激光共聚焦扫描显微镜技术在大鼠皮层神经元细胞内钙离子浓度动态测定中的应用

第36卷第1期Vol.36 No.l 2021年02月Feb. 2021汕头大学学报(自然科学版)Journal of Shantou University (Natural Science)文章编号：1001 - 4217(2021 )01 - 0076 - 06激光共聚焦扫描显微镜观测自噬小体变化的应用张冰娜*,叶丹彦，张丹桂，李璐，杨旅军（汕头大学医学院第二附属医院转化医学研究中心，广东汕头515041）摘要文章探讨激光共聚焦扫描显微镜技术在检测低氧诱导小鼠心肌细胞损伤自噬小体 变化的应用价值.在无菌条件下，取胚胎型小鼠心肌细胞备用.采用低氧环境+缺氧液方法 诱导心肌细胞损伤并发生自噬现象作为实验组，正常环境下培养细胞的方法作为对照组.待 心肌细胞长到一定程度后，分别利用激光共聚焦扫描显微镜和正置荧光显微镜对免疫荧光 染色的自噬小体表达的LC3A/B 蛋白情况进行观测并比较2种检测方法的优缺点.结果显示 利用低氧环境+缺氧液方法诱导小鼠心肌细胞损伤并自噬小体形成是可行的.与正常对照组 比较，低氧缺氧诱导小鼠心肌细胞损伤组（实验组）自噬小体呈高表达状态.与普通型正置荧 光显微镜比较，激光共聚焦扫描显微镜成像速度快，一次可以获得多副图像且图像清晰.激 光共聚焦扫描显微镜技术具有成像速度快、灵敏度高和精确度高等优点，可以实时、准确 观测低氧诱导小鼠心肌细胞损失自噬小体的表达情况,具有重要临床应用价值.关键词激光共聚焦扫描显微镜；正置荧光显微镜；自噬小体中图分类号TN24 文献标识码A心血管疾病是世界范围内危害人体健康的重要疾病，其中心肌梗死是心血管疾病的 最常见疾病之一•在中国，心血管疾病的发病率和死亡率逐年升高，且呈现年轻化趋势, 严重危害着人们的健康，给社会和家庭带来了巨大的经济和精神负担•研究报道叫心 肌细胞损伤时细胞自噬参与疾病的整个过程并发挥着重要作用•细胞自噬（autophagy ）是 指细胞应对外部环境变化时的一种代谢方式，在基础状态下自噬水平较低，用于维持内 环境的稳态和细胞存活；在缺血缺氧条件下，细胞能量或营养供应不足，导致细胞自噬 被显著激活，激活的自噬小体可用于清除损坏的细胞器或侵入的病原体，广泛参与各种 病理生理过程玖然而，其他研究指出缺血再灌注导致的细胞自噬过度激活，不利于心 肌细胞存活网因此，准确观测细胞自噬小体的变化情况对于理解心肌损伤机制并及时 作出正确干预具有重要临床意义•目前,普通型正置荧光显微镜由于其高分辨率被广泛用于对样品结构和组成成分进 行定位和定性检测•然而，正置显微镜技术存在成像速度慢、精确度有限及荧光散射伪收稿日期：2020-09-23作者简介：张冰娜（1988-）,女（汉族），广东汕头人，助理实验师.研究方向：医学生物细胞学.E-mail : 120853641********.基金项目：高水平大学建设计划临床医学重点建设学科专项资金（粤教科函（2018）181号）第1期张冰娜等：激光共聚焦扫描显微镜观测自噬小体变化的应用77影重等不足.激光共聚焦扫描显微镜(laser confocal scanning microscope,LCSM)作为一种先进的细胞分析仪器，具有高精确度、高分辨率、高灵敏性以及高放大倍数等特性,可以在细胞层面对样本进行断层、逐点、逐行和逐面等快速扫描成像，在生物医学中具有广泛应用价值叫因此，本研究旨在利用激光共聚焦扫描显微镜技术检测低氧诱导小鼠心肌细胞损伤自噬小体变化情况.1材料与方法1.1主要仪器和试剂仪器：激光共聚焦扫描显微镜(LeicaTCSSPE),正置荧光显微镜(OLYMPUS BX51).试剂：含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基(美虱Gibco),0.25%胰蛋白酶，1倍的磷酸盐缓冲液(PBS).细胞：胚胎小鼠心肌细胞.1.2低氧缺氧诱导小鼠心肌细胞自噬小体形成将小鼠心肌细胞消化后接种于铺有盖玻片的六孔板中.待细胞长至80%,低氧诱导组换成缺氧液，于1%02和5%CO2三气培养箱培养3h后复氧1h.1.3免疫荧光染色将低氧缺氧诱导组和对照组的培养基去除干净，PBS洗3次，3min/次.