(推荐)蛋白纯化-Ni亲和层析柱法

实验目的1.了解外源基因在大肠杆菌细胞中的诱导表达情况2.学会用SDS-PAGE电泳法分离不同分子量的蛋白质3.学习通过亲和层析法纯化目的蛋白4.学会考马斯亮蓝染色法和蛋白质杂交法检测蛋白质实验原理1.外源基因在大肠杆菌细胞中的诱导表达：将外源基因克隆在特殊的表达载体中，让其在E. coli中表达，该表达载体上含有lac操作子的启动子。

在不加诱导剂的条件下培养宿主菌，lacI基因表达的阻遏蛋白LacI与lac操作子结合，使外源基因不能表达；向培养基中加入诱导物IPTG后，LacI阻遏蛋白变构失活，不能与lac操作子结合，外源基因就表达。

2.蛋白质SDS-PAGE电泳分离：SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。

其分离原理是根据蛋白质分子量的差异，因为SDS-PAGE的样品处理液及缓冲液的加入破坏了蛋白质的二级、三级、四级等结构，并使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物，稳定地存在于均一的溶液中，SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷，远远超过其原来所带的电荷，从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计，消除了不同分子之间原有的电荷差别，其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小，这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基。

3.考马斯亮蓝法检测蛋白质：考马斯亮蓝是一种蛋白质染料，主要有R-250和G-250两种类型。

考马斯亮蓝可以和蛋白肽链中碱性氨基酸残基或芳香族氨基酸残基（Arg，Trp，Tyr，His，Phe）结合。

考马斯亮蓝R250多用于聚丙烯酰胺凝胶电泳后蛋白质条带的染色；因为考马斯亮蓝R250中的R代表Red，偏红，红蓝色，与蛋白质结合虽然比较缓慢，但是染料可以穿透凝胶，染胶效果好，染色后为蓝色，且与胶的结合可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。

4.基因融合就是将两个或多个开放读码框按一定顺序连接在一起，融合阅读框架的表达产物是一个杂和蛋白。

6*His标签高纯度Ni柱纯化的经验分享Ni柱纯化（也就是6*His纯化）是用来纯化带有3-6*His标签的蛋白质，可以是天然蛋白也可使重组蛋白质。

His标签可以说是一个目前重组蛋白纯化最常用的标签了，因为标签小而且简单，所以有时候都不用切掉标签就可以用于下游实验而不受影响。

亲和纯化一步达到90%以上的纯度是我们做蛋白纯化人的追求，但是往往在我们实际纯化过程中很难达到，尤其是Ni柱纯化，往往纯度就是差那么一点点就可以满足我们后期实验的需要了，但是就是很难去掉那最后的那一点杂蛋白条带，如果那一条杂带不影响后续的工作还好说。

反之，我们就需要在添加1-2步（有可能更多）纯化来去掉那最后的一条让人烦恼的杂带，对于做药物工艺开发的工程师们来说，其增加的工作量还有成本很可能比较大，甚至最后迫不得已搞不好还要被迫新构建载体换一个标签重做，碰到这种情况，可就要苦了我们的蛋白质工程师们了。

当然也有少数概率那条杂带很容易就去掉了，如果真是这样的话，那在这里就要恭喜您了，您的运气真的是很好。

蛋白质纯化理论很简单，但就是因为很简单，一碰到问题的时候，很难找到可靠的理论作为参考去解决问题（蛋白纯化工艺的文献有多少参考价值做过的人都知道哈），只能傻瓜式，做大量的实验去摸索探索其中的奥秘，寻找突破的机缘。

