第7章 亲和层析

13
二、装GSH-Sepharose 4B柱
1. 清洗和装好层析柱，封闭出口； 2. 加入2 mL PBS； 3. 取1-2 mL GSH-Sepharose 4B，加入柱子中； 4. 打开柱子出口，使PBS缓慢流出。
注意：始终保持柱内的液面高于 GSH-Sepharose 4B
14
三、纯化目的蛋白
试剂名称 ddH2O
30% Acr-Bis（29:1） 1.5 mol/L Tris-HCl（pH6.8）
10%SDS TEMED 10%AP（最后加） 总体积
加液量 3.4 mL 0.86mL 0.62mL 50 uL 20 uL 50 uL 5.0 mL
29
实验步骤
5. 将胶板放入电泳槽，加入1×Tris-Gly电泳缓冲液， 轻轻拔掉梳子；
蛋白质的迁移速度只取决于分子大小。 在15-200 KD之间，蛋白质的迁移率和分子量
的对数呈线性关系： logMW=K-bm
22
23
连续系统：电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓 度相同。（电荷效应、分子筛效应）
不连续系统：缓冲液离子成分、pH、凝胶浓 度及电位梯度的不连续性。
（电荷效应、分子筛效应、浓缩效应）
4
原亲 理和
层 析
5
6
7
GSH-Sepharose 4B
8
GSH- Sepharose 4B
9
GSH-Sepharose 4B
10
亲和层析流程
11
第一部分 实验步骤
12
一、细胞破碎
3600 mL诱导的菌液，离心分装到12只50 mL 离心管，-20℃保存；（每个班用2管）
每管加30 mL PBS缓冲液，混匀； 超声3S，暂停5S，持续15 min； 4℃，10000 rpm，离心10 min； 取50 uL上清，作为纯化前的样品； 每组取3-5 mL上清液，上柱纯化。

亲和层析（一）原理亲和层析是一种吸附层析，抗原（或抗体）和相应的抗体（或抗原）发生特异性结合，而这种结合在一定的条件下又是可逆的。

所以将抗原（或抗体）固相化后，就可以使存在液相中的相应抗体（或抗原）选择性地结合在固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分开，达到分离提纯的目的。

此法具有高效、快速、简便等优点。

（二）载体的基本要求和选择理想的载体应具有下列基本条件：①不溶于水，但高度亲水；②惰性物质，非特异性吸附少；③具有相当量的化学基团可供活化；④理化性质稳定；⑤机械性能好，具有一定的颗粒形式以保持一定的流速；⑥通透性好，最好为多孔的网状结构，使大分子能自由通过；⑦能抵抗微生物和醇的作用。

可以做为固相载体的有皂土、玻璃微球、石英微球、羟磷酸钙、氧化铝、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素和琼脂糖。

在这些载体中，皂土、玻璃微球等吸附能力弱，且不能防止非特异性吸附。

纤维素的非特异性吸附强。

聚丙稀酰胺凝胶是目前的首选优良载体。

琼脂糖凝胶的优点是亲水性强，理化性质稳定，不受细菌和酶的作用，具有疏松的网状结构，在缓冲液离子浓度大于0.05Mol/L时，对蛋白质几乎没有非特异性吸附。

琼脂糖凝胶极易被溴化氢活化，活化后性质稳定，能经受层析的各种条件，如0.1Mol/L NaOH或1Mol/L HCl处理2h~3h及蛋白质变性剂7Mol/L尿素或6Mol/L盐酸胍处理，不引起性质改变，故易于再生和反复使用。

琼脂糖凝胶微球的商品名为Sepharose，含糖浓度为2%、4%、6%时分别称为2B、4B、6B。

因为Sepharose 4B的结构比6B疏松，而吸附容量比2B大，所以4B应用最广。

（三）试剂与配制1．Sepharose 4B2．CNBr（剧毒）3．抗原或抗体4．1Mol/L NaHCO3取NaHCO3 84.01g加水至1 000ml。

5．0.1Mol/L NaHCO36．2Mol/L NaOH7．0.01Mol/L pH7.4 PBS0.2Mol/L Na2HPO438.0ml0.2Mol/L Na2HPO4162.0mlNaCl 32.76g加水至4 000ml。

