Ni柱亲和层析纯化poly-his变性重组蛋白的标准操作规程

镍柱纯化his蛋白步骤嘿，咱今儿就来说说镍柱纯化 his 蛋白的那些事儿！你想啊，这就好比一场奇妙的旅程。

首先呢，咱得准备好咱的“交通工具”，也就是镍柱啦。

这镍柱就像是一个特别的小房子，专门等着his 蛋白来入住呢。

然后呢，就是把含有 his 蛋白的溶液给弄过来，这就像是带着一群小伙伴准备去镍柱这个小房子里玩耍。

接下来可就关键啦！得让这些溶液慢慢地流过镍柱，这就好像小伙伴们一个一个地走进小房子。

这时候啊，那些带着 his 标签的蛋白就会被镍柱紧紧地抓住，嘿，就像是小房子特别喜欢这些带着特殊标记的小伙伴，把他们留下来一起玩呢。

等这些都完成了，可不能就不管啦。

还得把那些没有被抓住的其他杂质啥的给冲洗掉，这就好比把小房子里不相关的人给请出去，只留下我们想要的 his 蛋白。

那怎么把这些被抓住的 his 蛋白给弄出来呢？哈哈，这就需要一个小技巧啦！用一种特殊的溶液去冲洗镍柱，就像是给镍柱施了个魔法，让它乖乖地把 his 蛋白给放出来。

你说这神奇不神奇？这不就像是变魔术一样嘛！把那些混合在一起的东西，通过这么一系列的操作，就可以把我们想要的 his 蛋白给纯化出来啦。

在这个过程中，可千万要注意细节哦！要是不小心弄错了一步，那可能就得不到我们想要的结果啦。

就像搭积木一样，一块没搭好，可能整个就歪啦。

而且哦，每一步都得仔细认真，不能马虎。

比如说溶液的浓度啊，流速啊，这些都得控制好。

不然的话，就好像走路走偏了一样，可就到不了我们想去的地方啦。

纯化 his 蛋白可不简单呢，但只要我们按照步骤一步一步来，就一定能成功！你想想，当我们最后看到那纯化出来的 his 蛋白，得多有成就感呀！这不就像是经过努力终于爬上了山顶，看到了美丽的风景一样嘛。

所以呀，别害怕困难，大胆地去尝试吧！让我们一起在镍柱纯化his 蛋白的这个奇妙世界里探索，发现更多的惊喜和美好！怎么样，是不是觉得很有意思呀？那就赶紧行动起来吧！。

His标签融合蛋白纯化步骤（Ni-NTA琼脂糖凝胶亲和层析纯化法）1. 缓冲液配制◆L ysis Buffer 1 (under native condition)0.5mM Tris.HCl0.5M NaCl5%(w/v) glycerol10mM Imidazol100mg(1mg/ml)lysozyme (Purification of 6xHis-tagged proteinsfrom E.coli)1% Nonidet P40 (NP40 = Igepal CA-630 )0.25% Tween 20 （or Triton 100）0.02% NaN3 (Optional)2 tablets of protease inhibitor cocktail (EDTA free，Recommended)200 µg(2µg/ml) RNase A (Optional)1mg (10µg/ml) DNase1 (Optional)50 mM NaF (Optional)1mM Na3VO4 (Optional)+ ddH2O to 100ml, Adjust pH to 8.0 using NaOH此lysis buffer 适用于从E.coli、哺乳动物细胞和昆虫细胞中纯化带His标签的蛋白质。

仅在用于裂解E.coli细菌时，加入溶菌酶。

Na3VO4是磷酸酶抑制剂，保护磷酸化的蛋白不被磷酸酶还原。

NaF是酯酶抑制剂，保护脂蛋白不被酯酶降解。

注意：当使用镍琼脂糖凝胶纯化带His标签的蛋白时，缓冲液中不能加EDTA，因EDTA能使镍从螯合物上脱离，从而使分离介质失去效果。

◆L ysis Buffer 2(under denature condition)50 mM Tris-Cl8 M Urea (or 6 M Gu-HCl)10mM Imidazole0.05% Tween 20Adjust pH to 8.0 using NaOH◆D ialysis/Tev cleavage Buffer50 mM Tris-Cl,pH8.0100 mM NaCl (depends on solubility of protein)2.5% glycerol0.5mM EDTA0.5mM DTT or TCEP◆缓冲液A：50mM Tris.HCl0.5M NaCl5% glycerol0.05% Tween 20用高浓度HCl调节pH值至8.0。

