地高辛随机引物法标记探针的Southern杂交技术优化

地高辛标记LEA3蛋白基因探针的制备及其在转基因草莓核酸
杂交中的应用
王俊丽;葛会波;彭士琪;张红梅;续九如
【期刊名称】《果树学报》
【年(卷),期】2004(21)4
【摘要】用地高辛对胚胎发生晚期丰富蛋白LEA3基因片段(1.0 kh)进行了探针标记。

斑点杂交表明,该探针的检测灵敏度为5 Pg。

用地高辛标记和未标记的标准分子量DL 2000进行杂交时,只检测到2.00、1.00、0.75、0.50 kb4条杂交带。

应用LEA3探针对转基因草莓(Fragaria ananassa Duch.)进行了Southern blot分析,检测到1.0 kh杂交带,表明外源LEA3基因整合到草莓染色体上。

【总页数】3页(P331-333)
【关键词】地高辛;LEA3基因;探针标记;转基因草莓
【作者】王俊丽;葛会波;彭士琪;张红梅;续九如
【作者单位】河北大学生命科学学院;河北农业大学园艺学院;北京林业大学生物科学与技术学院
【正文语种】中文
【中图分类】S668.4
【相关文献】
1.转基因油菜地高辛标记DNA探针杂交检测方法的建立 [J], 刘烜;郑文杰;赵卫东;贺艳;唐丹舟;刘辉
2.地高辛标记核酸探针技术在家兔视网膜C-sis原癌基因检测中的应用 [J], 刘旭阳
3.一种简便且灵敏的核酸杂交新方法——地高辛配基标记探针细胞原位杂交法应用于癌基因表达研究 [J], 鲍家驹;沈德瑜
4.地高辛标记核酸探针技术在家兔视网膜C－sis原癌基因检测中的应用 [J], 刘旭阳
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分子生物学综合试验报告综合实验Ⅰ.Southern杂交（质粒DNA提取、PCR技术体外扩增DNA、质粒载体和外源DNA的连接反应、地高辛标记的Southern杂交）一.实验目的1.学习Southern杂交的原理及操作方法。

2.学习碱裂解法提取质粒的原理。

3.学习PCR反应的基本原理和实验技术；了解引物设计的一般要求。

4.掌握DNA体外连接的基本技能，了解连接反应的注意事项。

二.实验原理利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。

在碱变性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH=的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的碱裂解法提取质粒的主要原理是：利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

聚合酶链反应（PCR）是体外酶促合成DNA片段的一种技术，PCR进行的基本条件：DNA模板（在RT-PCR中模板是RNA）、引物、dNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）、Taq DNA聚合酶、反应缓冲体系。

PCR循环由三个步骤组成：变性、退火、延伸。

每一个循环的产物可作为下一个循环的模板，通过30个左右循环后，目的片段的扩增可达106倍。

DNA片段之间的连接是通过DNA连接酶的催化实现的。

DNA连接酶催化具有平末端或互补粘性末端的DNA片段间相邻碱基通过3’,5’磷酸二酯键连接起来。

最常用的来源于T4噬菌体的T4DNA连接酶。

对于平末端或互补的粘性末端可直接进行连接反应。

一个片段是平末端，另一片段为粘性末端或两个片段都是粘性末端但不配对，则需要通过各种方式使其可一匹配或通过平末端进行连接。

通常采用末端补平、加同聚物尾、加接头等方式是目的片段之间能够匹配。

一、地高辛标记DNA（一）酶切pEHH-HBV质粒1.酶切37℃过夜（时间尽量长一些，以酶切完全）体系DNA 10µgXhoⅠ6µl10×H buffer 10µlddH2O 补至100µl2.胶回收0.8%的胶，80V，50-60min，电泳buffer最好换新的会有6000bp、3182bp、2800bp三条条带3.定量（二）地高辛标记1.体系(或等比例扩大)2-4µgDNA补加ddH2O至16µl2.沸水浴10分钟以变性DNA，然后迅速插入冰水混合物中3.充分混合DIG-High Prime(1号管)，并取4μL加入到变性DNA中，混合并简单离心。

37℃孵育过夜4.加入2μl 0.2M EDTA(pH8.0) 终止反应。

（三）标记效率检测1.将地高辛标记DNA的一系列稀释梯度点到一小块带正电荷的尼龙膜上。

取0.2µl标记的DNA，用DNA稀释液稀释1000倍，再取稀释后的DNA0.2µl，再用DNA稀释液稀释1000倍，根据计算量，点0.1-0.5pg到尼龙膜上。