加入4%多聚甲醛固定20min,PBS洗3次，3min/次.加入0.1%TritonX-100透化15min,PBS 洗3次，3min/次.加入山羊血清工作液封闭20min,去除血清，加入稀释的LC3A/B 一抗(1:250,Cell Signaling Technology#4180)4°C孵育过夜.用PBS洗3次，3min/次，避光加入稀释的山羊抗兔荧光二抗(1：500,碧云天，Alexa Fluor488标记山羊抗兔IgG (H+L))37WWlh,用PBS洗3次，3min/次，加入DAPI工作液细胞核衬染(碧云天，Irving Blue(0.5%,SIGMA)细胞浆衬染，PBS洗净后，镜检.(见表1)表1免疫荧光染色结果低氧缺氧诱导组对照组低氧缺氧对照组氯唾抑制阳性组正常阴性组诱导组氯唾抑制阳性组正常阴性组一抗+++---二抗+++++4-注：低氧缺氧诱导组为实验组，氯摩抑制组作为阳性对照组，未做任何处理的正常细胞作为阴性对照组；+为加入抗体，_为不加入抗体1.4应用激光共聚焦扫描显微镜和正置荧光显微镜对图片进行采集激光共聚焦扫描显微镜(Leica TCS SPE)采集：Alexa Fluor488激光激发波长：480〜495nm；Irving Blue激光激发波长：543~575nm；DAPI激光激发波长359nm.同时采集绿色、红色、蓝色以及三色叠加图•正戦光显微镜(OLYMPUS BX51)采集：选择荧光滤镜：1-DAPI、2-FITC,3-Rhod,78汕头大学学报（自然科学版）第36卷分别采集蓝色、绿色、红色图像，然后通过软件将3图进行合并.2结果2.1低氧缺氧诱导小鼠心肌细胞自噬小体形成细胞在氯座抑制下出现了明显的自噬小体•利用低氧环境+缺氧液方法诱导小鼠心肌细胞损伤并自噬小体形成是可行的•与正常对照组比较，低氧缺氧诱导小鼠心肌细胞损伤组自噬小体呈高表达状态.2.2正置显微镜和激光共聚焦显微镜检测自噬小体表达情况的差异正置显微镜和激光共聚焦显微镜检测自噬小体表达情况如图1（见封3）.自噬小体分泌的抗原可以与Alexa Fluor488标记的LC3A/B抗体结合，呈现绿色；DAPI衬染细胞核为蓝色；Irving Blue衬染细胞浆呈红色；3者叠加图（Merge）可清晰观察自噬小体在心肌细胞内的位置及表达情况•与正置显微镜比较，激光共聚焦显微镜成像速度快，图像清晰及灵敏度高.3讨论细胞自噬是真核细胞内一种非常重要的生理过程，主要通过亚细胞膜结构的变化并经溶酶体介导对细胞内的细胞器、蛋白质和膜磷脂进行降解，维持细胞合成和代谢的平衡，进而维持细胞内环境的稳定•本实验结果发现低氧缺氧诱导小鼠心肌细胞损失可以引起自噬小体高表达，与既往类似研究适度刺激引起的细胞自噬作用对缺氧心肌细胞具有一定保护作用的结果基本一致旦细胞自噬起始于自噬小体的形成，当细胞自噬被激活时，自噬小体表达的LC3发生膜型转化，主要分布在细胞膜上；细胞自噬未被激活时，LC3仍停留在细胞浆内，呈散在块状分布阿现在普遍观点认为,在心肌病变早期细胞自噬被认为是一种保护性机制•然而，有研究指出过度激活细胞自噬，不利于心肌细胞的存活孔因此，快速准确检测细胞自噬时自噬小体的表达情况对于指导临床干预具有重要应用价值.免疫荧光法是目前检测自噬小体的常用方法，主要仪器包括普通正置荧光显微镜和激光共聚焦扫描显微镜•普通正置荧光显微镜由于操作方便、费用低和仪器比较普遍等特点被广泛应用于实验研究•然而，正置荧光显微镜在使用过程中只能局限于单个波长拍照，之后再合并不同通道的图像，存在成像速度慢等缺点.另外，正置荧光显微镜会随着次级荧光的干扰，使图像清晰度下降，同时也会受曝光时间、增益影响，出现不同荧光染料的交叉干扰，无法在需要高灵敏度的实验中获取精确图像叫除此之外，正置荧光显微镜需要人肉眼观察得出结果，存在主观因素的干扰，无法客观准确地对自噬小体的位置和含量进行评估.激光共聚焦扫描显微镜作为一种先进的荧光成像技术，主要利用激光作为扫描光源，采用光源针孔与检测针孔共辄聚焦技术，对样本进行快速的点、线或二维图像成像R叫由于激光束的波长较短，光束很细，其分辨率大约是普通光学显微镜的3倍.