镍柱蛋白纯化镍柱蛋白纯化是一种常用的基于亲和层析的蛋白纯化方法，它通过靶蛋白的亲和性与含有Ni2+离子的镍柱发生相互作用，从而实现靶蛋白的分离与纯化。

本文将介绍镍柱蛋白纯化的基本原理、实验步骤以及注意事项。

基本原理镍柱蛋白纯化基于亲和层析的基本原理。

亲和层析是一种根据靶蛋白的化学或生物特性选择性地捕捉分离靶蛋白的方法。

镍柱蛋白纯化利用含有Ni2+离子的亲和层析介质作为捕捉靶蛋白的载体。

由于Ni2+离子与组蛋白中的组氨酸以及其他氨基酸存在较强的亲和力，镍柱中的Ni2+离子能够与靶蛋白中含有组氨酸或其他靠近组氨酸的官能团结合，实现了靶蛋白的分离纯化。

实验步骤镍柱蛋白纯化的实验步骤如下：1.细胞裂解与分离：首先需要将选择的表达靶蛋白的菌株用化学或机械方法破裂，并从细胞裂解液中分离靶蛋白。

2.杂质去除：利用超速离心等手段，去除裂解液中的大量无关蛋白质，以减少后续纯化的杂质。

3.镍柱柱层析：将镍柱填充到层析柱中，使之平衡，然后将分离的靶蛋白通过柱层析，利用其与镍柱中Ni2+离子的亲和力捕捉纯化。

4.洗脱：通过改变缓冲条件（如pH、盐浓度等），使得捕获靶蛋白的镍柱发生变化，最终使其与捕获的蛋白离开。

5.透析：将洗脱得到的靶蛋白透析回目标缓冲液中，以去除与纯化过程中引入的杂质。

注意事项1.掌握柱层析的平衡、清洗和洗脱条件，以避免蛋白质在分离过程中被损坏。

2.需要选择合适的表达菌株、表达载体以及诱导条件，以提高目标蛋白质的表达水平和纯化效率。

3.超速离心过程中，建议在4°C下高速离心，以避免破坏蛋白质结构。

4.纯化过程中需要掌握蛋白质的稳定状态和活性，以确保最终得到的蛋白质具有高纯度和活性。

镍柱蛋白纯化是一种常用的基于亲和层析的蛋白纯化方法，该方法可以高效地从蛋白质混合物中纯化高丰度、高质量的靶蛋白质。

在实验过程中，需要注意掌握柱层析、表达菌株选择、超速离心和掌握蛋白质的稳定状态和活性等方面的技巧，以获得高质量的纯化结果。

镍柱纯化His-tag蛋白1、我司用于纯化TEV蛋白酶。

2、我司镍柱的直径为d=50mm，底面积S=20cm2，高h=400mm，实际填料高为h=250mm。

所以填料体积为V=500ml3、生产实验步骤(1)用上样缓冲液平衡柱子和重悬细菌上样缓冲液配方（1L体积）40mM Na2HPO4 5.68克10mM NaH2PO4 1.2克0.5M NaCL 29克1% 甘油10mL10mM 咪唑0.18克调节PH7.4平衡柱子缓冲液的体积为柱填料体积的10倍重悬菌缓冲液的体积为菌重量的15倍，如我们有2kg的菌，重悬菌缓冲液的体积为30L。