同时从标记对照DNA的2-9号管中取出1μL点在尼龙膜上。

2.通过紫外交联30分钟将DNA固定在膜上。

3.将膜转移到一个装有20mL马来酸缓冲液的塑料容器中在15-25℃中振荡孵育2分钟。

4.在10mL封阻液中孵育30分钟5.在10mL抗体溶液中孵育30分钟6.用10mL洗涤缓冲液洗涤两次，每次15分钟7.在10mL检测缓冲液中平衡2-5分钟8. 同western发光，将膜上带有DNA的一面朝下，放在点有1mL的随时即用的CSPD(5号管)的Parafilm膜上，孵育5分钟。

正面朝上，放在暗盒里的保鲜膜上，立即将保鲜膜另一面盖到膜上，均匀的铺平底物，且膜上不能有气泡。

9.X光片曝光15-25分钟10.如果0.1pg的点可见，那么说明标记的探针达到了预期的标记效率，能够满足杂交所需的探针浓度二、DNA转移与固定1．DNA 琼脂糖凝胶电泳(120V,30-45min)将待检DNA（DNA可做一个浓度梯度）与核酸上样缓冲液按照比例混匀后，加样于0.8%琼脂糖凝胶孔中电泳（可同时配一块添加EB的胶，以便知道DNA跑到哪个位置），估计待检样本电泳至凝胶中间部分时终止电泳，用刀片切去凝胶左上角作标记来判断凝胶的反正面。

转基因甘蔗植株Southern杂交体系的优化崔学强;张树珍;沈林波;冯翠莲【摘要】对甘蔗Southern杂交体系的优化，旨为转基因甘蔗Southern杂交鉴定分析提供参考。

以转基因甘蔗为材料，就探针不同标记方法的比较、甘蔗基因组DNA的提取、基因组DNA酶切量、酶切时间及杂交过程等方面，对地高辛标记的Southern杂交技术进行了优化研究。

结果表明，改良的CTAB法提取的甘蔗DNA能满足后期实验的要求；PCR法标记探针的效率较随机引物法标记探针的效率高，更适合用于Southern杂交；40μg的DNA在400μL酶切体系中，酶切10 h可获得良好的酶切效果；杂交温度40℃，杂交18 h，可获得清晰的杂交条带。

%Using sugarcane as materials, the DIG-labeled Southern blot was optimized through several key aspects:the comparison of different-labeled probe methods, extraction of sugarcane genome DNA, the amount of enzyme digestion of genome DNA, enzyme digestion time and a serial of procedures in the process of the hybrid. The results showed that sugarcane DNA extracted by the improved CTAB method met the requirements of the latter experiments, the efficiency of PCR-labeled probe was higher than that of random primer-labeled probe, so PCR-labeled probe method was suitable for the Southern blot, 40μg DNA samples in enzyme digestion system of 400μL for 10 hours could achieved desirable digestionresult;while hybrid temperature was 40℃ and hybridizing time was 18 h, a clear hybridization band could be observed. The optimization of sugarcane Southern blot provides a reference for the analysis of Southern blot of transgenic sugarcane.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2015(000)012【总页数】5页(P105-109)【关键词】甘蔗;Southern杂交;地高辛;PCR法标记探针;酶切【作者】崔学强;张树珍;沈林波;冯翠莲【作者单位】海南大学农学院，海口 570228; 中国热带农业科学院热带生物技术研究所甘蔗研究中心农业部热带作物生物技术重点开放实验室，海口 571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所甘蔗研究中心农业部热带作物生物技术重点开放实验室，海口 571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所甘蔗研究中心农业部热带作物生物技术重点开放实验室，海口 571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所甘蔗研究中心农业部热带作物生物技术重点开放实验室，海口 571101【正文语种】中文Southern印迹杂交是一种在分子生物学研究中用来检测基因组DNA中特定序列的通用方法，是研究DNA图谱的基本技术。

地高辛标记核酸探针的标记方法Last revision on 21 December 2020地高辛标记核酸探针的标记方法核酸探针已被广泛用于筛选重组克隆、基因多样性的种性检测和真菌种群内及种群之间的系统发育关系评价。

最早使用的放射性同位素标记核酸探针具有敏感性高、特异性好、分辨力强的特点，但放射性同位素标记也存在着一系列令人困扰的问题,如成本高、探针半衰期短、放射性物质危害人体健康等。

