红笛鲷NCCRP-1基因原核表达条件的优化及纯化

cDNA末端快速扩增技术(RACE)的优化与改良李关荣1,2,鲁 成2,夏庆友2,向仲怀2(1.西南农业大学农学与生命科学学院,中国重庆 400716;2.西南农业大学蚕学与生物技术学院,中国重庆 400716)摘 要:cDNA末端的快速扩增(RACE)法是延伸已知部分外显子序列和克隆全长cDNA基因的主要方法之一.广泛用于许多已知功能基因片段的进一步延伸和全长cDNA的克隆.但由于其过程复杂、涉及多步连续的酶促过程,如反转录、Td T加尾、第二链合成、RACE-PC R扩增及RACE产物克隆等,在实际应用中有许多问题和相当难度.主要针对RACE各步骤中存在的问题进行了分析,并对其优化和改良进行了综述.关键词:cDNA末端的快速扩增法;优化;改良中图分类号:Q781 文献标识码:A文章编号:1007-7847(2003)03-0189-09The Optimization and Improvement of Rapid Amplificationof cDNA Ends(RACE)LI Guan-rong1,2,LU Cheng2,XIA Qing-you2,XIANG Zhong-huai2(1.College of Agronomy and Li f e Sciences,Southwest Agricultu ral University,Chon gqin g400716,China;2.College o f Sericultu re an d Biotechnology,Southwest Agricultura l Un iversity,Chon gqin g400716,China)Abstract:Rapid amplification of cDNA ends(RAC E)is one of the main methods for extending partially known e xon sequence and cloning of its ful-l length cDNA.It has been widely used in further extending of functional fra gments of genes of interests especially the cloning of the ful-l length cDNAs.RACE involves multiple enzyme-catalyzed processes,such as reverse transcription,TdT tailing,the sec ond-strand cDNA synthesis,RACE-PCR a mplification and the cloning of RACE products,which in practice have many problems and difficulties.These problems are analyzed in depth and the optimiza tions and improvements on each of the processes are revie wed. Key words:RACE;optimization;improve ment(Life Science Research,2003,7(3):189~197)cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)是扩增在mRNA的3 -末端或5 -末端的未知序列和已知部分外显子序列间的核酸序列的方法.此种单边特异性的扩增又称为 单边PC R (One-sided PC R)或锚定PCR(Anchored PC R).通常扩增复杂混合物中相对较少的目标分子的PCR要求扩增序列段的两个序列特异性引物,但为了扩增和鉴定未知序列区域,此种要求就构成了严重的局限.3 -和5 -RACE法提供了解决此问题的可能方法.这两种方法的结合可望获得全长cDNA基因.1 RAC E技术的原理及步骤3 -RACE利用mRNA3 -末端天然存在的Poly第7卷 第3期2003年9月 生命科学研究Life Science ResearchVol.7 No.3Sep.2003收稿日期:2003-04-01;修回日期:2003-08-08基金项目:国家自然科学基金资助项目(30070580)作者简介:李关荣(1963-),男,四川营山人,西南农业大学副教授,博士,主要从事生物化学与功能基因克隆研究,Tel:+86-023-********,E-mail:lgrxn@(A)尾作为PCR扩增的通用引发点.首先用反转录酶和Oligo-dT接头引物对mRNAs进行反转录,使之转换为cDNA.然后,用一个能与已知外显子序列区退火的基因特异引物(GSP)和定位在Poly(A)尾部的接头引物直接进行PCR,扩增特异cDNA.这样,就能捕获位于外显子和Poly(A)尾之间的未知3 -mRNA序列.5 -RACE是一种从低拷贝信息中分离和鉴定5 -末端未知序列的方法.Frohman和Loh都综述过此法[1,2].尽管不同的使用者采用的具体的步骤略异,但策略是一致的.第一链cDNA的合成使用基因特异的反义寡核苷酸(GSP1)引发,使特异的mRNA及其相关家族转换为c DNAs,使完全延伸到5 -末端的潜力达到最大.第一链cDNA产物经纯化,去除未渗入的dNTPs和GSP1,用末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT)在cDNA的3 -末端加同聚尾[poly(T)或Poly(C)].