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成年SD大鼠心肌细胞分离及其胞内钙离子动态变化测定

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缺血预适应与心肌细胞内钙离子的变化

缺血预适应与心肌细胞内钙离子的变化

近年来大量 的 研究显示 ： 细胞 内钙离 子（ Ｃ ］） ［ Ｅ 的变 化 在缺血预适应中起了重要作用 。［ ］既是 ＩＣ保 护中 ｃ Ｐ
不可缺少的触发因素 ， 又是缺血再灌 注产生细胞损伤及心律 失 常的罪魁耦 首。最能说 明这一点 的是 Ａ ｈ ｆ ｌ ｓｒ 等ｌ 关于钙 ａ 预适 应（ａ ｉ ｔ ａｄ／ ｔｇ ｃ ｃ 对抗 钙矛 盾 （ ａ ｐｌ－ ｃ ｃ ｍ ｐ ｃｎｉ ｒ ， Ｐ １ ｌｕ ￣ ｔ ｉ ｏｎ Ｃ－ ａｔ ＇ ￣
｛ｓ ｅ ｉ ｐ￣ ｎｉｏｉ ， Ｃ 。ＩＣ的作用机 理非 常复杂 ． ｉｈｍｃ ｎ ｏｄｔｎ ｇＩ ） Ｐ ｃ ｃ ｉｎ Ｆ 目 前研究认为 涉及诱 因 、 触发子 、 号通 路 及效应 子 等方 面。 信 能引起 ＩＣ保 护作用的诱 因包 括 ： Ｐ 缺血 、 氧 、 缺 起搏 、 热预适 应及外豫性药物（ 如吸 人性麻醉 剂） 。他们诱 导体 内产生 等 多种介质 ， 又称为触发子 ， 比较肯 定 的有缓 激肽 、 腺苷 一氧
是： 缺血预 处 理期 Ｃ ］的 升高 部分 来 自于 ｓ Ｅ Ｒ的 ｃ 。 然而 Ｃ ｖ 等Ｌ 对大 鼠心脏行缺血预处理 前先用 Ｒ ． ｍｏ ａｅ ５ ｙ １ ０ ｍ ｌ （ 该浓度 的 Ｒ ｖ阻断 ｓ ｃ２ Ｒａ 的释 放 ） Ｃ ｃ ｐａ ｎ ｉ【 Ｒ 或 ｙｌ ｉ ｏｌ ａ ｄ Ｓ — ｏ ｚ ｃｃ
，
ｃ Ａ Ｐｓ 的抑制 剂） 注心 脏 ， Ｔ ｏｅ 灌 二者均未 消豫 矾 的心脏 保护作用 。这一实验结果似乎说 明 ＩＣ的作用与 Ｓ Ｃ２ Ｐ Ｒ ａ 的 释放和摄取 功能 无关。Ｓｈ ｎｃｅ 等 。 定 了缺 血 预处理 ｃｍ ａｈｒ 测 期 ｃ２ 经细胞膜 的转运 ， ａ 发现 ： 此期 ｃ 向细胞外 的转 运下

咬合干扰大鼠咬肌线粒体钙超载的离子变化特征及其钙调蛋白激酶Ⅱ的调节机制

咬合干扰大鼠咬肌线粒体钙超载的离子变化特征及其钙调蛋白激酶Ⅱ的调节机制

咬合干扰大鼠咬肌线粒体钙超载的离子变化特征及其钙调蛋白激酶Ⅱ的调节机制曾林;刘静【摘要】目的探明咬合干扰作用下大鼠咬肌组织线粒体钙离子浓度与细胞外钠离子浓度的变化特点,探讨钙调蛋白激酶Ⅱ(CaMK Ⅱ)对线粒体“钙超载”现象的调控机制.方法在SD大鼠右侧上颌第一磨牙咬合面粘接直径0.6 mm钢丝段,建立咬合干扰大鼠模型,实验组分为3、7、14、21d及去除咬合干扰后3d组,并设立对照组.应用苏木精-伊红(HE)染色法观察咬肌组织形态学的变化;应用荧光分光光度法检测咬肌线粒体钙离子浓度;应用6-氢氧化锑钾直接比浊法检测咬肌肌纤维细胞外钠离子浓度;应用Western blotting技术检测咬肌组织p-CaMK Ⅱ(Thr286)/CaMK Ⅱ表达水平.结果与对照组比较,建模3、7、14和21 d实验组咬合干扰侧咬肌线粒体Ca2+浓度持续升高(P＜0.05),去除咬合干扰后3d组Ca2+浓度显著下降且低于正常对照组(P＜0.05).建模3d组、7d组、14d组及21 d组细胞外Na+浓度持续升高(P＜0.05),去除咬合干扰后3d组Na+浓度显著降低(P＜0.05).建模3d、7d 和14 d实验组咬合干扰侧p-CaMK Ⅱ(Thr286)/CaMK Ⅱ表达水平持续升高(P＜0.05),但其表达水平在建模21d组下降且低于对照组水平(P＜0.05),去除干扰3d 组表达水平显著下降且低于21 d组(P＜0.05).非咬合干扰侧变化趋势同干扰侧趋势一致,但干扰侧变化更显著(P＜0.05).结论咬合干扰可使大鼠咬肌线粒体Ca2+和胞浆Na+浓度升高,引发“钙超载”;线粒体Ca2+浓度升高与CaMK Ⅱ磷酸化水平相关,提示其对线粒体“钙超载”具有负反馈调节作用.【期刊名称】《南方医科大学学报》【年(卷),期】2018(038)006【总页数】6页(P755-760)【关键词】线粒体钙超载;咬合干扰;咬肌;钙调蛋白激酶2;咀嚼肌功能紊乱【作者】曾林;刘静【作者单位】暨南大学口腔医学院;暨南大学华侨医院口腔科,广东广州510630;暨南大学口腔医学院修复学教研室,广东广州510632【正文语种】中文钙离子是细胞凋亡信号中关键的第二信使，而线粒体凋亡途径是细胞凋亡发生的核心［1］。