另外，激光共聚焦扫描显微镜不仅可以通过多通道荧光捕获技术同时第1期张冰娜等：激光共聚焦扫描显微镜观测自噬小体变化的应用79获取多标记荧光图像，减少多色荧光之间的波段叠加，抑制图像的模糊；还可以与其他多种先进技术兼容达到联合应用的目的叫总之，激光共聚焦扫描显微镜已成为分子生物学、形态学、细胞学、药理学和遗传学等领域强有力的研究工具.随着科学研究的不断深入，激光共聚焦扫描显微镜在细胞结构㈣、核酸及蛋白质问、细胞内自由基活性四、细胞内钙离子浓度变化问、膜电位网等生命科学研究中发挥重要的作用•近年来，新开发的高速活细胞双转盘式共聚焦系统进一步提高了检测的灵敏度、图像的采集速度，同时降低了光毒性•因此，激光共聚焦扫描显微镜具有检测速度快、灵敏度高、定位精确和多色荧光成像等优点，可以直接探测活细胞在化学因子、细胞因子或激素等作用下所致的离子细微动态变化,是目前检测自噬小体变化的最为先进仪器之一.参考文献[1]李伟愍，自噬增强对缺氧心肌细胞活性的影响[J].中国现代药物应用，2020(15)：242-244.[2]WANGM,LI Y J,DING Y,et al.Silibininprevents autophagic cell death upon oxidative stress in corticalneurons and cerebral ischemia-reperfusion询ury卩].Mol Neurobiol,2016,53:932-943.⑶曹原，沈涛，黎健，应激状态下的心脏自噬：自噬作用是有益还是有害？[J].生理科学进展，2015(4)：309-313.[4]武美娜，李新毅，白玮，等.激光共聚焦扫描显微镜技术在大鼠皮层神经元细胞内钙离子浓度动态测定中的应用[J].中国药物与临床，2008(7)：530-532.[5]浦延鹏，周佳明.当归挥发油对缺氧/复氧损伤大鼠心肌细胞H9C2自噬的调控作用研究[J].中国药房，2020(31)：2492-2497.[6]杨侃，李晓宁，GIDEON O,等.一种优化小鼠成纤维细胞中自噬小体示踪的方法[J].中国组织化学与细胞化学杂志，2017,26(1)：65-71.[7]于湘华，刘超，柏晨，等.光片荧光显微成像技术及应用进展[JJ.激光与光电子学进展，2020(57)：9-23.[8]ADRIANA IM,CONSTANTIN C,MIHAI L,et al.Current and future applications of confocal laserscanning microscopy imaging in skin oncology[J].Oncology letters,2019,17(5)：4102-4111.[9]郑易，楼永良.激光扫描共聚焦显微镜技术在医学院校创新型实验教学中的应用[J].温州医科大学学报，2020,50(10)：859-860.[10]吴伟全，王思捷，李元歌，等.激光扫描共聚焦显微镜及透射电镜观察肺癌A549细胞亚细胞结构溶酶体的对比分析[J].临床医学工程，2013(6)：666-66&[11]杨怡姝，王小利，沈思嗣，等.激光扫描共聚焦显微镜原位检测核酸及蛋白质的实验教学设计[J].实验技术与管理，2011,28(2)：58-60.[12]廖钢陵，吴元德.超氧阴离子自由基对大鼠肝卵圆细胞胞内自由钙浓度的影响[J].基础医学与临床，2000(4)：79-81+90.[13]刘洋，王丽婷，冉海莹，等.激光共聚焦显微镜检测双酚A损伤精母细胞后钙离子的浓度变化[J].科学咨询(科技•管理)，2017(23)：60-61.[14]林元相，徐如祥，姜晓丹，等.激光共聚焦扫描显微镜动态观察体外培养大鼠皮层神经元受氯化亚铁作用时过氧化物水平及膜电位的变化[J].