《中国药典》2005年版微生物限度检查的方法学验证微生物限度检查的范围根据药品使用要求,把药品化为两大类:(1) 规定灭菌药品:(2) 非规定灭菌药品:在非灭菌的各种制剂中,对每克或每毫升的药品按剂型或品种不同规定(1)染菌量检查:包括细菌数,霉菌数及酵母菌数测定,以检查这几类微生物对药品的污染程度.(2) 控制菌检查:包括大肠埃希菌,大肠菌群，沙门菌,金黄色葡萄球菌及铜绿假单孢菌,生孢羧菌及白色念珠菌.药品微生物限度检验中的困难,最根本的原因在于检验对象本身的特殊性.(1) 不确定性:(2) 分布的不均匀性:(3)活体特征:药典中以活的微生物作为检验对象也是独特特性.验证的目的确认所采用的方法适合于供试品的微生物限度检查,即确认供试品在该检验量、该检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性以已被充分消除到可以忽略不计。
保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。
验证的类型（1）建立药品的微生物限度检查法时。
（2）修订的检验方法。
（3）供试品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时。
（4）定期的验证。
（5）同一产品不同批次、不同企业生产的同一产品。
当建立药品的微生物限度检查方法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数的方法学验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定。
验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及下列要求进行，对各试验菌的回收率逐一进行验证。
微生物限度检查样品（1）首先应是合格的样品。
（2）本底微生物太多可以先灭活，但不应因此影响药效。
供试液的制备制剂形式多样，决定前处理各异1.液体供试品取供试品溶液10ml,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,混匀作为1:10的供试液.油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀.水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液.2.固体、半固体或粘稠性供试品取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,混匀作为1:10的供试液.必要时加入适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀.增订：3.需要特殊供试液制备方法的供试品（1）非水溶性供试品（2）非水溶性膜剂供试品二部未变动，化学药膜剂取100cm2，剪碎，加100ml pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，浸泡，振摇，作供试液。
一微生物的基本培养技术【知识链接】一、培养基的配制1.培养基的概念:人们按照微生物对营养物质的不同需求,配制出供其生长繁殖的营养基质——培养基,用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
2.培养基的种类:3.营养组成:各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐,此外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。
4.培养基特殊需求:(1)培养乳酸杆菌时,在培养基中添加维生素。
(2)培养霉菌时,将培养基调至酸性。
(3)培养细菌时,将培养基调至中性或弱碱性。
(4)培养厌氧微生物时,需要提供无氧的条件。
二、无菌技术1.目的:防止实验室的培养物被杂菌污染(获得纯净培养物);有效避免操作者自身被微生物感染。
2.关键:防止杂菌污染。
3.常见方法:(1)概念:①消毒:使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部的一部分微生物(不包括芽孢和孢子)。
②灭菌:使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物(包括芽孢和孢子)。
(2)类型与方法:连一连:将无菌技术类型、常用方法和适用对象用线连起来。
三、微生物的纯培养1.微生物纯培养的概念:由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物,获得纯培养物的过程就是纯培养。
2.酵母菌的纯培养:3.基于对酵母菌接种过程的理解,下列接种过程正确的顺序是baefcgd。
知识点一培养基的配制1.培养基的种类、特点及作用的分析:【特别提醒】常见选择培养基举例①缺少氮源的培养基可以筛选利用大气中N2的微生物。
②含青霉素的培养基可淘汰细菌,筛选出真菌。
③无有机碳源的培养基可筛选出自养生物。
2.培养基的成分、功能及来源分析:【特别提醒】有关培养基营养物质的三点提醒(1)培养不同的微生物所需要的营养物质可能不同。
①自养型微生物的培养基主要以无机营养为主。
②异养型微生物的培养基主要以有机营养为主。
(2)微生物需要补充生长因子,是由于缺乏合成这些物质所需要的酶或合成能力有限。
(3)微生物需要量最大的是碳源,能合成含碳有机物的是自养型,反之则为异养型。
第2课时微生物的选择培养和计数[学习目标] 1.阐明微生物选择培养的原理。
2.进行土壤中分解尿素的细菌的分离和计数。
一、选择培养基、微生物的选择培养和数量测定1．选择培养基(1)自然界中目的菌的筛选①实例：聚合酶链式反应(PCR)中用到的耐高温的DNA聚合酶，就是从热泉中筛选出的水生栖热菌中提取出来的。
②依据：水生栖热菌能在70～80℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
(2)实验室中目的菌的筛选①原理：人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度和pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。
②方法：利用选择培养基分离。
选择培养基：允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
2．微生物的选择培养(1)方法：对样品进行充分稀释，然后将菌液涂布到制备好的选择培养基上。
(2)稀释涂布平板法的操作过程①系列稀释操作a．编号为1×102～1×107试管中分别盛有9mL无菌水。
b．将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。
c．取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
②涂布平板操作取菌液：取0.1mL菌液，滴加到培养基表面|↓涂布器消毒：将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中|↓涂布器灭菌：将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布|↓涂布平板：用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。
涂布时可转动培养皿，使涂布均匀(3)培养：待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37℃的恒温培养箱中培养1～2d 。
3．微生物的数量测定(1)稀释涂布平板法①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
②计数原则：一般选择菌落数为30～300的平板进行计数。
样品的稀释度将直接影响平板上的菌落数目，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养。
第2节微生物的培养技术及应用第1课时微生物的基本培养技术一、培养基的配制1．培养基人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
2．培养基的种类3．培养基的营养组成各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐等营养物质，此外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。
二、无菌技术1．获得纯净的微生物培养物的关键：防止杂菌污染。
2．消毒和灭菌消毒灭菌概念使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子常用方法煮沸消毒法、巴氏消毒法、酒精消毒法、紫外线消毒法湿热灭菌、干热灭菌、灼烧灭菌适用对象操作空间、双手等接种环、接种针、玻璃器皿、培养基等(1)对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。
(2)将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。
(3)为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。
(4)实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。
三、微生物的纯培养1．纯培养：在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物。
由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。
2．微生物纯培养的步骤：微生物的纯培养包括配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤。
3．酵母菌的纯培养(1)菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。
(2)获得单菌落的方法：平板划线法和稀释涂布平板法。
判断对错(正确的打“√”，错误的打“×”)1．液体培养基含有水，而固体培养基不含水。
( ) 2．获得纯净微生物培养物的关键是防止杂菌污染。
() 3．用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基都要进行消毒。
() 4．培养基分装到培养皿后进行灭菌。
() 5．平板冷凝后应将平板倒置，防止皿盖上的冷凝水落入培养基，造成污染。