细胞内钙离子释放通道：IP3受体

细胞内钙离子释放通道：IP3受体

细胞内钙离子释放通道：IP3受体最近几年来细胞内游离钙在信号转导中的作用日趋受到重视。

细胞钙离子的平稳，不仅通过质膜上电压和受体门控的通道入胞，还通过胞内钙释放通道介导的钙释放，形成了释放­—摄取—结合的完整进程，是阻碍或决定许多细胞反映的独立的第二信使[1]。

另外，细胞内游离钙还与胞浆和胞外钙有着及为复杂的时空动力学关系和多样的作用方式[2]。

作为钙释放通道之一的三磷酸肌醇受体（ iP3R）除在兴奋收缩耦联中起关键作用外，还参与了神经释放与突触效能改善、细胞周期调控与细胞间通信、激素分泌、基因表达等活动。

钙信号失常也会致使一系列病理进程。

1分子特点与表达在克隆小鼠 iP3R cDNA的进程中，人们已了解其大致结构[3]。

该受体有一个跨膜的信点靠近 c结尾，在胞浆部份有一长的氨基结尾和短的 c结尾。

比较小鼠、大鼠和人类的 iP3R结构， iP3R 胞浆部份大约有418～650个 n结尾的氨基酸残基是高度保守的，该区域缺失任何一个片断都能取消 iP3结合活性，提示该区域是 iP3结合的关键序列。

克隆的 cDNA所编码的蛋白事实上同时具有了 iP3结合和钙通道特性，因此又可称之为 iP3门控的 ca2+通道。

iP3R的要紧序列与细胞质膜上的钙通道无同源性，但与心肌和骨骼肌肌浆网上的另一种胞内钙释放通道 ryanodine受体部份同源。

iP3R为同型四聚体，每一个亚单位结合一个 iP3分子。

大鼠 iP3R 结构存在含有或缺失45核苷序列的两种 cDNA克隆，提示有不同的剪接方式，每一个亚基有2734个或2749个氨基酸，分子量260kD[4]。

受体结构含3个 cAMP依托的蛋白激酶作用的序列。

因含 iP3结合、配基门控钙通道和数个调控部位， iP3R是目前发觉的最大受体之一。

IP3R在脑 purkinje细胞、海马、脑干呈高表达，亦表达于动脉滑腻肌、子宫、膀胱和卵细胞。

iP3R散布于粗面内质网和外层核膜。

心肌细胞的生理特性(1)

心肌细胞的生理特性(1)