菌的破碎：破碎两遍，压力为800bar。

菌的过滤：当过滤体积只剩原体积的20%时开始稀释，稀释至的原体积的1/2，即15L。

所以我们要配的上样缓冲液体积为39L。

我们镍柱的上柱速度为20mL/min。

洗柱速度为60mL/min。

（2）用上样缓冲液洗柱子10个体积左右，（即洗至检测仪最低浓度平缓为止）（3）用不同咪唑浓度的冲洗缓冲液冲洗柱子。

冲洗缓冲液的体积为2-5个体积。

（即洗至检测仪最低浓度平缓为止）冲洗缓冲液的配方：（1L体积）例如咪唑浓度为20mM。

40mM Na2HPO4 5.68克10mM NaH2PO4 1.2克0.5M NaCL 29克1% 甘油10mL20mM 咪唑0.18克调节PH7.4（4）用含高浓度的咪唑缓冲液洗脱蛋白。

洗脱缓冲液的配方：（1L体积）例如200mM咪唑。

实际使用可能需要更高浓度。

40mM Na2HPO4 5.68克10mM NaH2PO4 1.2克0.9% NaCL 9克1% 甘油10mL200mM 咪唑0.18克调节PH7.4洗脱蛋白的速度为：20mL/min洗脱时等峰值开始上升时开始接。

峰前后低浓度的蛋白接一起。

中间的接一瓶。

（5）蛋白的储存：蛋白收集后立即1:1加甘油，-20℃保存。

甘油需先预冷，加甘油时由甘油加入蛋白中，边加甘油边搅拌，搅拌时不能产生气泡。

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嘿，朋友们！今天咱们来聊聊镍柱亲和层析蛋白纯化的那些事儿。

这可是个超级有趣又神奇的过程哦！
呢，咱们得把准备工作做好。

就像要出门旅行得先收拾行李一样。

咱们得有新鲜干净的镍柱，还有各种试剂和设备都得准备齐全，别到时候手忙脚乱的。

然后呀，就是处理样品啦。

这样品就像是一群调皮的小孩子，咱们得让它们乖乖听话。

把含有目标蛋白的样品处理好，去除那些杂质和不需要的东西，让咱们的目标蛋白能够更加突出。

等它们接触得差不多了，就得开始清洗柱子啦。

这就像是给柱子洗个澡，把那些没有结合上的杂质都冲掉。

用各种缓冲液慢慢地冲洗，把柱子洗得干干净净的。

在整个过程中，咱们可得时刻盯着，就像看着自己心爱的宝贝一样。

注意观察各种现象，看看颜色有没有变化，流速是不是正常。

要是有啥不对劲的，赶紧想办法解决。

呢，收集到的目标蛋白还得进行检测和分析，看看纯度够不够高，质量好不好。

如果一切都很完美，那咱们就可以欢呼庆祝啦！
怎么样，朋友们，镍柱亲和层析蛋白纯化是不是很有趣呀？只要咱们一步一步认真做，就能得到咱们想要的纯净蛋白，为后续的实验打下坚实的基础！加油吧，小伙伴们！。

Ni柱纯化His-tag蛋白质一非变性条件下抽提His-Tag蛋白质下列方法适用于从细菌中抽提通常含有连续6个组氨酸尾（His Tag Protein）的具有天然结构的可溶性重组蛋白质（Native Protein）。

其他来源的蛋白质样品，如果目标蛋白质具有His-Tag结构，提供的层析方法可供参考。

1.样品准备1) 准备细胞，接种，诱导表达。

对于实验室用的pET载体表达系列，在细胞OD600=0.5-0.8时，用1mM IPTG诱导1-3小时，可以获得理想的表达效率。

收集细胞，置于-70度或立即进行步骤2操作。

2) 加入1/20细胞生长体积的NTA-0 Buffer（20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl，10% Glycerol）和PMSF。

PMSF用无水乙醇配制成200mM储存液，-20度或4度保存；PMSF使用的工作浓度位1mM；注意：PMSF见水分解，需要在使用前加入。

该步骤冰上操作。

3)将细胞悬浮起来，加入溶菌酶（工作浓度位0.2-0.4mg/ml，如果表达的宿主细胞内含pLysS或pLysE，可以不加溶菌酶），混匀，冰上放置30分钟，超声或匀浆破碎细胞。