今天呢，我们只谈一下Ni柱纯化的一些小小的经验。

那么首先我们要要求上游构建的时候尽量选择背景比较干净的载体和宿主，这个多少是能减少一点下游的工作强度的，当然运气特别好的除外。

在发酵表达的时候也尽量控制好的表达背景，比如合适的诱导时间等，真核的话就是控制死细胞的量，死细胞越多，后面纯化越难做。

构建和表达都控制好了，那么剩下的就是我们做蛋白纯化的工作了，首先就是挑选合适的Ni柱填料。

Ni填料目前主要有三种配基类型，IDA、NTA和TED型的，IDA价格最便宜，对蛋白质的结合非常好，缺点是Ni脱落很明显，对还原剂敏感，纯化后用氢氧化钠清洗前需要先脱镍，CIP之后再螯合Ni离子，这就增加污染的机会。

Protocol蛋白质纯化方法（镍柱）柱前操作1.IPTG诱导后，收菌，8000rpm/min(r/m)离心10min;2.用Binding Buffer（BB）溶解（每100ml原菌液加BB 20ml),超声裂解30min（工作：5s,停止：5s)，1500r/m离心10min,去除杂质；3.取上清，12000r/m离心20min, 得包涵体；4.用含2M尿素的BB洗包涵体，12000r/m离心20min,(上清做电泳）；？？？5.用含6M尿素的BB溶解包涵体，12000r/m离心20min,(上清做电泳）；6.对照电泳结果，将上清或包涵体溶解液上柱；平衡柱子（柱体积：V）7. 3V（3倍柱体积）ddH2O(洗乙醇）；8. 5V Charge Buffer（CB); ？？？9. 3V BB;柱层析10.上样；11. 10V Washing Buffer（WB）；12. 6V Elute Buffer（EB);13.分管收集，每管1~2ml.各种缓冲液配方1. 8×BB: 4M NaCl, 160mM Tris-HCl, 40mM imidazole(咪唑），pH=7.91000mlNaCl: 58.44×4=233.76gTris-HCl: 121.14×160×10-3=19.3824gImidazole: 68.08×40×10-3=2.7232g2. 8×CB: 400mM NiSO41000mlNiSO4: 262.8×400×10-3=105.12g3. 8×WB: 4M NaCl, 160mM Tris-HCl, 480mM imidazole, pH=7.91000mlNaCl: 233.76g, Tris-HCl:19.3824g, Imidazole: 32.6784g4. 4×EB: 2M NaCl, 80mM Tris-HCl, 4M imidazole, pH=7.91000mlNaCl: 118.688g, Tris-HCl:9.6912g, Imidazole: 272.32g5. 6M 尿素1000ml尿素：60.06×6=360.36gNi柱纯化蛋白注意事项(2011-10-13 16:01:39)使用Ni柱纯化带有His标签的融合蛋白，是我们大家再熟悉不过的实验操作了。

