减数分裂中期前(GV~PMÑ)、第一次减数分裂中期(MÑ)、第一次减数分裂后期(AnaÑ)、第一次减数分裂末期(TelÑ)、第二次减数分裂中期(MÒ)]的比率之间无显著差异(P>0105,见表1)。结果表明,在猪COCs的46~48h体外成熟培养过程中

的后23~24h去除促性腺激素有利于卵丘细胞的扩散,但对卵母细胞的核成熟过程无显著影响。表1 成熟液中促性腺激素(FSH和LH)处理时间对猪卵母细胞体外核成熟的影响Table1 Effectsofexposuretimetogonadotrophin(FSHandLH)onnuclearmaturationinvitroofporcineoocytes处理Treatments检查的卵母细胞数No.ofoocytesexamined减数分裂阶段的卵母细胞数No.ofoocytesatthedifferentstageofmiosis

GV-PMÑMÑAnaÑTelÑMÒ对照组Control1311(018%)24(1813%)6(416%)52(3917%)48(3616%)处理组Treatment1413(211%)15(1016%)5(315%)62(4410%)56(3917%)

212 猪卵泡液浓度变化对猪卵母细胞体外成熟的影响从表2可以看出,成熟液中添加10%pFF,猪卵母细胞的核成熟率与对照组(0%pFF)的相比,虽然统计学差异不显著(P>0105),但有一定的促进作用(3718%B2311%);随着成熟液中pFF浓度的增加,核成熟率呈下降趋势,当pFF浓度为40%时,卵母细胞的核成熟率显著低于10%pFF组(1816%B

290安徽农业大学学报2005年3718%;P<0105),而发育到第一次减数分裂中期的比率(3713%)则明显高于其它各组(1612%~1814%;P<0105)。结果表明,添加适量的(10%)pFF对猪卵母细胞体外成熟有一定的促进作用,但添加浓度过高则相对抑制卵子核成熟进程。表2 猪卵泡液浓度变化对猪卵母细胞体外核成熟的影响Table2 Effectsofdifferentconcentrationsofporcinefollicularfluid(pFF)onnuclearmaturationinvitroofporcineoocytes

猪卵泡液浓度/%ConcentrationsofpFF检查的卵母细胞数No.ofoocytesexamined减数分裂阶段的卵母细胞数No.ofoocytesatthedifferentstageofmiosis