中国临床康复，2006,10(17)：45-48+195.80汕头大学学报（自然科学版）第36卷Application of Laser Confocal ScanningMicroscope in Observing AutophagyZHANG Bingna,YE Danyan,ZHANG Dangui,LI Lu,YANG Lvjun(Research Center of Translational Medicine,Second Affiliated Hospital ofShantou University Medical College,Shantou515041,Guangdong,China)Abstract To investigate the application value of laser confocal scanning microscopy(LSCM)in detecting the changes of autophagy bodies in hypoxic-induced myocardial injury in mice.Under aseptic condition,cardiomyocytes of embryonic type mice were taken for standby.The experimental group was treated with hypoxic environment and hypoxia solution to induce myocardial cell injury and autophagy,and the control group was cultured in normal environment.After the cardiomyocytes grew to a certain extent,the LC3A/B protein expression of autophagosome was observed by laser confocal scanning microscope and forward fluorescence microscope,respectively. The advantages and disadvantages of the two methods were also compared.It is feasible to induce myocardial cell injury and autophagy in mice by hypoxia environment and hypoxia pared with the normal control group,the autophagy of the mice myocardial cell injury group(experimental group)was highly pared with the normal fluorescent microscope,the laser confocal scanning microscope has a fast imaging speed,and can obtain multiple images at a time and the image is ser confocal scanning microscope has the advantages of fast imaging speed,high sensitivity and high accuracy.It can be used to observe the expression of autophagy in mice cardiomyocytes induced by hypoxia in real time and accurately,and has important clinical application value.Keywords laser confocal scanning microscope;fluorescence microscope;autophagosomes8正置荧光显微镜Irving BlueLC3A/BDAPI Merge(A)激光共聚焦显微镜LC3A/B Irving BlueDAPI Merge(B)（A）正置显微镜在（40x10）倍时显示自噬小体欠清晰；（B）激光共聚焦显微镜在（40x10）倍时可清晰显示自噬小体在细胞内的位置及含量变化。