该步骤冰上操作。

4)加入10% Triton X-100, 使Triton的终浓度为0.05%，充分混匀，冰上放置15分钟，间或混匀）；冰上超声破碎细胞，同时降低粘稠度。

5)加入1M MgCl2，使MgCl2的终浓度为1mM，混匀。

加入DNase, 使DNase 的终浓度为10mg/ml，混匀，室温放置10分钟。

6)5000转/分（20,000xg以上），4度离心15分钟以上。

取上清，置于冰上备用或-20度保存。

2．层析1) 将NTA树脂装入合适的层析柱，层析用10倍NTA体积的NTA-0 Buffer洗。

2)将样品（步骤2（6））加到NTA层析柱中，流速控制在15ml/小时左右，收集穿透部分，用于SDS/PAGE分析蛋白质的结合情况。

Ni柱亲和层析纯化poly-his可溶性重组蛋白的标准操作规程（编号：067）1、目的及适用范围利用Ni2+鳌合层析纯化体外表达的带有His标签的可溶性重组蛋白。

2、主要仪器Ni柱、真空抽滤泵、超声破碎仪、冷冻离心机3、主要试剂3.1磷酸盐体系Binding buffer：50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，10 mM imidazole，pH 8.0；Wash Buffer：50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，20 mM imidazole，pH 8.0；Elute Buffer：50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，500 mM imidazole，pH 8.0。

3.2 Tris盐体系Binding buffer：20mM Tris，500 mM NaCl，20 mM imidazole，pH8.0；Wash Buffer：20mM Tris，500 mM NaCl，60 mM imidazole，pH8.0；Elution Buffer：20mM Tris，500 mM NaCl，500 mM imidazole，pH8.0；Striping Buffer：20mM Tris，100mM EDTA，500mM NaCl，pH8.0。

酸性Buffer：20mM 醋酸钠，500mM NaCl，pH4.0。

Charge Buffer：0.1M NiSO44、操作步骤4.1 Ni柱的预处理4.1.1用5个柱体积的无菌水冲洗柱子；4.1.2用5个柱体积的0.1M NiSO4冲洗柱子，使柱子挂Ni；4.1.3用5个柱体积的无菌水冲洗柱子，除去多余的Ni；4.1.4用5个柱体积的酸性Buffer冲洗柱子（使柱子变得疏松）；4.1.5用5个柱体积的Binding Buffer平衡柱子。

4.2蛋白的纯化4.2.1大肠杆菌诱导表达目的蛋白；4.2.2 4500rpm，离心10-15min，弃上清，收集菌体；4.2.3 将收集的菌体用Binding buffer重悬，8000rpm离心10min，弃上清，收集菌体；137。