心肌细胞的生理特性(1)心肌细胞是构成心脏肌肉组织的基本细胞单元。

它具有特殊的形态和生理特性，能够协调地收缩和放松，维持心脏的正常功能。

下面是心肌细胞的生理特性的相关内容。

1. 刺激介导的细胞内钙离子释放心肌细胞的收缩和放松主要由细胞内钙离子水平的变化控制。

当心肌细胞受到神经或内分泌系统的刺激，细胞内的钙离子会迅速释放出来并进入肌纤维细胞内，引起细胞的收缩。

而在细胞膜上的电压发生变化时，细胞内的钙离子也会发生相应的变化，从而引起心肌细胞的收缩或放松。

2. 心肌细胞的电生理特性心肌细胞具有独特的电生理特性，不同于其他类型的体细胞。

它们能够自发地产生电信号，并传递给邻近的细胞。

这些电信号经过心脏的传导系统，最终引起心脏肌肉的收缩和放松。

由于心肌细胞的特殊性质，它们能够保证心脏的正常有序收缩和放松，维持心脏的正常功能。

3. 心肌细胞的代谢特性心肌细胞具有很高的代谢活性，需要特定的代谢物和氧气来维持生存。

由于心脏是一个需要不断地工作的器官，因此它需要大量的能量供应。

心肌细胞能够利用血液中提供的葡萄糖和脂肪酸等多种能量来源来合成ATP，从而维持心肌细胞的正常代谢。

4. 心肌细胞的自我修复能力心脏是一个高度自我修复的器官，其中的心肌细胞也具有相应的自我修复能力。

当心肌细胞受到疾病或受损时，它们能够通过增殖或移植等方式完成自我修复，帮助恢复心脏的正常功能。

因此，在心脏疾病治疗和心肌再生等领域，心肌细胞具有广泛的应用前景。

总之，心肌细胞是心脏肌肉组织中的主要细胞，具有特殊的形态和生理特性。

这些特性决定了心肌细胞在心脏的正常功能中具有重要的地位。

了解心肌细胞的生理特性，对于心脏疾病的治疗和心肌再生技术的研究具有重要的参考价值。

氨氯地平对钙调磷酸酶在心肌细胞凋亡中的作用

氨氯地平对钙调磷酸酶在心肌细胞凋亡中的作用

【摘要】目的研究缺血再灌注(I/R)时氨氯地平对心肌细胞凋亡的影响及钙调磷酸酶的变化。

方法结扎Wistar大鼠左冠状动脉前降支，缺血30 min复灌3 h，建立大鼠在体I/R动物模型。

18只大鼠按是否给予氨氯地平干预分为3组（每组6只）：假手术组、I/R组、I/R+氨氯地平组（术前7 d 连续灌胃给氨氯地平10mg·kg 1·d 1）。

用流式细胞术检测细胞凋亡率，RT PCR法检测CaNmRNA表达。

结果I/R组CaNmRNA的表达水平高于假手术组，同时心肌细胞凋亡率明显增加；氨氯地平组心肌细胞CaNmRNA的表达水平比I/R 组明显下降（0.73±0.02 vs. 0.91±0.02, P<0.05），心肌细胞凋亡率也明显降低（6.33±0.77 vs.17.30±1.01, P<0.05）。

结论钙调磷酸酶有促进心肌细胞凋亡的作用。

氨氯地平可能通过增加细胞膜及肌浆网上钙泵的表达有效减轻心肌细胞内的钙超载,降低CaN的活性抑制心肌细胞凋亡，对I/R心肌细胞具有保护作用。

【关键词】钙调磷酸酶；氨氯地平；缺血再灌注；心肌细胞凋亡Effect of amlodipine on expression of calcineurin (CaN) and myocardial apoptosis in ischemia reperfusion in rat heartsNIU Xiao yan，SHEN Xiao mei，YIN Wen jie，ZHANG Ju yan.Shanxi Medical University, Taiyuan 030001; Special Ward, First Affiliated Hospital, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, ChinaAbstract: Objective To investigate the effect of amlodipine on expression of calcineurin (CaN) and myocardial apoptosis in ischemia/reperfusion (I/R) in rat hearts. Methods Left anterior descending artery (LAD) in Wistar rat heart was ligated to establish I/R model (3 hours reperfusion after 30 minutes ischemia). Eighteen rats were divided into three groups based upon whether amlodipine intervention was used (6 rats for each group): sham operated group, I/R group, amlodipine group (amlodipine was administered at a daily dose of 10 mg·kg 1·d 1 for 7 days before I/R). The apoptosis rate of myocardial cells was tested by flow cytometry and the CaN espression was tested through RT PCR. Results Compared to sham operated group, the CaN mRNA level and rate of myocardial apoptosis were all significantly increased in I/R group. While the CaN mRNA level and rate of myocardial apoptosis were significantly decreased in amlodipine group than in I/R group (0.72±0.02 vs.0.91±0.02, P<0.05; 6.33±0.77 vs.17.30±1.01, P<0.05). Conclusions Amlodipine can effectively reduce the intracellular Ca2+ overload by reducing the expression of CaN, and can protect the anoxic myocardial cells from apoptosis.Key words: Calcineurin; Ischemia reperfusion; Amlodipine; Myocardial apoptosis急诊经皮腔内冠状动脉成形术（percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA）、冠状动脉旁路移植术等方法能及时恢复梗死区域心肌的血液供应，可以挽救濒死心肌，起到缩小梗死范围和保护心功能的作用,是临床治疗急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)的有效手段。

dd细胞内钙离子释放通道IP3受体

dd细胞内钙离子释放通道IP3受体

医学生细胞内钙离子释放通道IP3受体 文字表述：关键词：　钙释放通道　信号转导　三磷酸肌醇　受体　第二信使　 近年来细胞内游离钙在信号转导中的作用日益受到重视。

细胞钙离子的平衡，不仅通过质膜上电压和受体门控的通道入胞，还通过胞内钙释放通道介导的钙释放，形成了释放＆ｓｈｙ；—摄取—结合的完整过程，是影响或决定许多细胞反应的独立的第二信使［１］。