采用激光共聚焦显微术研究大鼠视神经细胞的空间结构激光共聚焦显微术（Laser Scanning Confocal Microscopy，简称LSCM）是一种高分辨显微成像技术，应用非常广泛。

在生物医学领域里，LSCM被广泛用于分析各种不同类型的细胞形态和结构，尤其是神经元和神经元网络的形态构造，新陈代谢活动及局部分布的微环境。

在研究大鼠视神经细胞的空间结构和功能方面，LSCM是一项特别有用且有效的成像技术。

LSCM扫描方式通过聚焦高功率激光束，将细胞或组织成像并用光学器件收集产生的荧光信号，随着显微镜小孔的扫描，可以在横截面上地重建细胞空间结构，三维实体内部的显微成像。

这种高分辨技术就足以将细胞细小的亚结构、细胞类型、分子运动和元素的分布清晰地呈现出来，同时可以提供令人惊叹的时间分辨图像，从而使组织学家和细胞学家获得高分辨的空间动态成像技术来研究神经元的复杂运作。

大鼠视神经是连接眼球和大脑的，车轴体和轴突形成的头部神经的一条。

视神经是传输视觉信息的主要路径之一，在神经科学和眼科生物医学领域，对视神经的研究一直受到广泛的关注。

现代医学的发展，使得我们能够对视神经进行非常细致的分析，然而，收集这些信息的方法仍然考验着科学家的能力。

LSCM在神经科学研究中的应用，尤其是在研究视神经的空间结构中发挥了重要作用。

神经元感受信息并在神经元细胞的轴突上传递信息，我们知道轴突的空间结构对于信息传递和整合具有重要作用，因此研究神经元空间结构可以更好地理解神经元的整体功能。

大鼠视神经分布着许多神经元细胞，其中的结构和功能复杂多样。

因此，使用LSCM技术，可以通过3D实体成像技术，详细呈现出这些神经元细胞细微的结构，从而更好地研究它们的运作。

从LSCM图像中，可以获得大量分辨率较高的显微图像，从而获得大量的神经元亚结构信息。

利用线探针针对神经细胞进行染色后，通过LSCM可以建立3D数字模型，更好地理解神经元空间结构与运作的关系。

共聚焦激光扫描显微镜及其在神经科学研究中的应用庄正飞;刘智明;郭周义;刘颂豪【期刊名称】《中国医学物理学杂志》【年(卷),期】2011(028)001【摘要】目的:共聚焦激光扫描显微镜(confocal laser scanning microscopy,CLSM)是一种新兴的显微图像检测技术,能够进行光学切片、活体检测、三维重构等,并且能够获得较之普通光学显微镜更高的空间分辨率.本文旨在讨论CLSM及其在神经科学中的应用.方法:通过大量调研文献,从细胞、亚细胞及分子水平上详细阐述了CLSM在神经科学领域中的应用.结果:相比传统光学显微镜,CLSM更适合在神经科学的细胞等层次上进行成像和活体观测试验.结论:CLSM 作为一种精密的观察工具,已广泛应用于神经科学研究,为推动神经科学的发展做出了贡献.新的双光子共聚焦显微镜由于其自身的优点在神经科学研究中将具有很大的发展空间.【总页数】4页(P2441-2443,2451)【作者】庄正飞;刘智明;郭周义;刘颂豪【作者单位】华南师范大学,生物光子学研究院,广东,广州,510631;华南师范大学,生物光子学研究院,广东,广州,510631;华南师范大学,生物光子学研究院,广东,广州,510631;华南师范大学,生物光子学研究院,广东,广州,510631【正文语种】中文【中图分类】Q-3【相关文献】1.激光共聚焦显微镜在神经科学研究中的应用 [J], 王有琼;郑晓克;张海鹏;杨小晓;乐亮2.认知神经科学研究中神经功能成像和神经电生理技术的应用进展 [J], 刘超;韩建阁3.共聚焦激光扫描显微镜技术在研究大鼠海马神经元胞内钙超载中的应用 [J], 黄娅林;赵鹏;程介士4.膜片钳技术及其在神经科学研究中的应用 [J], 朱海军;丁冲;徐桂芝5.弥散张量成像在语言认知神经科学研究中的应用 [J], 乐秋海;舒华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

激光扫描共聚焦显微技术及其在神经、肿瘤相关研究中的应用张鹏;毕明刚【摘要】介绍了近年来新出现的共聚焦显微镜新的种类,如传统激光共聚焦和活细胞激光共聚焦,对其功能及在神经、肿瘤研究中的应用进行了综述,使现代显微镜能够更加深入研究和分析细胞的变化过程和结构.活细胞激光扫描共聚焦显微镜与双光子激光扫描共聚焦显微镜实现了对肿瘤、神经活细胞长时间地动态观测,可更加真实地揭示细胞凋亡的机制与规律.【期刊名称】《医疗卫生装备》【年(卷),期】2010(031)002【总页数】4页(P43-45,49)【关键词】激光扫描共聚焦;基因敲除;活细胞检测;凋亡【作者】张鹏;毕明刚【作者单位】150076,哈尔滨,啥尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心药物研究所博士后科研工作站;中国医学科学院药用植物研究所【正文语种】中文【中图分类】TH742.1激光扫描共聚焦显微镜经过30 a的发展已被广泛应用于形态学、分子生物学、神经科学、肿瘤药理学、遗传学等领域。