亲和层析预装柱和填料选择指南亲和层析是一种常用的生物分离技术，其基本原理是利用靶分子与具有特殊亲和性的固定相相互作用，实现目标分子的分离纯化。

该技术被广泛应用于蛋白质纯化、分析、制备以及药物研发中。

本文将为您介绍亲和层析预装柱和填料选择的指南。

首先，亲和层析的预装柱种类繁多，如Ni-NTA、GST、MBP、Protein A、Protein G、Protein L等。

选择合适的预装柱主要取决于目标蛋白的性质和亲和配体的选择。

以下是几种常见的亲和层析预装柱及其适用性。

1. Ni-NTA柱：适用于His标记蛋白的纯化。

该柱上的Ni2+离子与His标记相互作用，实现蛋白的选择性吸附。

Ni-NTA柱广泛应用于蛋白质纯化和表达系统中。

2. GST柱：适用于GST标记蛋白的纯化。

GST标记用于表达系统和蛋白质亲和纯化，其独特的亲和性可与谷胱甘肽S转移酶 (glutathione S-transferase，GST)结合。

3. MBP柱：适用于MBP标记蛋白的纯化。

麦芽糖结合蛋白(maltose-binding protein，MBP)可通过特异性辅助蛋白结合一些亲和配体，实现蛋白的纯化和表达。

4. Protein A/G/L柱：适用于免疫球蛋白 (IgG) 的富集。

Protein A/G/L分别与IgG的不同部位结合，用于IgG的富集和纯化，常用于抗体生产和医学诊断。

其次，填料选择也是亲和层析中一项重要的技术选择。

填料是用于填充柱体的固体介质，其性能直接影响到层析分离的效果。

以下是一些常见的填料种类及其特点：1.球形填料：球形填料具有均一的颗粒尺寸和良好的柱层分离性能。

常见的球形填料有琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等。

2.凝胶填料：凝胶填料通常用于分离较大分子，如蛋白质、核酸等。

常见的凝胶填料有琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等。

3.磁性填料：磁性填料具有较高的分离效率和灵敏度，常用于磁性亲和层析。

磁性填料结合预装柱可以实现高通量的自动化分离和纯化。

镍柱蛋白纯化镍柱蛋白纯化是一种常用的基于亲和层析的蛋白纯化方法，它通过靶蛋白的亲和性与含有Ni2+离子的镍柱发生相互作用，从而实现靶蛋白的分离与纯化。

本文将介绍镍柱蛋白纯化的基本原理、实验步骤以及注意事项。

基本原理镍柱蛋白纯化基于亲和层析的基本原理。

亲和层析是一种根据靶蛋白的化学或生物特性选择性地捕捉分离靶蛋白的方法。

镍柱蛋白纯化利用含有Ni2+离子的亲和层析介质作为捕捉靶蛋白的载体。

由于Ni2+离子与组蛋白中的组氨酸以及其他氨基酸存在较强的亲和力，镍柱中的Ni2+离子能够与靶蛋白中含有组氨酸或其他靠近组氨酸的官能团结合，实现了靶蛋白的分离纯化。