PMÑ/%MÑ/%AnaÑ/%TelÑ/%MÒ/%0(CK)522(318)9(1713)b7(1315)22(4213)12(2311)ab

10740(0)12(1612)bB11(1419)23(3111)28(3718)a

20492(411)9(1814)b6(1212)17(3417)15(3016)ab

40590(0)22(3713)aA6(1012)20(3319)11(1816)b

A,B:P<0101;a,b:P<0105

3 讨论一些学者把卵丘细胞扩散作为卵母细胞成熟的标志。例如魏庆信等[9]以卵丘细胞扩散或成放射状作为猪卵母细胞成熟的标准,蔡令波等[10]也把猪COCs的卵丘细胞扩散作为猪卵母细胞成熟的判断标准。在本研究中,在猪COCs的46~48h成熟培养的后23~24h阶段去除成熟液中的激素与整个46~48h成熟培养不去除激素相比加强了卵丘细胞的扩散(卵丘分别为50%和25%扩散),但对卵母细胞核成熟率却没有显著影响。孙兴参等[11]也认为,卵丘扩展良好与否对猪卵母细胞核成熟比例无统计学差异(P>0105)。因此,作者认为,猪卵母细胞的核成熟与其周围卵丘细胞扩展没有必然的联系,卵丘细胞扩散或成放射状不能作为猪卵母细胞核成熟的标准,只有排出第一极体才能作为猪卵母细胞核成熟的标志。学者们对于激素处理时间对猪卵母细胞体外成熟的影响有不同的看法。Funahash,ietal.报道在成熟过程中采用两个不同的激素条件:前20h培养中加入激素但在后20h培养中去除激素,这对猪卵母细胞减数分裂和细胞质成熟有好处[12],但LiuandMoor的试验结果证明,在猪卵母细胞成熟培养44~48h的后24h去除激素只影响早期胚胎发育,对核成熟无显著影响[13];孟庆刚等[14]也发现,在猪小腔卵泡卵母细胞成熟培养48h的后24h去除激素对其核成熟无显著影响。在本研究中,在猪COCs的46~48h成熟培养的后23~24h阶段去除成熟液中的激素对卵丘细胞扩散有显著加强作用,但对卵母细胞的核成熟却没有显著影响,与LiuandMoor[13]与孟庆刚等[14]的结果一致,至于是否会影响猪卵母细胞的胞质成熟和早期胚胎发育则有待进一步研究。学者们对于添加pFF对猪卵母细胞体外成熟的影响也有不同的看法。Naito,etal.报道,37e下在猪卵母细胞成熟液中添加5%pFF可显著提高其体外受精后的雄原核形成率,这种效果随着添加pFF浓度的上升而加强[15]。Yoshida,etal.从直径2~5mm卵泡中提取pFF,添加入每组含10~15枚猪卵母细胞的200LL成熟液(含孕马血清促性腺激素、人绒毛膜促性腺激素、雌二醇和胎牛血清)滴中,检测出pFF中含有一种可促进猪卵母细胞成熟的分子量介于10~200ku的酸性基质,并观察到在成熟液中添加10%pFF显著提高猪卵母细胞的核成熟率、正常受精率和卵裂率[4,5]。Rath,etal.也从直径2~5mm卵泡中提取pFF,添加入每组含5枚猪卵母细胞的50LL成熟液(TCM-199+碳酸氢钠+胎牛血清)滴中,发现在成熟液中添加10%pFF可显著提高猪卵母细胞的核成熟率[16]。刘红林等从直径5~12mm卵泡中提取pFF,却发现在成熟液(TCM-199+胎牛血清+孕马血清促性腺激素)中添加10%pFF与否对猪卵母细胞核成熟和体外受精后的分裂率都无显著影响[17]。秦鹏春等利用TCM-199+HEPES+葡萄糖+乳酸钙+丙酮酸钠作为成熟液,将10%pFF添加到每组含20~30枚猪卵母细胞的150LL成熟液滴中,发现添加10%pFF对猪卵母细胞核成熟率和授精后的分裂率影响不显著,但提高桑椹胚形成率[18]。而Marcha,letal.从直径2~6mm卵泡中提取pFF,添加入每组含50枚猪卵母细胞的500LL成熟液(TCM-199+Earle氏盐分+硫基乙胺)滴中,结果发现在成熟液中添加10%pFF无论是对猪卵母细胞的核成熟、体外受精后的分裂率,还是囊胚率和囊胚细胞数都无显著影响[19]。本实验室曾报道,成熟液中添加10%pFF对猪卵母细胞核成熟率、体外受精后的分裂率、第6d桑椹胚+囊胚率和第8d囊胚率均无显著影响[7]。本研究从直径3~5mm卵泡中提取pFF,猪卵母细胞以每组15~35枚在添加10%pFF的100

合集下载

卵母细胞体外成熟的影响因素

卵母细胞体外成熟的影响因素

卵母细胞体外成熟的影响因素乔利敏1,2 黄成定2　李向臣1　姚雅馨2　关伟军13 马月辉1(1中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100094　2甘肃农业大学动物科技学院兰州730070) 【摘要】随着哺乳动物体外受精、细胞核移植技术的不断深入,人们对成熟卵母细胞以及哺乳动物胚胎需求量日益增加,卵巢内丰富的卵泡资源是胚胎工程迅速发展的基础。

本文从卵巢因素、供体、体外培养条件和成熟培养液中添加成分等对卵母细胞IVM的影响进行了分析,为胚胎的体外生产提供理论基础和科研依据。

关键词:卵母细胞;体外成熟;影响因素 胚胎移植技术成熟与否是胚胎工程技术成败的基础,而卵母细胞体外成熟质量又是决定胚胎移植技术成功的关键。

IVM可以为体细胞核移植提供大量的受体细胞,也为体外受精提供大量的MⅡ期卵母细胞,因此IVM已经成为胚胎体外生产和体外受精的重要环节之一。

虽然近几年来在卵母细胞的体外成熟方面已经取得了飞速发展,但是卵母细胞的体外成熟还存在很多问题。

现就卵母细胞体外成熟的影响因素进行概述。

1　卵巢因素和供体对卵母细胞体外成熟的影响1.1　卵巢所处性周期的影响有学者研究表明,卵巢所处性周期阶段影响卵母细胞的成熟培养,在无黄体期卵巢上的卵母细胞比黄体期和黄体前期卵巢上卵母细胞成熟效果要好。