由最初的单一激光扫描共聚焦显微镜发展到现在的双光子共聚焦显微镜、多光子共聚焦显微镜、活细胞共聚焦显微镜等多种显微镜，以适应不同功能需要，为生命科学提供了更加有效的定性定量的细胞测量工具。

激光扫描共聚焦显微镜尤其在研究细胞凋亡机制和神经疾病相关蛋白定位中发挥着重要作用，通过激光共聚焦显微镜可检测到与神经疾病相关的蛋白分布情况，以及肿瘤细胞中各种凋亡相关蛋白表达的变化。

激光共聚焦显微镜在一定程度上推动了神经科学及抗肿瘤药物作用机制的研究。

下面仅对近年来新出现的共聚焦显微镜新的种类、功能及其在神经、肿瘤研究中的应用进行简要综述。

1 激光扫描共聚焦1.1 传统激光共聚焦激光共聚焦显微镜技术已经成为光学显微镜发展应用中最重要的一种手段。

在常规的宽视野光学荧光显微镜中，样本发射的继发性荧光在物镜焦平面上黯淡不清[1]，使一些细节丢失。

共聚焦显微镜改善了中轴（Z轴:平行于显微镜视轴）和侧平面（X轴和Y轴:样品平面的维度）的光学分辨率，并且能够减少在成像过程中由样品在焦平面中产生的继发性荧光。

激光共聚焦显微镜的使用和应用激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，简称LSCM）是一种在生物医学领域应用十分广泛的高分辨率显微镜技术。

相比传统的荧光显微镜，LSCM独特的成像原理和功能使其在细胞生物学、生物医学研究以及材料科学等方面具有非常重要的应用。

LSCM使用的原理是激光扫描和共聚焦。

首先，通过激光光源发出的单色激光束照射样品，并经过镜片的调焦使得激光聚焦于单个样品点上。

样品中的物质吸收或发射荧光，在共焦点由反射镜反射回来，进入到光学检测系统中，并通过光学系统传达给光电倍增管，再由电信号转换为图像信息。

通过光学透镜逐点扫描整个样品，构建出样品的二维或三维图像。

LSCM相比传统显微镜具有以下几个优点：1.高分辨率：借助共焦技术，可以消除背景杂乱的荧光，只能检测到焦点附近的物质，因此在图像质量上表现出非常高的分辨率。

2.光学切片：可以通过调整镜片的焦距，只聚焦在感兴趣的层面上，可以在三维空间内获得细胞、组织的立体结构信息。

3.高亮度和低光毒性：由于采用单光子激发方式，LSCM提供了高亮度、低光毒性和低伤害的成像模式，可以更好地保护生物样品。

LSCM在生物医学领域的应用非常广泛：1.细胞观察与研究：LSCM可以观察到细胞的三维结构、蛋白质、DNA、RNA等生物分子标记，并通过共焦显微镜的三维成像技术，对细胞内的致病因子和细胞的活动过程进行实时观察和分析，从而揭示细胞的功能和机制。