亲和柱层析操作规程（包涵体蛋白）1.装柱：1.1 取出层析柱，用去离子水冲洗干净，连接好管子后固定柱子；1.2用水冲洗层析柱3-5次，每次10ml去离子水；1.3取出填料，静止至室温后，根据需要用移液器取出3-5ml的填料进行装柱，1.4用去离子水冲洗填料5个柱体积；2.柱的平衡与上样：2.1用0.02M PB bufferB 缓冲液(PH8.0)平衡Ni柱，直至流出液的pH为8.0；2.2对处理的样品进行过滤后，缓慢上样让蛋白充分结合；3洗杂蛋白：3.1用0.02M PB bufferB 缓冲液(PH8.0)过柱，清洗没有结合到层析柱上的杂蛋白，至流出液与缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.2用含5mM咪唑的PB bufferB 缓冲液（pH8.0）过柱，共洗约30ml，至流出液与含5mM咪唑的PB bufferB 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.3用含10mM咪唑的PB bufferB 缓冲液（pH8.0）过柱，共洗约30ml，至流出液与含10mM咪唑的PB bufferB 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.4用含20mM咪唑的PB bufferB 缓冲液（pH8.0）过柱，共洗约30ml，至流出液与含20mM咪唑的PB bufferB 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.5用含40mM咪唑的PB bufferB 缓冲液（pH8.0）过柱，共洗约30ml，至流出液与含40mM咪唑的PB bufferB 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.6用含50mM咪唑的PB bufferB 缓冲液（pH8.0）过柱，共洗约30ml，至流出液与含50mM咪唑的PB bufferB 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.2用含100mM咪唑的PB bufferB 缓冲液（pH8.0）过柱，共洗约30ml，至流出液与含100mM咪唑的PB bufferB 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；（具体的洗脱梯度需根据实验自行调整）4解离目的蛋白：4.1用含100mM咪唑的PB bufferB 缓冲液（pH8.0）过柱，共洗约30ml，至流出液与含100mM咪唑的PB bufferB 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；4.2 用含200mM咪唑的PB bufferB 缓冲液（pH8.0）过柱，共洗约30ml，至流出液与含200mM咪唑的PB bufferB 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；4.3 用含500mM咪唑的PB bufferB 缓冲液（pH8.0）过柱，共洗约30ml，至流出液与含500mM咪唑的PB bufferB 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；4.4用含1000mM咪唑的PB bufferB 缓冲液（pH8.0）过柱，共洗约30ml，至流出液与含1000mM咪唑的PB bufferB 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul 做SDS-PAGE检测；（具体的洗脱梯度需根据实验自行调整）5.柱的清洗与保存：5.1用含500mM咪唑的缓冲液B（pH8.0）以冲洗层析柱，共冲洗30ml；5.2用浓度为1.5M的NaCl溶液冲洗层析柱，共冲洗30ml；5.3用过滤去离子水冲洗50ml；5.4用20%乙醇冲洗30ml后于4℃20%乙醇中保存。

.Ni亲和层析柱法纯化带组氨酸标签的重组蛋白纯化设备：纯化仪：?KTA purifier(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)TM HP-5 mL (GE Healthcare, , Uppsala, Sweden)HisTrapNi亲和层析柱：试剂：所有上柱的试剂均需经0.2 μM孔径过滤器过滤并超声波震荡除气处理方可使用。

Binding Buffer：20 mM NaHPO-NaHPO, pH 7.4, 500 mM NaCl, 5 mM 咪唑4224Elution Buffer：20 mM NaHPO-NaHPO, pH 7.4, 500 mM NaCl, 500 mM 咪唑4242Stripping Buffer: 20 mMNaHPO-NaHPO, pH 7.4, 500 mM NaCl, 50 mM EDTA 442220%乙醇：200 mL无水乙醇，加蒸馏水定容至1L0.1M NiSO: 称取2.6284g NiSO·6HO，加蒸馏水溶解，定容至100 mL244操作步骤：1 样品前处理取诱导后菌液50 mL，4℃、5000 rpmin离心10 min收集菌体，以25 mL Binding Buffer重悬菌体，冰浴下超声波破碎至澄清，4℃、12000 rpmin离心25 min，取上清，经0.2 μM孔径过滤器过滤后待用。

2 Ni柱前处理上样前，使用10倍柱体积的Binding Buffer以5 mL/min的流速平衡镍柱。

3 上样经离心、过滤处理后的样品以1 mL/min的流速通过衡流泵加载到平衡后的Ni柱上，收集穿透液，可反复上样以提高样品的挂柱效率。

4 平衡上样后的Ni柱将已结合目的蛋白的Ni柱回接到?KTA purifier上，用10倍柱体积的Binding Buffer以5mL/min的流速再次平衡镍柱以去除未结合上的蛋白。

5 梯度洗脱以梯度的Elution Buffer/Binding Buffer混合液洗脱Ni柱(梯度的界定因蛋白而不同，可经预实验确定)，流速为5 mL/min，并监测OD值，收集蛋白吸收峰对应的洗脱液，经280SDS-PAGE检测后确定目的蛋白所在。