实验步骤镍柱蛋白纯化的实验步骤如下：1.细胞裂解与分离：首先需要将选择的表达靶蛋白的菌株用化学或机械方法破裂，并从细胞裂解液中分离靶蛋白。

2.杂质去除：利用超速离心等手段，去除裂解液中的大量无关蛋白质，以减少后续纯化的杂质。

3.镍柱柱层析：将镍柱填充到层析柱中，使之平衡，然后将分离的靶蛋白通过柱层析，利用其与镍柱中Ni2+离子的亲和力捕捉纯化。

4.洗脱：通过改变缓冲条件（如pH、盐浓度等），使得捕获靶蛋白的镍柱发生变化，最终使其与捕获的蛋白离开。

5.透析：将洗脱得到的靶蛋白透析回目标缓冲液中，以去除与纯化过程中引入的杂质。

注意事项1.掌握柱层析的平衡、清洗和洗脱条件，以避免蛋白质在分离过程中被损坏。

2.需要选择合适的表达菌株、表达载体以及诱导条件，以提高目标蛋白质的表达水平和纯化效率。

3.超速离心过程中，建议在4°C下高速离心，以避免破坏蛋白质结构。

4.纯化过程中需要掌握蛋白质的稳定状态和活性，以确保最终得到的蛋白质具有高纯度和活性。

镍柱蛋白纯化是一种常用的基于亲和层析的蛋白纯化方法，该方法可以高效地从蛋白质混合物中纯化高丰度、高质量的靶蛋白质。

在实验过程中，需要注意掌握柱层析、表达菌株选择、超速离心和掌握蛋白质的稳定状态和活性等方面的技巧，以获得高质量的纯化结果。

镍柱亲和层析1. 什么是镍柱亲和层析？镍柱亲和层析是一种分离和纯化蛋白质的技术方法。

通过利用镍离子和组织特异性传感器结合矩阵的亲和性，目标蛋白质可以被高效地捕获和分离。

2. 镍柱亲和层析的原理镍柱亲和层析的原理基于镍离子与组织特异性传感器结合矩阵的亲和性。

通常使用一种名为Ni-NTA的亲和树脂，其中镍离子与某些氨基酸残基（例如组氨酸，组氨酸是蛋白质中可以与金属离子结合的常见残基）具有高度的亲和力。

将该亲和树脂充填在柱子中，然后将混合物（通常是细胞裂解液或纯化液）通过柱子进行分离和纯化。

3. 镍柱亲和层析的步骤镍柱亲和层析通常包括以下步骤：3.1 树脂的准备将亲和树脂（例如Ni-NTA树脂）洗净并充填到柱子中。

在使用之前，需要以适当的缓冲液洗涤和平衡树脂。

3.2 样品的制备将要进行分离和纯化的蛋白质样品进行处理和制备。

通常，这包括细胞的裂解和去除杂质。

3.3 样品的加载将处理好的样品溶液加载到柱子中。

样品中的目标蛋白质与镍离子结合并与亲和树脂发生相互作用。

3.4 洗脱目标蛋白质通过用含有一定浓度的络合剂（例如组氨酸）的缓冲液进行洗脱，使目标蛋白质从柱子上洗脱下来。

3.5 验证纯化蛋白质对洗脱得到的蛋白质样品进行验证，通常通过SDS-PAGE凝胶电泳或其他定量方法进行。

3.6 进一步纯化（可选）如果需要进一步纯化目标蛋白质，可以使用其他的层析方法或技术进行。

4. 镍柱亲和层析的应用镍柱亲和层析是常用的蛋白质分离和纯化方法，被广泛应用于生物医学、生物技术和生命科学研究领域。

4.1 重组蛋白的纯化镍柱亲和层析在重组蛋白的纯化中具有重要作用。

许多重组蛋白在表达系统中被融合到带有镍结合标签的载体上，通过镍柱亲和层析可以高效地纯化目标蛋白质。

4.2 酶的纯化许多酶也可以通过镍柱亲和层析进行纯化。

例如，组氨酸残基在许多酶中较为常见，可以与镍离子结合，从而实现酶的有效纯化。

4.3 蛋白质结构研究在蛋白质结构研究中，镍柱亲和层析可用于纯化特定蛋白质或蛋白质复合物，以获取足够纯净的样品进行晶体学和其他结构分析方法。

镍柱亲和层析的原理和应用1. 简介镍柱亲和层析（Nickel affinity chromatography）是一种常用的蛋白质纯化技朧。

它基于镍离子（Ni2+）与蛋白质中的组氨酸残基的亲和作用，通过有选择性地结合目标蛋白质，从而实现纯化的目的。

2. 原理镍柱亲和层析的原理基于金属离子和蛋白质之间的配位作用。

其主要步骤如下：- 第一步：将镍离子通过某种方法固定在层析树脂上，形成镍柱。

- 第二步：将含有目标蛋白质的混合物（如细胞裂解液）加入镍柱。

- 第三步：目标蛋白质中的组氨酸残基与镍离子发生配位作用，与镍柱发生结合。

- 第四步：通过洗脱步骤，将非特异结合的蛋白质洗脱，使得目标蛋白质获得高纯度。

3. 应用镍柱亲和层析在生命科学领域中有着广泛的应用，以下是一些常见的应用领域：3.1 蛋白质纯化•镍柱亲和层析广泛应用于蛋白质的纯化过程中，尤其适用于具有组氨酸残基的目标蛋白质。