此外，细胞内游离钙还与胞浆和胞外钙有着及为复杂的时空动力学关系和多样的作用方式［２］。

作为钙释放通道之一的三磷酸肌醇受体（ｉＰ３Ｒ）除了在兴奋收缩耦联中起关键作用外，还参与了神经释放与突触效能改善、细胞周期调控与细胞间通讯、激素分泌、基因表达等活动。

钙信号失常也会导致一系列病理过程。

１分子特征与表达 在克隆小鼠　ｉＰ３Ｒ　ｃＤＮＡ的过程中，人们已了解其大致结构［３］。

该受体有一个跨膜的信点靠近　ｃ末端，在胞浆部分有一长的氨基末端和短的　ｃ末端。

比较小鼠、大鼠和人类的　ｉＰ３Ｒ结构，　ｉＰ３Ｒ胞浆部分大约有４１８～６５０个　ｎ末端的氨基酸残基是高度保守的，该区域缺失任何一个片断都能取消　ｉＰ３结合活性，提示该区域是　ｉＰ３结合的关键序列。

克隆的　ｃＤＮＡ所编码的蛋白实际上同时具备了　ｉＰ３结合和钙通道特性，因此又可称之为　ｉＰ３门控的　ｃａ２＋通道。

ｉＰ３Ｒ的主要序列与细胞质膜上的钙通道无同源性，但与心肌和骨骼肌肌浆网上的另一种胞内钙释放通道　ｒｙａｎｏｄｉｎｅ受体部分同源。

　ｉＰ３Ｒ为同型四聚体，每个亚单位结合一个　ｉＰ３分子。

大鼠　ｉＰ３Ｒ结构存在含有或缺失４５核苷序列的两种　ｃＤＮＡ克隆，提示有不同的剪接方式，每个亚基有２７３４个或２７４９个氨基酸，分子量２６０ｋＤ［４］。

受体结构含３个　ｃＡＭＰ依赖的蛋白激酶作用的序列。

因含　ｉＰ３结合、配基门控钙通道和数个调控部位，　ｉＰ３Ｒ是目前发现的最大受体之一。

ＩＰ３Ｒ在脑　ｐｕｒｋｉｎｊｅ细胞、海马、脑干呈高表达，亦表达于动脉平滑肌、子宫、膀胱和卵细胞。

利用膜片钳-激光扫描共聚焦显微镜同步实时系统观察心肌细胞浆内钙离子的释放

（ ．第二 军 医大 学基础部 生 物物理 研 究所 ， 海 ２０ ３ ； １ 上 ０ ４ ３
２ ．同济 大学 生命 科 学与技 术 学 院 电镜 室 ， 海 ２０ ３ ） 上 ０ ４ ３
摘 要 ：目 的 ： 用 膜 片 钳 和 激 光 扫 描 共 聚 焦 显 微 镜 同 步 实 时 系统 观 察 心 肌 细 胞 钙 离子 的释 放 。 方 法 ： 体 外培 采 在 养 的单 个心 室肌 细 胞 上进 行 全 细 胞 模 式 膜 片 钳 技 术 和 共 聚 焦 显 微 镜 钙 成像 技 术 相 结 合 ， 步 实 时记 录 钙 火花 和 钙 同

步研究 ， 者将 膜 片钳 系统 和 激 光 扫 描共 聚焦 显 作
微 镜 系统 联机 以实现 同步 实 时记 录离 子 电流 、 子 离 浓 度和 分布 的变化 ， 而达 到 细 胞 离 子 释 放 的功 能 从 和形 态学研 究 的统一 。本 文利 用膜 片钳 刺激 心肌 细 胞 ， 录激 活 的 型 钙 离 子 通 道 电 流 变 化 的 同时 ， 记
文章 编号 ：１ ０ ６ ８ （０ ８ ０ —１７０ １０ ２ １２ ０ ）２０ ２ — ３ ４
利 用 膜 片 钳 一激 光 扫 描 共 聚 焦 显 微 镜 同步 实 时 系统 观 察 心 肌 细 胞 浆 内钙 离 子 的释 放
沈 亚峰 梁 文 雷 长 海 汤 莹 范 小燕 羊 富 光 杨 勇骥 卜 ， ， ， ， ， ， ， 祝 建
采用 激光扫 描共 聚焦 显微 镜记 录刺 激后 心 肌细胞 浆
收 稿 日期 ：０ ７ １－ ８ ２ ０ ． ｏ ０
玻璃 电极 自动拉 制 仪 制 备 玻璃 电 极 ， 电极 内 用
基 金项 目 ： 国家 自然 科 学 基 金 资 助 项 目（ ｏ３９０ ５ ， ｏ３ １０５ ） 全 军 医 药 卫 生 科研 基 金项 目（ ｏ０ ＭＢ０ ） Ｎ ．９ ７３９ Ｎ ．０ ７２３ ， Ｎ ．６ ２２