而且在进行放射性同位素标记实验时,需要有专门的实验室及相应的实验保护设施，还需要由经过培训的专业人员来操作,因而限制了在普通实验室进行分子生物学实验。

近几年发展起来的非放射性核酸探针大多通过酶促、光化学和化学手段掺入一种报道基团,这种报道基团可通过高灵敏度的冷光、荧光或金属沉淀等检测系统检测。

另外,应用pH电极或感应器技术的电化学检测系统也有报道。

在这些检测系统中,灵敏度最高的是生物素- 亲合素检测系统和半抗原-抗半抗原地高辛检测系统。

由于生物样品中常含有内源性生物素及生物结合蛋白，生物素标记的核酸探针会发生一些非特异性结合，从而影响实验效果。

与生物素-亲合素系统同样具有高灵敏度，却减少了非特异性结合的地高辛检测系统，已为人们所接受,并得到广泛的应用。

地高辛(Digoxigenin ,DIG) 又称异羟基洋地黄毒甙元，是一种类固醇半抗原分子。

其化学结构如图1 所示。

采用人工方法可以将地高辛的线型间隔臂与dUTP 连接起来,形成DIG-11-dUTP，通过随机引物法或PCR法将其掺入到DNA探针中。

RNA探针的标记是使用噬菌体信息编码的RNA聚合酶，通过体外转录将DIG-11-dUTP掺入到RNA探针中。

寡核苷酸探针的标记则是通过末端转移酶催化，在3'末端加上DIG-11-dUTP/dATP 或DIG-11-ddUTP 尾巴。

对于目的DNA 或RNA 来说，分子杂交后,杂交部分可通过ELISA 实验程序加以检测，即加入一种结合有碱性磷酸酶的地高辛-特异性抗体，它与地高辛半抗原分子形成酶联抗体-半抗原(DIG) 复合物，再加入相应的显色底物，使杂交部分得以显示。

华南农业大学农学院《生物技术》复习题（附答案）一、有关名词遗传标记指可稳定遗传的、易于识别的特殊的遗传多态性形式。

遗传多态性现代遗传学中是指基因组中任何座位上的相对差异或DNA序列的差异。

形态标记简单性状的遗传（普通遗传学）细胞学标记染色体变异与细胞学特征（细胞遗传学）生化标记同工酶与电泳技术（生化遗传学）同工酶是指具有功能相同而结构及组成有差异的一类酶分子标记DNA标记，以染色体DNA上特定的核苷酸序列作为标记。

PCR 聚合酶链式反应。

是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。

RFLP 限制性片段长度多态性。

不同样品DNA经限制性酶酶解所产生片段大小的差异。

RAPD 随机扩增多态DNA。

是以一个寡聚脱氧核苷酸单链作随机引物(primer) ，通过PCR扩增基因组DNA，获得长度不同的多态性DNA片段，然后用凝胶电泳分离扩增片段，经染色来显示扩增片段的多态性。