2.分子定位和交互：通过标记荧光分子，LSCM可以实现对分子在细胞内的定位和相互作用的观察，如蛋白质的定位、互作关系等。

通过这些观测，可以更好地了解分子间的相互作用以及其在细胞功能和疾病发展中的作用。

3.组织学研究：LSCM在组织学研究中可以提供更高分辨率的图像，可以观察到组织的细胞构成、细胞外基质和多种细胞标志物等。

这对于了解组织结构与功能的关系，以及细胞增殖、细胞死亡等生理过程具有重要意义。

成年大鼠心肌细胞高效激光共聚焦显微镜钙成像方法赵永星;隗和明;卢君;张广钦【摘要】目的建立高效易行的测定心肌细胞钙成像方法.方法 Langendorff灌流获取成年大鼠心室肌细胞.大鼠心肌细胞经Fluo-4染色后分别加入玻璃底的6孔培养板中,连接Ion C-Pace EP 刺激器,于激光共聚焦显微镜下测定胞内钙离子浓度的动态变化.结果约80%的细胞跟随所设频率规律的收缩.激光共聚焦显微镜记录到与刺激器频率相同的有规则的细胞钙瞬变.加入咖啡因后钙释放增加,提示此为钙库的钙释放.结论利用新型的刺激装置,结合激光共聚焦显微技术,我们成功地获得了高效易行的成年大鼠心肌细胞Ca2+成像方法.此法也可用于其他实验动物心肌细胞,易于记录细胞内钙离子浓度的动态变化.【期刊名称】《中国现代药物应用》【年(卷),期】2013(007)008【总页数】3页(P5-7)【关键词】大鼠;心肌细胞;C-Pace EP 刺激器;Ca2+成像;激光共聚焦显微镜【作者】赵永星;隗和明;卢君;张广钦【作者单位】210009,中国药科大学临床药理教研室【正文语种】中文心肌细胞内的钙调控(Calcium handling)对于维持心脏和心肌细胞的正常生理功能有着重要作用。

钙调控失常见诸于几乎所有的先天和后天的人类心脏病变，如心脏衰竭，心肌肥厚等［1］。

钙成像(Calcium imaging)是目前最为有效的检测细胞内钙调控的技术，钙离子荧光指示剂(Fluorescence calcium indicators)如Fluo-4 AM可以随 Ca2+离子的结合而改变其荧光特性。

激光共聚焦显微技术(Laser confocal microscopy)以其高分辨的优势，可以提供更好的细胞内钙离子浓度动态变化的图像，包括钙瞬变和钙火花［2］。

在成年动物的心室细胞中，为了观察细胞钙释放特征，我们常用刺激诱发心肌细胞的钙释放。

然而，使用传统的刺激器［3］(如YSD-4GA型生理实验多用仪)诱发心肌细胞搏动时，需在培养皿两端中放置正负两电极于心肌细胞两端(图1)，但在操作时电极之间的距离不稳定，影响细胞收缩的刺激阈电压。

第37卷第6期2020年12月实验动物科学LABORATORY ANIMAL SCIENCEVol.37 No.6December 20204研究报告i光电结合检测大鼠原代神经元胞内钙离子浓度方法的建立刘丽娜许晴魏华李华薛奋勤薛冰(首都医科大学中心实验室，北京100069)摘要：目的利用电刺激结合转盘共聚焦显微镜检测胞内钙离子浓度变化：方法钙离子变化是神经元发挥功能的关键因素。

本实验利用荧光探针fluo-4A M标记钙离子，电刺激兴奋神经元，转盘共聚焦技术检测胞内荧光强度的快速变化。

结果成功制备了刺激电极，并结合转盘共聚焦系统检测到刺激前1〇%左右的原代神经元有自发的钙离子升高，电刺激后，胞内钙离子迅速上升，刺激结束后，仍有周期性的升高，但幅度降低。

结论电刺激结合转盘共聚焦检测到胞内刺激前后钙离子的快速变化=关键词：钙离子；电刺激；转盘共聚焦显微镜；神经元中图分类号：Q95-336 文献标识码：A文章编号：1006-6179(2020)06-0007-04I)O I;10. 3969/j.issn. 1006-6179.2020.06.002神经元内钙离子的作用贯穿了其生命周期的整 个生命过程，如转录、分化、信号的传导及递质的释放和凋亡等等。

体内钙离子发生变化会导致很多疾 病，而很多应激也会首先导致钙相关蛋白发生改变[1。

显微成像技术已经广泛的应用在科学研究中，神经荧光染料结合成像技术已经广泛应用到检测各种活细胞胞内的钙离子的变化[2°]。

在神经元 中，钙离子通过电压和配体门控通道产生的胞内钙离子变化最明显。

另外，细胞内储存的钙释放也会导致胞内钙离子升高。

神经元处于静息状态时，胞 内钙离子浓度为1〇〇〜200 nmol/L，在神经元受到刺 激后，膜去极化，钙离子通道打开，钙离子内流，胞内 钙离子迅速升高到原来的1〇〜1〇〇倍。

我们通过搭 建转盘共聚焦系统结合电刺激，并对神经元细胞中 的钙离子进行成像。