崔亚利等〔1〕根据卵巢上是否有明显突出卵巢表面的黄体,将卵巢分为黄体期和卵泡期,分别在两期卵巢上卵泡中抽取卵母细胞进行体外成熟培养发现,二者无统计学差异,但是卵泡期卵母细胞成熟培养效果(63.9%)较好,说明卵巢性周期阶段对卵母细胞体外成熟存在一定影响,但影响不大。

2000年郭继彤〔2〕对繁殖季节和非繁殖季节山羊卵母细胞进行研究发现,非繁殖季节可采集到比繁殖季节更多的可用卵母细胞,并且非繁殖季节的屠宰山羊卵巢卵母细胞成熟培养效果(74.1%)优于繁殖季节的屠宰山羊卵巢卵母细胞(67.7%)。

在非繁殖季节屠宰的山羊,几乎没有大卵泡的发生。

猪人工授精技术知识

猪人工授精技术知识

猪人工授精技术知识竞赛复习题郑州市畜牧技术推广站中国河南郑州（2011-8）一、理论知识复习题1. 猪人工授精技术的概念？答：是指借助于专门的器械，人工采集公猪精液，经体外检查与处理后，再输入到发情母猪生殖道内，使其受胎的一种繁殖技术。

2. 猪人工授精技术的基本流程？答：采精；精液品质的检查；精液的稀释、标记和分装；精液的保存和运输；输精。

3. 人工授精技术什么时候开始应用于猪？答：20世纪30年代。

4. 我国从什么时候开始推广引用人工授精技术？答：20世纪50年代。

5. 猪人工授精技术的优势？答：（1）提高良种公猪利用率，降低成本。

（2）加速生猪品种改良。

（3）有效阻隔疫病传播。

（4）提高配种便利。

6. 猪人工授精比本交增加了哪四道防疫屏障？答：（1）减少活畜引进数量，减少疫病风险。

（2）公猪定期健康体检，切断源头病源。

（3）公母分离饲养繁殖，防止繁殖疾病传播和交叉感染。

（4）配种员执行严格的防疫程序，避免成为疫病的传播者和载体。

7. 遗传改良（育种）的核心技术是什么？答：选种。

8. 实现公猪对猪群的快速改良，生产水平的整体提升必须依靠什么技术的优势？答：人工授精技术。

9. 猪人工授精技术提高配种便利体现在哪些方面？答：（1）克服体型差异：克服猪只体型大小差异造成的不易交配的困难。

（2）克服空间差异：克服远距离公母猪无法交配的困难。

（3）克服时间差异：采用人工授精技术可以将公猪精液保存一定的时间，随时给发情母猪输精配种。

10. 公猪的引种应从哪些方面进行严格把关？答：健康、性能、体型外貌。

11. 引种时如何严把检疫关？答：（1）公猪的选择必须首先考虑来源场是否是新建场，新建场是指天然屏障防御好、建场时间不超过5年、管理和技术一流的原种猪场。

（2）公猪来源场必须没有任何与繁殖有关的传染性疾病。

（3）无疫区证明。

12. 引种时如何严把体型外貌关？答：（1）公猪选种必须符合本品种特点；（2）四肢要求粗壮、强劲有力；（3）乳头数要求七对以上，无瞎坏和畸形；（4）无遗传缺陷，睾丸发育良好，均匀对称；（5）包皮小，包皮内无积尿。