SSR 简单序列重复。

是一类由几个核苷酸组成的基序（motif）为重复单元串联组成的DNA序列，广泛分布于基因组的不同位置。

AFLP 扩增片段长度多态性。

是一种通过限制性内切酶酶切DNA产生不同长度DNA片段，再结合PCR 技术来检测DNA多态性的分子标记技术。

FM遗传图谱又称遗传连锁图谱。

指反映基因组内基因(遗传标记)在染色体上线性排列顺序及其相对位置的图谱。

分子遗传图谱不同分子标记在染色体上的相对位置或排列情况。

作图群体是指用于遗传作图的符合孟德尔定律的分离群体。

RIL群体即重组近交系群体，是由重组近交系组成的分离群体，由F2经多代自交一粒传使后代基因组相对纯合的群体。

DH群体是由通过对F1进行花药离体培养或通过特殊技术获得单倍体植株再经染色体加倍而获得的加倍单倍体群体。

主效基因又称主基因，是一类控制质量性状的基因，其性状表现为不连续的变异。

微效基因是一类控制数量性状的基因，因此通常称为数量性状座位QTL，其性状表现为连续的变异。

人突变型p53和EB病毒LMP1转基因小鼠的建立(1)】目的：建立含突变型p53和EB病毒LMP1基因的双转基因小鼠模型，为研究突变型p53和EB病毒LMP1基因在鼻咽癌前病变中的交互作用提供有力的工具. 方法：通过分子克隆技术构建含突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的真核表达载体pLMP1p53mt；采用显微注射法将线性化的表达载体注射至小鼠受精卵的雄性原核中，然后将注射存活的受精卵植入假孕母鼠的输卵管；取其产3 wk龄子代鼠进行PCR初选，再通过Southern杂交进一步确证；利用HE染色法观察4 mo龄转基因小鼠不同组织病理变化. 结果：将转基因载体进行了707枚小鼠受精卵的显微注射，然后植入30只假孕母鼠的输卵管中，其中26只母鼠怀孕，移植成功率为86.67%；共出生子代鼠179只;PCR检测显示179只子代小鼠中有9只整合了p53mt和LMP1基因，转基因阳性小鼠比例为5.03％(9／179)，Southern杂交结果进一步证实了9只基因组整合了外源基因的首建者小鼠；随机抽取其中的1只转基因阳性小鼠鼻腔黏膜、鼻咽、食管表现炎症，鼻咽黏膜上皮灶性增生. 结论：成功建立整合人突变型p53和LMP1的转基因小鼠，且表现鼻咽黏膜上皮灶性增生，可为鼻咽癌前病变机制的研究提供手段.【关键词】突变型p53基因；LMP1基因；鼻咽癌前病变；转基因小鼠0引言鼻咽癌（NPC）是我国南方常见的一种恶性肿瘤，在我国南方如广东、广西、福建、湖南等省，发病率居世界首位. 在病理学上鼻咽癌表现为低分化，而临床上则表现为高转移性，其病因、发病机制尚不十分明了. 目前对鼻咽癌的预防效果不太理想，故将鼻咽组织癌变的早期诊断治疗作为鼻咽癌二级预防的主内容具有重大意义. 缺少合适的动物模型是鼻咽癌前病变研究的主障碍，利用基因工程技术复制鼻咽癌前病变动物可为探讨鼻咽癌前病变的机制和寻找鼻咽癌前病变的防治方法提供较理想的模型.1材料和方法1.1材料双基因真核表达质粒pLMP1p53mt由本研究组在前期工作中构建［1］，包括载体pLXSN，受human cytomegalovirus启动子（PCMV）控制的p53mt基因和受EDL2启动子（PEDL2）控制的LMP1基因（图1）. 小鼠供体、受体皆为F1杂交鼠（C57BL/6J雌×CBA雄），假孕雌鼠3 mo龄，结扎雄鼠6 mo龄，上海南方模式生物研究中心繁殖，饲养于SPF级动物房.限制性内切酶SpeⅠ(大连宝生物工程有限公司)；孕马血清促性腺激素(PMSG) (天津实验动物中心); 人绒毛膜促性腺激素(HCG) (上海生化制药厂)；M2，M16胚胎培养液、透明质酸酶及矿物油（Sigma公司）； PCR试剂盒（Promega公司）；小量质粒DNA抽提试剂盒（Plasmid Mini Kit tip 20）、凝胶纯化QIAGEN试剂盒（德国QIAGEN公司）；地高辛标记试剂盒、p53mt多克隆抗体和免疫组化检测试剂盒（博士德公司）；LMP1 mAb (美国Vector公司)；其他常规试剂均为国产分析纯试剂. 用Olympus倒置显微镜和体视显微镜，显微注射系统及制针设备（日本Narishige）、胚胎培养器皿（Falcon 3037，3003）、显微注射用针自制、紫外凝胶成像系统（美国BioRad公司）、紫外分光光度计（岛津，日本）、PCR扩增仪（PE公司）、高速冷冻离心机（Sigma公司）、CO2孵箱（BINDER）、超净工作台（苏净集团安泰公司）.应用PCGENE软件包根据注射线性载体序列资料自行设计，共选取2对引物用于转基因阳性鼠鉴定，由上海生工生物工程技术公司和上海申友生物技术公司合成. 引物1用于PCR检测转基因动物体内的p53mt基因，上游序列为：5′CAAGATGTTTTACCAACTGGCC3′，含p53基因的突变位点，下游序列为：5′CAGCTCGTGGTGAGGCTCC3′，产物为504 bp. 引物2检测LMP1基因的整合，上游序列为：5′CGGAATTCATGGCGGCGGTGATCCACA3′，下游序列为：5′GATAGGATCCCTCGAGAGTGAGGCACA3′，扩增目的条带为782 bp.作者：何迎春，田道法，卢芳国，毛积芳【关键词】鼻咽癌前病变Construction of transgenic mice containing huma本篇论文是由3COME文档频道的网友为您在网络上收集整理饼投稿至本站的，论文版权属原作者，请不用于商业用途或者抄袭，仅供参考学习之用，否者后果自负，如果此文侵犯您的合法权益，请联系我们。