溶血磷脂酰胆碱对心肌细胞T型钙离子通道的调控

ｄ ｉ １ ３ ６ ／ ．ｓｎ １７１１ ７ ２ １ ． ６ ０ ４ ｏ ：０． ９ ９ ｊｉｓ ． ６ —６ Ｘ． ０ １ ０ ． ０
Ｒｅ ｕ ａ ｉ ｎ ｏ ｔ ｐｅ Ｃａ ｇ ｌ ｔｏ ｆＴ－ｙ ｃ ｎ ｌｉ ｌ ｓ ｐ ｓ ａ ｉ ｌｈｏ ｉ ｅ ｓｉ ｕｌ ｔ ｄ ｅ ｒ ｏ ｈａ ｎｅ ｎ ｙ ｏ ｈｏ ｐｈ ｔｄｙ ｃ ｌｎ －ｔｍ ａ ｅ ａ ｄｉ ｍｙｏ ．
北
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京
大
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报
（ 医
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版 ）
８ ０４ ・

Ｊ Ｕ ＮＡ ＦＰ Ｋ Ｎ Ｎ Ｖ Ｒ ＩＹ（ Ｅ Ｌ Ｈ Ｓ ＩＮ Ｅ ） Ｖ １４ Ｎ ． Ｄ ｃ ０ Ｏ Ｒ ＬＯ Ｅ Ｉ Ｇ ｕ Ｉ Ｅ ｓＴ Ｈ Ａ Ｔ ＣＥ Ｃ Ｓ ｏ．３ ｏ ６ ｅ．２ １ １
・
论 著
・
溶 血 磷 脂 酰 胆 碱 对 心 肌 细 胞 Ｔ 型 钙 离 子 通 道 的 调 控
影响 ， 探讨在缺 血心肌细胞胞 内和／ 或细胞 间隙中 Ｌ Ｃ的增 加引起心动过速或心律失 常的潜 在机制 。方 法： Ｐ 以酶 消
化法制备 １～ ３ｄ新生 Ｗｉ ａ 大鼠心室肌细胞 （ ５批 ， ｓｒ ｔ 共 每批 ８只 ） 及成年 Ｗｉ ａ 大 鼠的肥大心室 肌细胞 （ ｓｒ ｔ 实验组 和
处 理 后 心 肌 细 胞 搏 动从 （ ２４８ 次 ／ 增 至 （４± ） 分 。 新 生 鼠心 肌 细 胞 和 成 年 鼠 肥 大 心 室 肌 细 胞 经 Ｌ Ｃ处 理 ４ ） 分 － ６ ８ 次／ Ｐ 后， 细胞 内 Ｃ “ 浓 度 较 高 时 ， 分 别 增 加 了 ２ ．％ 和 ２ ．％ ； 当细 胞 内 Ｃ “ 浓 度 较 低 时 ，ＣＴ 无 变 化 ， 照 组 ａ Ｉ １５ ３５ 而 ａ ￣ 均 ａ 对

细胞内钙成像和钙测定的基本原理及应用

史娟等：细胞内钙成像和钙测定的基本原理及应用４５９Ｆｉｇ．２ＳｃｈｅｍａｔｉｃｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｏｎｏｆｃａｍｅｌｅｏｎｍｏｌｅｃｕｌａｒａｒＩｄｉｔｓＣａ２＋一ｉｍａｇｉｎｇｐｒｉｎｃｉｐｌｅ（ｃｈａｎｇｅｄｆｂｍＭｉｙａｗａｋｉ８１１９）子结合，ｃａＭ会发生构象变化，其两端的“球形结构”向中间靠拢，以Ｍ１３为纽带，ＹＦＰ和ＣＦＰ间的距离缩小而发生荧光共振能量转移。