影响猪卵巢卵母细胞体外成熟的若干因素

影响猪卵巢卵母细胞体外成熟的若干因素

发 育生 物 学 的 重要 组 成部 分 ．是 胚 胎
步探 讨 其 对 体 外 成熟 （ 体 排 出和 细 极
胞 活 力 等 ） 体 外 受 精 影 响 ． 开 展 猪 与 为 胚 胎 发 育 生物 学 和种 质 资源 保 存 等 研
添 加 １ １一 ７３ Ｅ２ （ ｐ ／ １ ， ｍＬ） Ｐ Ｇ （０ ｇ 、 ＭＳ １
究 提 供 参 考依 据 。
１ 材 料 与 方 法
为 处 理 组 ．以 不 添加 任何 激 素 为 对 照
果。 利用 屠 宰 场 废弃 的猪 卵 巢 资 源 ． 通
组 ． 它培 养 条 件 与 １ ．相 同 ， 析 比 其 ．１ ２ 分
￣ ｑ ￣ ｍ 卵 泡卵 母 细 胞 ＩＭ效 果 ｂ ８ｍ ２ Ｖ １３ 不 同 发 育阶 段 Ｃ ． ＯＣｓ Ｃ Ｃ 培 养 在 四孑 板 上 进 行 ． 孔 Ｏ ｓ Ｌ 每
ｍＬ ＭＳ Ｉ Ｉ ／ Ｌ Ｇ、 ｐ ／ Ｌ ７ 一 Ｐ Ｇ、Ｏ Ｕ ｍ ＨＣ １ ￣ ｍ １ １ ｇ ３ Ｅ 以 及 双 抗 （ 、 霉 素 ） １ ０Ｉ 的 ２ 青 链 各 ０ Ｕ
改 良 ＣＭ１ ９ 养 液 和 改 良Ｎ Ｕ２ 培 ｒ ９培 ＣＳ ３
养 液 （其 中 以 ４ ／ Ｂ Ａ代 替 １％ ｍｇ ｍＬ Ｓ ０
Ｔ Ｍ１ ９ Ｎ Ｓ ２ 基 础 培 养 液 洗 ３ ． Ｃ ９ 和 ＣＵ ３ 遍 转 入 相 应 的 预平 衡 的成 熟 培 养 微 滴 系 统 中 （ 枚 ／ ） 在 ５ Ｏ ， 和 湿 ３ ５ 滴 ． ％Ｃ 饱 度 ．９℃条件 下培 养４ ． 计 分 析 卵 ３ ４ｈ 统 母 细胞 成 熟 培 养 效果
Ｎ Ｓ 。Ｉ Ｍ在３ ｍ培 养皿 内进 行 ． Ｃ ） Ｖ ５ｍ 每 皿 布 点 ５ ０ Ｌ 滴 ，覆 盖 矿 物 油 ， 个５ 微 Ｃ ， 养 箱 中 预 平 衡２ ｈ Ｏ培 以上 待 用 选
《双酚A损伤猪卵母细胞体外成熟质量机制研究》

《双酚A损伤猪卵母细胞体外成熟质量机制研究》

《双酚A损伤猪卵母细胞体外成熟质量机制研究》一、引言随着工业化的快速发展，环境污染物对人类健康和生殖功能的影响已成为科研热点。

双酚A（BPA）作为塑料制品的常见原料，被广泛应用于生产各类食品包装材料。

近年来，越来越多的研究指出BPA可能对生物体的生殖系统产生不良影响。

本篇论文旨在研究BPA对猪卵母细胞体外成熟质量的影响及其机制，以期为人类生殖健康提供理论依据。

二、材料与方法1. 材料本实验所使用的卵母细胞来自猪卵巢。

BPA购买自某国际试剂公司。

其他化学试剂及耗材均采购自正规渠道。

2. 方法（1）卵母细胞采集与体外成熟培养从猪卵巢中采集卵母细胞，进行体外成熟培养。

分别设置对照组和不同浓度的BPA处理组。

（2）BPA处理将各组卵母细胞暴露于不同浓度的BPA溶液中，观察其发育情况。

（3）机制研究通过免疫荧光、RT-PCR等方法，检测BPA处理后卵母细胞内相关基因和蛋白的表达变化。

三、结果1. BPA对猪卵母细胞体外成熟质量的影响实验结果显示，随着BPA浓度的增加，猪卵母细胞的成熟质量逐渐降低。

高浓度BPA处理组的卵母细胞在形态、结构及功能上均表现出明显异常。

2. 机制研究结果（1）基因表达变化通过RT-PCR检测发现，BPA处理后，卵母细胞内与发育相关的基因表达水平发生显著变化。

高浓度BPA处理组中，部分基因表达下调，而另一些基因表达上调。

（2）蛋白表达变化免疫荧光结果显示，BPA处理后，卵母细胞内相关蛋白的表达水平也发生改变。

这些蛋白的异常表达可能与BPA导致的卵母细胞发育障碍有关。

四、讨论本实验结果表明，BPA对猪卵母细胞的体外成熟质量具有显著的负面影响。

通过机制研究，我们发现BPA可能通过改变卵母细胞内相关基因和蛋白的表达，影响其正常发育。

这些发现为进一步研究BPA对人类生殖系统的影响提供了重要线索。

五、结论本篇论文研究了BPA对猪卵母细胞体外成熟质量的影响及其机制。

实验结果显示，BPA可降低猪卵母细胞的成熟质量，并可能通过改变相关基因和蛋白的表达，影响其正常发育。