Sourthern杂交技术摘要: 使用sourthern杂交技术来检测转基因植物中插入外源基因拷贝数。

以含有外源基因水稻转基因植株叶片为材料, CTAB法少许抽提总DNA, 总DNA经限制性内切酶切割、琼脂糖凝胶电泳、转移尼龙膜上, 最终与地高辛标识探针进行杂交。

经过条带有没有来判定是否为含有外源基因转基因植物, 条带多少反应了转基因植株中外源基因拷贝数。

结果:关键词: 抽提酶切转膜探针杂交Southern 杂交是分子生物学经典试验方法。

该项技术广泛被应用在遗传病检测、DNA指纹分析和PCR产物判定等研究中。

但因为该技术操作比较烦琐、费时, 所以现在有部分其她方法能够替换Southern 杂交。

但该技术也有它独特之处, 是现在其她方法所不能替换, 如限制性酶切片段多态性(RFLP)检测等。

1材料与方法1.1材料及试剂水稻转基因植株叶片、限制性内切酶HindⅢ、尼龙膜、地高辛标识系统试剂盒等。

1.2水稻总DNA少许抽提CTAB法抽提DNA步骤:(1)采取新鲜幼嫩叶片在研钵中用液态氮冷冻, 研磨成细粉;(2)取约0.4g左右细粉于1.5ml离心管, 加入1ml预热至95ºC以上1.5⨯CTAB, 混匀;(3)65ºC水浴中放置30分钟以上, 每隔5分钟上下颠倒混合数次(DNase变性, 促进内溶物释放);(4)1g离心2分钟;(5)吸收600μl上清于新1.5ml离心管, 加入等体积氯仿/异戊醇（24:1）, 上下颠倒混合至下层有机相呈深绿色;(6)1g离心5-10分钟;(7)吸收450μl上清于新1.5ml离心管, 加入两倍体积95％乙醇和1/10体积3M NaAc, 轻轻上下颠倒混匀至白色絮状沉淀出现;(8)1g离心10分钟;(9)弃去上清, 用500μl 75％乙醇浸洗沉淀5分钟, 除去离子及CTAB残余, 1g离心5分钟,弃上清,自然干燥;(10)加入50μlTE（含20μg/ml RNaseA）, 放于4ºC溶解;(11)充足溶解后, 测定并调整浓度。

地高辛配基标记DNA打点杂交和原位杂交...张燕华;戴保民【期刊名称】《华西医科大学学报》【年(卷),期】1992(23)4【摘要】应用一种新的非放射标记物地高辛配基(DIG)制备黄疸出血群赖型017株钩端螺旋体DNA(017DNA)探针,与^(32)P和光敏生物素标记017DNA探针对照打点杂交检测钩端螺旋体DNA。

结果,上述三种探针均能检测到不同群型的问号状钩体,DIG探针的敏感性为0.1pg,^(32)P和光敏生物素探针的敏感性分别为1 pg和10pg。

以上探针均不能检测双曲钩体patoc型Patocl株、细螺旋体illini 型3065株,与其它致病菌及人白细胞DNA也无明显杂交信号。

DIG标记017DNA探针原位杂交检测感染017株钩体的豚鼠系列组织切片和血浆涂片,以对比度极大的着色反应,清晰地显示各组织和血浆中的钩体形态。

细螺旋体illini型3055探针和HBV-DNA探针不能检测到上述标本中的钩体.【总页数】5页(P353-357)【作者】张燕华;戴保民【作者单位】不详;不详【正文语种】中文【中图分类】R514.404【相关文献】1.一种简便且灵敏的核酸杂交新方法——地高辛配基标记探针细胞原位杂交法应用于癌基因表达研究 [J], 鲍家驹;沈德瑜2.地高辛配基标记HBVDNA探针与生物素标记探针用于肝组织原位… [J], 玉小飞;赵连三3.用地高辛配基标记DNA探针进行菌落原位杂交 [J], 蒋三亮;张思仲4.用3H和地高辛配基标记TNF—a cDNA探针进行原位杂交的比较 [J], 刘天菊;司履生5.地高辛配基标记cDNA探针快速检测登革热病毒的研究 [J], 王树声;刘明团;梁富雄;陈锦华;陈斌;傅德坚因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

