地高辛杂交试剂盒说明书

洗涤缓冲液 马来酸缓冲
液 检测缓冲液
紫外光盒或者商业化可用 2×SSC 或者 10×SSC
于紫外交联的其他设备
尼龙膜，带正电荷*
DIG Easy Hyb
杂交袋*，或者耐热的塑料 （杂交缓冲液，需单独
袋或者滚筒瓶（分子杂交 购买）
炉）
注意：当用地高辛杂交缓
冲液工作时，不要用开口
的托盘。
3.7 免疫检测
耐热的塑料袋或者滚筒 地高辛洗涤和封阻缓冲
瓶 杂交袋*
组合* TE 缓冲液 或者
洗涤缓冲液 马来酸缓冲
液 检测缓冲液
3.8 DNA 斑 点 的 脱 色 和 大的托盘 水浴
DMF
重新标记探针
0.2M NaOH，0.1%SDS
2×SSC
标记的产品可以从 Roche Applied Science 获得。
指导手册
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1 前言 1.1 内容表 1 前言 1.1 内容表 1.2 试剂盒成分 2.介绍 2.1 产品简介 3. 操作步骤和所需材料 3.1 在你开始前 3.2 流程图 3.3 地高辛标记 DNA 3.4 标记效率的确定 3.5 DNA 的转移和固定 3.6 杂交 3.7 免疫检测 3.8 DNA 印记的洗脱和再杂交
上；
尼龙膜部分区域已经点好一系列稀释梯度的地高辛标记的对照 DNA
（Vial 4）作为标准。
2 采用 anti-DIG-AP 结合物(Vial 8)和随时即用的 NBT/BCIP 对尼龙膜进
行免疫检测。
比较地高辛标记 DNA 与对照 DNA 的一系列稀释点的强度确定标记效
率。
所需附加溶液的制备
请找出下表中的成分和所需制备的试剂。下表中的缓冲液也可以在地高辛洗
0
定
反应
试剂盒工作溶液的制备 下表中列出试剂盒工作溶液的制备方法：
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溶液
成分/制备方法
储存/稳定性
用途
封阻溶液 用马来酸缓冲液按照 1：10 一直新鲜制备
封阻膜上非特异
的比例将 10×封阻液（10 号
结合位点
瓶按体积比 10%溶解）稀释
成 1×工作溶液
抗体溶液 每次使用前将原始管中的 2-8℃，12h
2
沸水浴 10 分钟以变性 DNA，然后迅速插入冰水混合物中
注意：完全变性对于标记的有效性是十分重要的
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加入以下试剂到变性探针或对照 DNA 中：
试剂
体积
Vial 5 2μL
Vial 6
2μL
Vial 7
1μL
充分混合并简单离心； 37℃孵育 1 小时或者过夜
注意：较长的孵育时间（最高达 20 小时）能够提高地高辛标记
3． 实验步骤和所需材料
3.1 在你开始前
主要的操作要求
此表中描述了地高辛标记和检测中主要的提示：
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要求
指引
在清洁的条件下进行操作 高压灭菌地高辛系统的试剂
过滤灭菌的溶液包括：SDS,吐温 20，并应该加入到
已灭菌的溶液中。
用干净的孵育托盘
每次使用前都要严格地清洗实验托盘
处理膜的要求
带无粉手套
处理膜的时候，只能够用干净的镊子夹膜的边缘
检测复杂基因组中的单拷贝基因，需标记的模板 DNA 用量至少
300ng（探针浓度：25ng/mL 杂交液）。
标记从琼脂糖凝胶上分离的 DNA
如果你想要完成基因组的 southern 杂交，你应该利用琼脂糖凝胶电泳将插入
载体的模板 DNA 从载体上分离出来。
为 了 从 凝 胶 中 分 离 DNA, 你 可 以 用 琼 脂 糖 凝 胶 DNA 提 取 试 剂 盒
(the Agarose Gel DNA Extraction Kit)进行大小在 400bp-5kbp 范围内 DNA 片段的
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回收。 这一试剂盒既可以用于标准琼脂糖凝胶也可用于低熔点琼脂糖凝胶。然
后，不需要进一步纯化即可对 DNA 片段进行高效的地高辛标记。然后标记好的
探针应该用高效的 PCR 产物纯化试剂盒（High Pure PCR Product Purification Kit）
括随机引物标记所必须的酶，已预先混合优化的 5×浓度反应
缓冲液。
根据标准方法，地高辛标记的探针可以与固定在膜上的核酸
杂交
杂交。采用碱标记形式的地高辛-11-dUTP 能够更加容易和有 效的被洗脱下来，使固定在膜上的核酸可以与其他的地高辛
标记探针再次杂交。
杂交探针可以用抗地高辛的碱性磷酸酶进行免疫检测，Fab
封阻液（10 号管） 未开封时，2-8℃或者 15-25℃ 稳定；
一旦开封，应分装并储存在-15℃到-25℃或者无菌条
件下 2-8℃间可以稳定保存 1 个月；