这样，当用４４０ｎｍ波长的蓝光激发时，ｃＦＰ４８０ｎｍ的青色荧光减弱而ＹＦＰ５３０ｎｍ的黄色荧光增强，利用Ｆ。

，，／Ｆ。

，，便可以间接衡量细胞内钙信号的变化。

荧光蛋白指示剂与发光蛋白和化学染料相比有其优越性。

与发光蛋白相比，属于比值测定，且荧光信号强，对光子监测系统要求低。

与化学荧光剂比较，可以微注射或异源表达测钙，染料的靶向定位好，可以测量特定的细胞器内的钙信号，而且无渗漏现象。

但它也有缺点，如信号的动力域窄（Ｒ…／ＲⅢｍ＜２），对ｐＨ值变化敏感等四’２…。

２．钙指示剂的负载指示剂只有成功地进入细胞，才有可能对钙信号进行监控。

负载指示剂的方法很多，在此介绍三种常用的方法。

２．１酯质载入商品化的酯质染料带有乙酰甲酯（ＡＭ）尾，具有疏水性可以被动地扩散至细胞内。

ＡＭ染料对钙离子没有亲和性，经细胞内的酯酶水解脱掉ＡＭ尾后才可以发挥指示剂的作用。

水解后的酸式染料为亲水性，不能扩散出细胞膜。

所以，染料最终可以不可逆地在细胞内达到很高的水平。

酯质染料的孵育条件因染料种类，细胞类型而有所不同。

以Ｆｕｒａ２ＡＭ为例，对于培养细胞和急性分离的细胞，一般ｌ～５¨ｍｏＬ／Ｌ浓度室温孵育３０ｍｉｎ，可以达到较好的负载效果。

在孵育的过程中，可以使用ｐｌｕｒｏｎｉｃＦ－１２７或ｃｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ等助扩散剂，可以帮助疏水性的酯质染料均匀地扩散在细胞外液中，提高负载效果旧“。

脂质载人的优点是操作简便易行，不需要专门的技术要求，而且能在较短的时间内获得很高的染料浓度。

活血药对血管紧张素Ⅱ致心肌肥大细胞内钙浓度变化的影响

环球中医药２００９年３月第２卷第２期Ｇｌｏｂａｌ　Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｍａｒｃｈ　２００９，Ｖｏ１．２，Ｎｏ．２　活血药对血管紧张素Ⅱ致心肌肥大细胞内　钙浓度变化的影响　

郭自强　王硕仁朱陵群牛福玲吴呖黄启福　【摘要】　目的研究活血药丹参素和川芎嗪对血管紧张素Ⅱ诱导的乳鼠心肌细胞内和心肌成　纤维细胞内钙离子浓度的影响，探讨其抑制心肌肥大的作用机理。方法应用Ｆｕｒａ一３荧光染料，用　流式细胞仪检测乳鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞内钙离子浓度。结果ＡｎｇⅡ可明显增加心肌细　胞和心肌成纤维细胞内钙离子浓度，并随着时间的延长，于第５天其浓度达到高峰，然后下降，洛沙　坦（Ｌｏｓａｒｔａｎ）明显抑制其心肌和心肌成纤维内钙离子浓度的增加；研究显示丹参素和川芎嗪不仅明　显抑制血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞内钙离子浓度的升高，同时也明显抑制血管紧张素Ⅱ诱导心肌　成纤维细胞内钙离子浓度的升高。结论丹参素和ＪｌＩ芎嗪不仅明显抑制血管紧张素Ⅱ诱导心肌细　胞内钙离子浓度的升高，同时也明显抑制血管紧张素Ⅱ诱导心肌成纤维细胞内钙离子浓度的升高，　表明丹参素和川芎嗪可能具有钙拮抗剂的作用，抑制血管紧张素Ⅱ所介导引起细胞内钙离子升高，　从而抑制心肌细胞肥大和心肌成纤维细胞增殖。　【关键词】　活血药；丹参素；川芎嗪；心肌细胞；　心肌肥厚；钙离子浓度　【中图分类号】Ｒ２８５．５　【文献标识码】Ａ　【文章编号】１６７４—１７４９（２００９）０２—００９９～０３　

Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｄｒｕｇｓ　ｆｏｒ　ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ　ｂｌｏｏｄ　ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　ｏｎ　Ｃａ　ｉｎ　ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　ｆｉ－　ｂｒｏｂｌａｓｔ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎⅡ　ＧＵＯ　Ｚｉ—ｑｉａｎｇ，ＷＡＮＧ　Ｓｈｕｏ—ｒｅｎ，ＺＨＵ　一ｑｕｎ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｐａｒｔ—　ｍｅｎｔ　ｏｆｉｎｔｅｒｎａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｄｏｎｇｆａｎｇ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｅｉｊｉ￣ｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｅ０／ｎｇ　１０００７８．　ｉｎａ　【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　Ｄａｎｓｈｅｎｓｕ　ａｎｄ　Ｌｉｇｕｓｔｒａｚｉｎｅ，ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃ—　ｔｉｖｅ　ｆｒａｃｔｉｏｎｓ　ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｈｅｒｂａｌ　ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ　ｗｉｔｈ　ｄｒｕｇｓ　ｆｏｒ　ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ　ｂｌｏｏｄ　ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，ｏｎ　Ｃａ　ｉｎ　ｎｅｏｎａｔａｌ　ｍｉｃｅ’ｓ　ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ　ｌＩ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｃａ２　ｉｎ　ｍｙｏｃａｒｄｉ—　