•通过调节洗脱条件，可以实现高纯度的蛋白质获取。

3.2 基因工程•在基因工程领域中，镍柱亲和层析常用于蛋白质表达和纯化的过程中。

•通过融合镍柱亲和标签（如His标签）到目标蛋白质上，可以方便地进行纯化和提取。

3.3 药物研发•镍柱亲和层析在药物研发中也有重要应用。

•在药物筛选和药效评估过程中，可以利用镍柱亲和层析纯化目标蛋白质，进一步了解药物与蛋白质的相互作用机制。

3.4 生化分析•镍柱亲和层析还可用于生化分析。

•通过分离纯化目标蛋白质，可以进一步对其结构、功能进行研究。

3.5 蛋白质相互作用研究•镍柱亲和层析可用于研究蛋白质与其他分子的相互作用。

•通过纯化目标蛋白质和结合物质，可以研究其作用机制以及相互作用的影响因素。

4. 优势和局限性4.1 优势•镍柱亲和层析方法简单、快速，可大量并行操作，适用于高通量纯化。

•镍离子和组氨酸之间的亲和作用具有较高的选择性，可提供高纯度的目标蛋白质。

4.2 局限性•镍柱亲和层析仅适用于具有组氨酸残基的目标蛋白质，不适用于其他类型的蛋白质。

ni柱纯化蛋白原理
柱纯化蛋白是一种常用的蛋白质纯化方法，可以根据蛋白质的特性选择适合的纯化柱。

柱纯化通常包括以下几个步骤：
1. 样品的制备：首先，需要从细胞或组织中提取蛋白质。

这可以通过破碎细胞壁，使用溶解液将细胞或组织中的蛋白质释放出来。

2. 柱填充物的选择：根据蛋白质的特性，选择合适的柱填充物。

柱填充物可以是树脂、凝胶或金属离子，具体选择取决于目标蛋白质的理化性质。

3. 样品加载：将样品加载到柱上。

加载时要确保样品中的杂质尽可能少，以提高纯化效果。

4. 洗脱：根据目标蛋白质的亲和性选择适当的洗脱缓冲液来洗脱非特异结合的蛋白质。

洗脱缓冲液通过改变pH、离子强度
或添加络合剂等方式可以使目标蛋白质从柱上洗脱下来。

5. 储存或进一步分析：经过柱纯化后的蛋白质可以直接用于进一步的实验或储存。

柱纯化蛋白的原理是基于蛋白质与柱填充物之间的相互作用。

柱填充物可以通过静电相互作用、氢键、疏水作用等与蛋白质结合，从而实现蛋白质的分离和纯化。

列举5种分离纯化蛋白质的方法。

一、凝胶电泳法（Gel Electrophoresis）：凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离纯化方法。

它利用蛋白质的电荷和大小差异，在电场作用下，将蛋白质分离成不同迁移速度的带状物。

常见的凝胶电泳有聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和聚丙烯酰胺糖凝胶电泳（PAGE）等。

凝胶电泳具有分离速度快、样品适用范围广、易于操作等特点。

二、离子交换层析法（Ion Exchange Chromatography）：离子交换层析是根据蛋白质表面带电性的差异来分离纯化蛋白质的方法。

通过将样品加入装有离子交换树脂的层析柱中，通过控制洗脱缓冲液的离子浓度和pH，实现带正电荷或负电荷的蛋白质与树脂之间的相互作用，从而实现分离纯化。

三、亲和层析法（Affinity Chromatography）：亲和层析是利用蛋白质与某种亲和剂之间的特异性相互作用来分离纯化蛋白质的方法。

常见的亲和层析方法包括亲和纸层析、亲和树脂层析等。

该方法具有选择性强、纯化效果好的优点，广泛应用于蛋白质纯化领域。

四、凝胶渗透层析法（Gel Filtration Chromatography）：凝胶渗透层析也被称为分子筛层析，是一种以分子大小差异作为分离依据的方法。

通过在层析柱中加入一种孔隙较小的凝胶，利用蛋白质分子大小的差异，在经过柱体后，较小的蛋白质分子进入凝胶孔隙中，分离出来，而较大的蛋白质则能够直接流出。

五、逆流层析法（Reverse Phase Chromatography）：逆流层析是基于蛋白质与固定相之间的亲疏水性相互作用进行纯化的方法。

固定相常为亲疏水性的碳链，样品在不同的流动相条件下，通过调节流动相的成分和性质，来实现对蛋白质的分离纯化。

此外，还有疏水相互作用色谱（Hydrophobic Interaction Chromatography）、互补杂交法（Complementary Hybridization）等方法。