生物技术通报ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＢＵＬＬＥＴＩＮ・技术与方法・２００８年第３期收稿日期：２００７－１１－１９基金项目：国家自然科学基金（Ｎｏ．３０４６０００８）作者简介：刘立鸿（１９８２－），男，硕士生，生化与分子生物专业，Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｊｌｉｕｌｉｈｏｎｇ１２３４＠１２６．ｃｏｍ通讯作者：马正海（１９７１－），男，副教授，硕士生导师，Ｅ－ｍａｉｌ：ｍｚｈｘｊｕ＠ｓｏｈｕ．ｃｏｍ自１９７５年英国科学家Ｅ．Ｍ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ创立Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交技术以来，该技术已成为检测特定ＤＮＡ片段的经典杂交方法之一［１］。

此法快速、准确、灵敏，目前已经广泛地应用于医学、病毒学、转基因动植物鉴定、动物疾病诊断以及ＤＮＡ指纹分析等方面的研究。

Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交中使用的标记探针有同位素与非同位素标记２种。

放射性同位素标记的探针灵敏度较高，但存在半衰期限制，对操作者和环境会造成放射性辐射危害。

使用非同位素标记探针可避免放射性危害［２］，常规实验室大多采用后者，其中最常用的是地高辛标记探针［３］。

目前虽然有地高辛标记探针标记的试剂盒，但是试剂盒侧重于步骤流程描述，关于技术要点的介绍不是很多。

国内关于地高辛标记探针Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交法技术要点报道也较少。

在开展Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交中，参照文献并结合实验室的具体情况对该技术的具体步骤进行了一些探索和改进，现作一总结。

１技术要点１．１地高辛探针的标记与使用１．１．１探针的标记方法标记方法有缺口平移法、末端标记法、随机引物法和聚合酶链反应法（ＰＣＲ）等。

Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交探针的制备一般用随机引物法，模板量应达到１μｇ以上，模板量不足１μｇ，可适当延长３７℃温育时间。

当模板序列已克隆在载体上，地高辛标记探针Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交技术要点及改进刘立鸿１许璐１汪凯２张富春１马正海１（１新疆大学生命科学与技术学院分子生物学重点实验室新疆生物资源基因工程重点实验室，乌鲁木齐８３００４６；２中国科学院上海巴斯德研究所，上海２０００２５）摘要：Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交技术是检测特定ＤＮＡ片段的常规方法之一，其操作程序繁琐，对基因组ＤＮＡ的提取、纯化、酶切等均有较高要求，要获得理想杂交结果需要反复摸索。

・研究报告・生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2014年第8期Southern 印迹杂交技术因其高灵敏度、高特异性已成为检测关键性DNA 片段的经典方法之一［1］，目前广泛应用于分子生物学和基因工程等研究领域。

Southern 杂交探针分为放射性和非放射性两类［2］，早期以同位素标记的放射性探针为主，具有较高的灵敏度和特异性，但存在半衰期，易造成放射性污染。

非放射性地高辛（DIG）标记探针具有敏感性高、方便、安全和探针储存期长等优点，得到了广泛的应用［3-5］。

探针标记的方法主要有随机引物延收稿日期： 2014-03-28基金项目：国家自然科学基金项目（31200503），现代农业产业技术体系建设专项（NYCYTX -34）作者简介：李季，男，博士，助理研究员，研究方向：橡胶树转基因后代分子检测及橡胶树内源启动子的克隆；E -mail ：appleliji@ 通讯作者：黄华孙，男，研究员，研究方向：橡胶树种质创新与遗传育种；E -mail ：xjshhs@橡胶树转基因植株Southern 杂交体系的优化李季1 鲁旭1，2 黄天带1 华玉伟1 黄华孙1（1. 中国热带农业科学院橡胶研究所 农业部橡胶树生物学重点开放实验室，儋州 571737；2. 海南大学农学院，海口 570228）摘 要： 以地高辛标记的Southern 杂交技术已广泛应用于多个物种中。

选择橡胶树为材料，就基因组DNA 的提取、探针标记方法的选择以及具体的杂交操作过程等方面对该体系进行了优化。

结果表明，至少40 μg 高质量的DNA 在300 μL 的大酶切体系中，酶切12 h 可获得良好效果；PCR 法标记的探针杂交条带清晰、背景浅，其效率明显强于随机引物法标记的探针。