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成年SD大鼠心肌细胞分离及其胞内钙离子动态变化测定（作者： _________ 单位： ___________ 邮编：___________ ）【摘要】目的：建立稳定的成年SD大鼠心肌单细胞分离方法，并对心肌细胞内Ca2+动态变化进行测定。

方法：用改进的Langendoff装置，行大鼠主动脉插管逆向灌流（温度、pH、水质恒定），用混合液（0.6mg/mL胶原酶H+0.06mg/mL蛋白酶+1mg/mL牛血清白蛋白）消化心脏，经3次不同浓度含钙台式液复钙后得到钙稳态心肌细胞；室温静置1〜2h后于激光共聚焦显微镜下测定Ca2+的动态变化。

结果：得到70%〜90%长杆状活细胞，钙稳态心肌细胞可占40%〜60% ; fluo_4 AM负载染色后可记录到典型的诱发钙瞬变。

结论：胶原酶和蛋白酶混合液主动脉逆向灌流方法可以得到具有正常生理功能的钙稳态心肌细胞，可用于心肌细胞内钙信号研究。

【关键词】大鼠心肌细胞细胞分离激光共聚焦显微镜Cardiomyocyte Isolation from Adult SD Rat Heart for Con focal Microscopic In tracellular Ca2+ Imagi ng[Abstract ] Objective: To develop a stable method for adultSD rat sin gle cardiomyocyte isolati on , and the n to determ ine thein tracellular Ca2+ sig nalli ng by con focal imagi ng. Methods: Rat heart was digested by aorta retrograde perfusion with mixture[collagenase 11(0.6 mg/mL), pronase(0.06 mg/mL)and bovine serum albumin(1 mg/mL) ] using a modified Langendorff system. The temperature, pH and water quality should be properly con trolled in the process of digested rat heart. Three times of re_calcificati on with differe nt concen trati on of Ca2+ Tyrode soluti on were used to procure calcium homeostasis ven tricular cardiomyocytes. Sin gle cell was used for con focal microscopic Ca2+ imaging after storage at room temperature for 1~ 2 hours. Results: There were about 70% ~ 90% rod_shaped fresh viable cells, in which 40% ~ 60% were calcium homeostasis cells. In single calcium homeostasis cardiomyocytes calcium transients could be evoked by a stimulator and recorded with an LSM510 con focal microscopic system after in cubati on with fluo_4 AM. Conclusion: Aorta retrograde perfusion with collagenase II and pron ase is a proper method to procure sin gle calcium homeostasis cardiomyocytes from adult SD rat with normal physiological features, and fit for con focal microscopic Ca2+ imagi ng.[Key Words ] rat; cardiomyocyte; cell isolation; laser scanning con focal microscopy随着心脏疾病研究的不断发展，具备正常生理功能的单个心肌细胞已成为研究心脏代谢、功能、病理生理机制的重要基础，心肌细胞内钙离子浓度（［Ca2+ ］i）变化是一系列心脏疾病的诱因及病理基础。

激光扫描共聚焦显微镜的应用，可使人们对活细胞的多种功能进行直接的观察和精确的动态分析，其中对心肌细胞内［Ca2+ ］i变化的动态检测即为主要应用之一］1〜3 ］。

本文主要探讨心肌单细胞的分离方法并用激光共聚焦显微镜和fluo_4 AM负载方法检测分离所得心肌细胞内Ca2+的动态变化，为心肌细胞内钙信号研究及其系列研究工作奠定基础。

1材料与方法1.1动物与试剂实验动物：清洁级成年SD大鼠（广州南方医科大学实验动物中心提供）65只，雌雄不拘，体质量200〜300g。

主要试剂：胶原酶H（277u/mg,lnvitrogen 公司，美国），蛋白酶（5.8u/mg）、牛磺酸、牛血清白蛋白（BSA）、HEPES（Sigma 公司，美国），fluo_4 AM（Molecular Probes 公司，美国），其余试剂为国产AR试剂。

1.2溶液组成及配制1.2.1 台式液（mmol/L，用NaOH 调节pH 7.35 〜7.45） NaCl 136.9，KCl 5.4，CaCl2 1，MgCl2 1，NaH2PO4 1，HEPES 10，Taurine 10，D_glucose 11.11.2.2 无钙台式液（mmol/L，用NaOH 调节pH 7.35 〜7.45）NaCI 136.9 , KCI 5.4, MgCI2 1 , NaH2PO4 1, HEPES 10,Taurine 10, D_glucose 11.11.2.3酶液胶原酶H液+蛋白酶液（酶液A）:取无钙台式液25mL 加入胶原酶H液15mg、蛋白酶液1.5mg混匀并用0.22呵滤器过滤。