工作溶液都应是新鲜配制的
灵敏度和特异性
采用 southern 杂交从 1μg 人胎盘 DNA（经 Bgl Ⅱ或 EcoRⅠ酶切）中检测到
单拷贝基因。
15-25 ℃ , 稳 封 阻 液 的
冲液
用 NaOH(固体)调节 pH 值到 7.5(20℃) 定
稀释
检 测 缓 冲 0.1M Tris-HCl 0.1M NaCl pH 9.5(20℃) 15-25 ℃ , 稳 调整 pH 值
液
定
到 9.5
TE 缓冲液
10mM Tris-HCl 1 mM EDTA pH 8. 15-25 ℃ , 稳 终 止 颜 色
个实验采用 1μg DNA 作为模板。1 小时内，大约有 15%的核苷酸参与到了 0.8μg
新合成的地高辛标记 DNA 中。20 小时后消耗了大约 38%的核苷酸。
模板 DNA
1h
20h
10 ng
15 ng
50 ng
30 ng
30 ng
120 ng
100 ng
60 ng
260 ng
300 ng
120 ng
3.2 流程图
3.3 地高辛标记 DNA 介绍
随机引物标记的 DNA 带有地高辛-11-dUTP,这一标记采用的是地高辛高效引 物试剂，这是一种含有随机六碳糖，dNTP 混合物的 5×浓度标记混合物，其中 dNTP 混合物包括碱性标记的地高辛-11-dUTP，标记级的 Klenow 酶和适合的反 应缓冲液
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附加设备和所需试剂
水浴 冰水混合物
此表中列出了成分，储存条件和除了试剂盒成分外所需试剂的用途。
溶液
成分
储存条件/稳定性
用途
水
高压灭菌的双蒸水
15-25℃，稳定 稀释 DNA
EDTA(乙二胺 0.2M EDTA,pH 8.0
15-25℃，稳定 终止标记反应
四乙酸)
模板 DNA
下表中列出了模板 DNA 所需特征：
化） 澄清溶液 用于确定标记效率
5 六聚核苷酸混合物
6 标记用混合物
7 DNA 聚合酶 1 大片段 标记级
8 抗地高辛的碱性磷
200μL
酸酶结合物
750U/mL
从羊中获取的，Fab 段，结合碱性磷酸酶 澄清
溶液
9 NBT/BCIP 10 封阻试剂
附加仪器与所需试剂 除了上表中列出的试剂外，你必须准备一些溶液。在下表中，你可以找到不
杂交
6 h or O/N
免疫检测
1.5h
显色
0.5-16h
5
检测数量
一个试剂盒足够用于:
25 个标准的标记反应，每个反应的膜板 DNA 不超过 3μg；
并可以检测 50 张 10×10cm2 的杂交膜。
质量控制
根据操作步骤中的说明对未标记的对照 DNA【pBR328】进行标记，并按照
下面的标准检测操作方法在点杂交中用 0.1pg 同源 DNA 点在膜上 16h 后成色显
DNA 的产量
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加入 2μL 0.2M EDTA(pH8.0) 和/或 65℃加热 10 分钟终止反应
注意：采用地高辛高效引物获得的地高辛标记片段的长度范围可
以从 200bp 到 1000bp 甚至更长，这主要取决于原始模板 DNA 的
长度
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标记反应的产量
表 1： 此表向您展示了在适宜条件下地高辛高效引物标记的产量。在标准反应中每
涤和封阻缓冲液无 DNA 酶和 RNA 酶系列产品中获得。
溶液
成分/制备
储存/稳定性 用途
洗 涤 缓 冲 0.1M 马来酸
15-25 ℃ , 稳 去 除 未 结
液
0.15M NaCl pH 7.5(20℃)
定
合的抗体
0.3% (v/v)Tween 20
马 来 酸 缓 0.1M 马来酸 0.15M NaCl
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2.介绍
2.1 产品概况
实验原则
此试剂盒采用 DIG(地高辛)，一种甾类半抗原，steroid hapten 去标记 DNA
探针用于杂交和后续的免疫检测。
步骤
描述
根据随机引物标记技术采用地高辛标记引物获得了地高辛标
记的 DNA 探针。地高辛标记的高效引物是一种专门生产的反
DNA 标记 应混合物，其中含有地高辛 dUTP,碱性标记和所有的试剂，包
500 ng
1000 ng
26 ng
890 ng
使用 DIG-High-Prime 溶液，增加不同模板 DNA 的量进行反应，并检测反应
1 小时和反应 20 小时的差异。地高辛标记 DNA 的产量由放射线示踪器进行测定，
并通过斑点杂交进行证实 （10 个独立标记实验的平均值）。
进行纯化，以去除残留的琼脂糖颗粒。
步骤
此步骤用于标记 10ng-3μg DNA 。可以通过扩大所有成分和体积标记更大量
的 DNA（最高达 10μg）。