本研究优化的体系信号强、背景浅和灵敏度高，为橡胶树Southern 杂交鉴定分析提供参考。

关键词： 橡胶树 转基因 Southern blot 地高辛 PCR 法标记Optimization of Digoxigenin Based Southern Blot for Transgenic Heveabrasiliensis AnalysisLi Ji 1 Lu Xu 1，2 Huang Tiandai 1 Hua Yuwei 1 Huang Huasun 1（1. Rubber Research Institute of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences & Key Laboratory of Rubber Biology ，Ministry of Agriculture ，Danzhou 571737；2. College of Agriculture ，Hainan University ，Haikou 570228）Abstract: Southern blot technology based on the DIG -chemiluminescent detection has been widely used in numerous species. Using Hevea brasiliensis as materials, the DIG -labeled Southern blot analysis was improved through optimizing several key steps, including extraction of genome DNA, usage of DNA samples amount, digestion system, the comparison between PCR and random -primed labeled method and a serial of procedure in the process of the hybrid. The results showed that desirable digestion result could be achieved when at least 40 μg DNA samples with high quality were enzymed in 300 μL reaction system for 12 hours. The efficiency of probe labeled with the method of PCR was higher than that of probe labeled with random primer obviously, while the Southern blot result of PCR labeled was clear, and the background was lightly, which was conducive to read the copy number accurately. Finally, Southern blot with DIG -labeled was optimized, and good result with high sensitivity and low background was achieved．Key words: Hevea brasiliensis Transgene Southern blot DIG labeling PCR labeled method伸标记法、缺口平移法、末端标记法、PCR 法和荧光标记法等。

Southern杂交探针标记及检测试剂盒：DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II （detection with CSPD）原理所谓DNA探针，实质上是一段已知的基因片段，应用这一基因片段即可与待测样品杂交。

如果靶基因和探针的核苷酸序列相同，就可按碱基配对原则进行核酸分子杂交，从而达到检查样品基因的目的。

在随机引物法标记反应液中，有随机合成的六聚体核昔酸(hexanucleotide)作为引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP 和DIG-dUTP作为合成底物，以单链DNA作为模板，在Klenow酶的作用下，合成掺入地高辛的DNA链。

以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后，再通过免疫反应来进行检测。

一般通过酶标抗地高辛抗体来检测，就可以肯定杂交反应的存在。

免疫检测采用CSPD发光曝光到X光片。

试剂盒内容：1. DIG-High Prime，vial 1，50ul（5×）；2. 地高辛标记的对照DNA，vial 2，20ul（5ug/ml pBR328 DNA）；3. DNA稀释缓冲液，vial 3，（3×1ml）；4. AP Conjugate，vial 4，50ul（750U/ml）；开封后2-8℃稳定保存。

5. CSPD，vial 5，50 ml；开封后2-8℃避光稳定保存。

6. Blocking solution（封闭液），vial 6，4×100ml（10×）；开封后应分装，在-15～-25℃稳定保存，或2-8℃保存1个月，工作液应现用现配。

7. DIG Easy Hyb Granules，vial 7，4×100ml。

表1 需准备的其他试剂及设备过程设备试剂DIG标记探针水浴、电炉双蒸水，灭菌；0.2 M EDTA溶液（pH 8.0），灭菌。

探针灵敏度检测尼龙膜（Hybond-N+ NylonMembrane）洗脱缓冲液马来酸缓冲液检测缓冲液转膜转膜装置、紫外交联装置或烘箱TBE，酸变性液，碱变性液，中和液，20×SSC杂交电炉、冰水混合物、尼龙膜、杂交炉、杂交瓶20×SSC，1% SDS免疫检测洗脱缓冲液；马来酸缓冲液；检测缓冲液；重新杂交水浴20×SSC；1% SDS；1 M NaOH试剂配制：1. 马来酸缓冲液——0.1 M马来酸（M.W. 116.1），0.15 M NaCl，NaOH固体调pH至7.5，常温（称取11.61g马来酸，8.77g NaCl，定容至1000mL，高压灭菌）。