亲和层析原理和方法亲和层析是一种分析方法，通过利用物质之间的亲和性来分离和分析目标物质。

它基于物质之间的特异性亲和作用，通过将目标物质与具有亲和性的固相材料结合，实现目标物质的富集和分离。

亲和层析的原理是基于生物分子之间的亲和性。

在生物体内，许多分子之间存在着特定的亲和性相互作用。

例如，抗体与抗原之间的结合就是一种典型的亲和性相互作用。

利用这种亲和性原理，可以将含有特定抗原的样品与具有相应抗体的固相材料结合，然后通过洗脱的方式将目标物质从固相材料上分离出来。

亲和层析的方法包括亲和层析柱和亲和层析片。

亲和层析柱是将具有亲和性的固相材料填充在柱子中，样品通过柱子时，目标物质会与固相材料结合，非目标物质则通过柱子。

然后可以通过洗脱的方式将目标物质从固相材料上分离出来。

亲和层析片则是将具有亲和性的固相材料固定在薄膜上，样品与薄膜接触时，目标物质会与固相材料结合，非目标物质则被排除。

然后可以通过洗脱的方式将目标物质从薄膜上分离出来。

亲和层析方法具有许多优点。

首先，亲和层析可以选择性地富集目标物质，从而降低了样品中其他干扰物质的影响。

其次，亲和层析具有高灵敏度和高分辨率的特点，可以检测到低浓度的目标物质。

此外，亲和层析还具有快速、简单和可重复性的优点，适用于大规模的样品分析。

亲和层析在许多领域中得到了广泛的应用。

在生物医学领域，亲和层析可以用于分离和富集特定蛋白质或生物分子，以便进行后续的分析和研究。

在药物研发中，亲和层析可以用于筛选和分离具有特定药物靶点亲和性的化合物。

在环境监测和食品安全领域，亲和层析可以用于检测和分离目标污染物或有害物质。

亲和层析是一种基于亲和性相互作用的分析方法，通过选择性地富集和分离目标物质，实现了样品的准确分析。

亲和层析方法具有许多优点，并在各个领域中得到了广泛应用。

未来随着技术的不断发展，亲和层析方法将进一步完善和应用于更多的领域，为科学研究和工业生产提供更多的可能性。

2、配体的选择
一对可逆结合的生物分子中与载体相偶联的一方称配体。 如抑制剂、底物、抗体、辅酶等。
依据蛋白结构设计配体要考虑两个重要因素：
① 正确地预计被设计的配体构像
② 正确预计配体的亲和力
优良配体须具备的条件：
① 与待纯化的物质有较强的亲和力。
一般来说，配体对大分子物质的亲合力越高，在亲和层析 时，分辨率就越好，应用价值就越高；但若配体与待纯化物 质（生物大分子物质）之间的亲合力太大时，对分离纯化是 不利的。
亲和层析载体的组成 配体以共价键结合到活化的基质上，构成固相载体。
原理
亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作 为固定相吸附剂；
当含有混合组份的样品（流动相）通过此固定相时，只有和 固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合， 其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出；
然后改变流动组成份，将结合的亲和物洗脱下来。
拟生物亲和层析
利用部分分子相互作用，模拟生物分子结构或某特定部位，以人工 合成的配基为固定相吸附目的蛋白质的亲和层析。
主要内容
亲和层析的基本原理
制备方法
操作过程 亲和层析的应用
1、载体的选择
一般情况下，需根据目标产物选择合适的亲和配基来修饰载
体，以制备所需的亲和吸附介质即固定相。 作为载体的物质应具有：
②具有与基质共价结合的基团
与待分离物质有适当的亲和力，而与样品中其它组 分没有明显的亲和力，对其它组分没有非特异性吸 附作用。
③配体要能够与基质稳定的共价结合 在实验过程中不易脱落，并且配体与基质偶联后，对 其结构没有明显改变，尤其是偶联过程不涉及配体中 与待分离物质有亲和力的部分，对二者的结合没有明 显影响。