胶原酶H液（酶液B）:取无钙台式液15mL加入胶原酶H液9mg混匀并用0.22 口滤器过滤。

1.2.4复钙液复钙液A :取无钙台式液加入CaCl2至0.1mmol/L , BSA至1mg/mL。

复钙液B :取无钙台式液加入CaCl2 至0.5mmol/L。

BSA至1mg/mL。

复钙液C :取台式液加入BSA至1mg/mL。

1.3细胞分离腹腔注射戊巴比妥钠（40mg/kg）麻醉后，无菌状态下迅速开胸摘心，并置于4C左右无钙台式液中清洗血污，剪除多余脂肪组织及修剪主动脉长度，立即行主动脉插管（深度不可超过主动脉瓣），将心脏挂于Langendorff装置下，用丝线结扎固定：首先用台式液灌流，可见心脏恢复跳动，从而排清心房、心室及血管内残留血液，2min 后换无钙台式液灌流，当心脏停止跳动且滴下灌流液体大致为无色后换用酶液A灌流；单向灌流约2min后改为循环灌流20 ~ 30min ;剪下心室（心脏下1/3），在预置含37 C 5〜7mL酶液B的三角瓶中剪碎，37 C恒温摇床60次/min摇匀消化5min ;吸取上层细胞悬液，500r/min离心1min。

弃上清液后加入复钙液 A 5mL静置复钙15min（使心肌细胞自然沉降）；弃上清液后加入复钙液B 5mL静置复钙15min ;弃上清液后加入复钙液 C 5mL静置复钙15min ;弃上清液并加入台式液静置室温1〜2h后即可负载fluo_4 AM Ca2+荧光染料染色应用于LSM510 META 型激光共聚焦显微镜（Carl Zeiss公司，德国）下心肌细胞内Ca2+动态测定。

剩余酶解的心室组织残渣可重新加入酶液B重复上述操作。

灌流消化过程中维持7.5〜10.0kPa的压力］4］,所有液体均用0.22 g滤器过滤除菌且用体积分数95%的O2+体积分数5%的CO2混合气体饱和，灌流温度保持在35 C,实验室温度保持在20〜30 C。

2结果2.1心肌单细胞的形态学观察具备正常生理功能的单个心肌细胞呈长杆状或条柱状或矩形，横纹清晰（图1，封2），且对锥虫蓝拒染。

置于台式液中处于静息状态的即为钙稳态心肌细胞，偶见自发收缩；若持续自发收缩则表示胞内钙稳态失衡，提示细胞处于濒死状态。

采用本方法可得40%〜60%钙稳态心肌细胞。

死亡及损伤严重的细胞呈团块状或可见大量颗粒，并被锥虫蓝染色。

2.2心肌单细胞的钙瞬变将分离好的心肌细胞与fluo_4 AM ［孵育浓度（10〜15）也mol/L ］孵育15min，弃上清液去除细胞外Ca2+荧光染料后加入台式液，孵育好染料的细胞置于共聚焦显微镜的载物台上，显微镜配置为：波长488nm的氩激光，40倍、1.3NA的油浸镜头；共聚焦成像采用面扫描方式，可得到静息心肌细胞内Ca2+分布图（图1，封2）。

在线扫描方式下，通过触发连接可使SEN_7203型电子刺激器与LSM_510型共聚焦显微镜同步工作得到心肌细胞的诱发钙瞬变图像（图2，封2）: 5］。

3讨论自Powell等［6］于1976年首先成功分离出单个钙耐受成熟心室肌细胞以来，几十年间研究者一直为提高良好心肌细胞获得率和减低细胞的钙异常而不懈探索。

心肌细胞分离的每一步都对最终分离的细胞状态产生重要的影响。

实验室温度、Langendorff装置设定温度、心脏摘取速度、水质、溶液的pH值、酶的活力及浓度、操作者的熟练程度等都可影响心肌细胞状态，不利于激光共聚焦显微镜下心肌细胞内Ca2+动态变化的测定。

本研究的结果表明四步法是分离心肌细胞的较好方法①灌流台式液使离体心脏恢复跳动从而排除心腔及心脏冠状动脉系统内的残留血液；②灌流无钙台式液以消减心肌细胞间Ca2+依赖的紧密连接，有助于细胞外基质的解离［7］③灌流酶液A : 8］④停止灌流剪取心室肌组织，剪碎后加入酶液B再次消化5min可使细胞间连接消化更完全，从而得到游离的杆状细胞。

分离心肌细胞时酶消化的终止时间很重要，消化酶的浓度过高及消化时间过长都可造成细胞膜不可修复的损害[9]。

有报道认为当心脏颜色变黄，表现较松弛时终止酶消化较合适 [7]。

我们的经验是：酶消化持续20〜30min时，心脏呈浅白色，用眼科镊夹持感觉较软，且滴下的灌流液可见单个心肌细胞，此时终止消化较合适。