Southern印迹杂交实验原理和方法-3真空转移法的最大优点是迅速，可在转膜的同时进行DNA变性与中和整个过程约需3 0～60分钟。

但在操作中应注意两个问题，一是真空压力不能太大，若压力过大，凝胶被压缩，转移效率会降低；二是真空转移液要密封严，防止漏气影响压力的产生。

下表列出了不同的印迹方法。

表10－2 不同印迹方法的比较表五、探针标记用于Southern印迹杂交的探针可以是纯化的DNA片段或寡核苷酸片段。

探针可以用放射性物质标记或用地高辛标记，放射性标记灵敏度高，效果好；地高辛标记没有半衰期，安全性好。

人工合成的短寡核苷酸可以用T4 多聚核苷酸激酶进行末端标记。

探针标记的方法有随机引物法、切口平移法和末端标记法，详细方法参见本书相关章节。

这里介绍放射标记。

以下为 Promega公司随机引物试剂盒提供的标记步骤：（一）取25～50mg模板DNA于0.5ml离心管中，100℃水浴5min，立即置冰浴。

（二）在另一个0.5ml离心管中加入：Labeling 5×Buffer (含随机引物) 10μldNTPmix(含dCTP.dGTP.dTTP各0.5mmol/L) 2μlBSA(小牛血清蛋白) 2μl[α-32ρ] dATP 3μlKlenow 酶 5U（三）将变性模板DNA加入到上管中，加ddH2O至50μl混匀。

室温或37℃ 1h.（四）加50μl终止缓冲液终止反应标记后的探针可直接使用或过柱纯化后使用。

由于α-32ρ的半衰期只有14天，所以标记好的探针应尽快使用。

探针的比活性最好大于 1091计数/分/μl。

六、预杂交（prehybridizafion）将固定于膜上的DNA片段与探针进行杂交之前，必须先进行一个预杂交的过程。

因为能结合DNA片段的膜同样能够结合探针DNA，在进行杂交前，必须将膜上所有能与DNA结合的位点全部封闭，这就是预杂交的目的。

预杂交是将转印后的滤膜置于一个浸泡在水浴摇床的封闭塑料袋中进行，袋中装有预杂交液，使预杂交液不断在膜上流动。

Southern 杂交Southern 杂交是分子生物学的经典实验方法。

其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。

(Q往圣科技3452125268提供12万种免费质粒)通过Southern杂交可以判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。

该项技术广泛被应用在遗传病检测、DNA指纹分析和PCR产物判断等研究中。

但由于该技术的操作比较烦琐、费时，所以现在有一些其他的方法可以代替Southern杂交。

但该技术也有它的独特之处，是目前其他方法所不能替代的，如限制性酶切片段的多态性(RFLP)的检测等。

一、基因组DNA的制备（前述）(Q往圣科技3452125268提供Science的CRISPR/cas9免费送)二、基因组DNA的限制酶切(Q往圣科技3452125268提供12万种CRISPR/cas9免费送)根据实验目的决定酶切DNA的量。

(Q往圣科技3452125268提供张峰Science的CRISPR/cas9免费送)一般Southern杂交每一个电泳通道需要10-30μg的DNA。

购买的限制性内切酶都附有相对应的10倍浓度缓冲液，并可从该的产品目录上查到最佳消化温度。

为保证消化完全，一般用2-4U的酶消化1μg 的DNA。

消化的DNA 浓度不宜太高，以0.5μg /μl 为好。

由于内切酶是保存在50%甘油内的，而酶只有在甘油浓度<5%的条件下才能发挥正常作用，所以加入反应体系的酶体积不能超过1/10。

具体操作如下：在1.5ml离心管中依次加入DNA（1μg /μl）20 μg10×酶切buffer 4.0 μl限制性内切酶（10U/μl） 5.0 μl加ddH2O 至500 μl在最适温度下消化1-3hr。

消化结束时可取5μl电泳检测消化效果。

如果消化效果不好，可以延长消化时间，但超过6hr已没有必要。

专利名称：一种用地高辛标记寡核苷酸着丝粒探针应用于原位杂交的方法
专利类型：发明专利
发明人：不公告发明人
申请号：CN202010017374.X
申请日：20200108
公开号：CN112280826A9
公开日：
20210420
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供了一种用地高辛标记原位杂交着丝粒探针的方法，属于分子生物学核酸标记技术领域。

该用地高辛标记原位杂交着丝粒探针的方法，主要用于将地高辛标记到着丝粒探针上，然后该着丝粒探针能应用于FISH探针，达到检测着丝粒变化的目的。

本发明提供的用地高辛标记原位杂交着丝粒探针的方法能有效标记地高辛分子到寡核苷酸上，可应用于分子标记和临床分子诊断的研究。

申请人：广州市外显子生物技术有限公司
地址：510300 广东省广州市海珠区敦和路189号大院第2栋自编404、405房
国籍：CN
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