最初,加尾后的cDNA用3个引物的混合物(在GSP1的3 -末端退火的基因特异性引物GSP2、互补的含同聚尾的锚定引物和相应的接头引物)进行PC R扩增.这使mRNA的5 -末端和GSP2间的未知序列得以扩增.RACE方法多用于传统cDNA克隆方法不易检测或挑战性极大的稀有mRNA的扩增和克隆. RACE也可用于已有的cDNA文库.随机六聚体引发合成的c DNA也曾用于5 -RACE从单一第一链反应中扩增和克隆了多个基因.RACE产物可直接测序,勿需任何中间克隆步骤;或用于制备探针.3 -RACE和5 -RAC E的产物可以结合得到全长cDNA.RACE法还可与外显子捕获法结合鉴定未知编码区序列.RACE法的重要特征是在PCR中使用一个根据mRNA的已知序列而设计的基因特异引物(GSP)和一个与mRNA的Poly(A)尾互补的 通用引物 (3 -RACE)或与添加在cDNA的3 -末端的同聚尾互补的 通用引物 (5 -RAC E).因同聚物不是良好的PCR引物,为了便于RACE产物的克隆,通用引物的5 -末端常引入一个限制性位点.用于RACE-PCR的cDNA模板可用Oligo-dT引物(3 -和5 -RACE),也可用与mRNA中的已知序列互补的引物(仅5 -RACE).在RACE-PCR产物复杂时,可取一等分的产物用第二个(在第一个引物内)特异的引物和原来的通用引物进行第二轮PC R,此为所谓的Nested PCR.2 RACE步骤的优化和改良2.1 反转录影响RACE结果的最关键步骤是mRNA的反转录合成第一链cDNA.这在克隆全长mRNA的5 -末端时尤其突出,因为不完全的cDNA仍然可以用TdT加尾和其后被PCR扩增.这些不完全分子与全长分子具有相同的末端,它们和全长分子都可以在PCR中扩增.这些不完全cDNA的存在,极大降低甚至不能产生代表全长cDNA的PCR产物,因为在有异质和具相同末端底物的PC R反应液中,较小的DNA分子较易发生扩增[3].因此,应当优化反转录过程,尽可能地避免不完全cDNAs的产生,因而必须使用高质量的、未被降解的mRNA.常用一步分离法[4],从组织或少量组织培养细胞中提取总RNA,对于大量的组织培养细胞,可采用胞质RNA制备方法制备[5].还有人建议用oligo(dT)-cellulose或用试剂盒纯化RNA,去掉非腺苷酸化的RNAs.使用poly(A)-mRNA可以避免含内含子序列的c DNAs的产生和克隆.如果材料足够,可用与RACE等量的RNA样品进行电泳、Northern印迹.用已知cDNA序列做探针检测,以证实目的序列存在且并未明显降解.但是,即使高质量的mRNA,在反转录过程中也会产生许多不完整的cDNAs.通常认为,这种切短的cDNAs的产生是由于反转录酶在有稳定的二级结构的mRNA区不能继续进行聚合反应所致[6]. GC AU比率高的转录本及含有稳定的二级结构区,更有可能产生切略了的cDNAs.在反转录过程中降低mRNAs二级结构稳定性的一个有效方法是在反应前提高反应混合物的温度(37~42 ).嗜常温的反转录酶(AMV-RT和MMLV-RT)只能在低于大约50 的温度下起作用.现已有热稳定的DNA聚合酶,可以在很高的温度下(60~70 )有活性.在此温度下,RNA的二级结构不稳定,反转录可以更容易进行到mRNA分子的5 -末端.在某些条件下,可以反转录mRNA的嗜热DNA聚合酶主要有rTth(PE公司)和TetZ(Amersham).甚至Taq酶也有表现出反转录酶活性的报道.虽然r Tth酶较嗜常温的反转录酶对二级结构不敏感[7],但也有不足.首先,r Tth主要是一个DNA 指导的DNA聚合酶,其最适温度在70 ,与嗜常温的反转录酶的操作温度相比,更有利于DNA的去稳定.因此,更有可能引发污染的基因组DNA发190 生 命 科 学 研 究 2003年生延伸.DNA的污染问题可以通过用RNase-free DNase进行预处理而很容易避免[8].其次,高于15 min的反转录反应,在最适聚合酶活性所要求的高温和二价阳离子(Mn2+)的存在下,由于RNA的快速水解,偏向于产生切略的cDNAs.部分降解的RNAs分子可以引发反转录,产生不完全的cDNAs.此种现象可能会导致rTth产生长于1kb的cDNA 的合成能力下降,因为长的延伸需要长的温育时间,而时间的延长又会增加模板降解(水解).因此,反转录的时间应控制在15min之内,需要反转录的区域应控制在最小长度.因此,在用RACE扩增、克隆5 -末端时,反转录应采用特异引物而不是oligo (dT),且此引物应尽可能定位在远离部分cDNA的5 -末端,以便保留足够的序列以设计两个PCR内引物和第3个检测特异PCR产物的Southern杂交区.另外,因为全长cDNA只有在酶分子和模板分子的比例为1或较高的情况下才能有效产生,在反转录反应中不应使用过量的RNA或cDNA引物.究竟多少量的RNA才会造成模板过剩,只能通过经验确定.有证据表明,对大多数方法中引物浓度可以在数个数量级内变化.2.2 TdT加尾和第二链cDNA的合成标准的RACE要求把第一链cDNA用TdT酶加上一个脱氧核糖核酸同聚尾[1,2,9].然后此同聚尾作为下步与锚多聚连接物杂交的底物.锚多聚连接物有一个3 -末端同聚物锚(N)15,可与cDNA的同聚尾互补,然后由锚(N)15引发第二链cDNA的合成.但此法也可能失败或促进无关产物的形成.为了使同聚加尾成功,反转录后自由的核苷酸和过剩的cDNA引物必须除去.如果自由的核苷酸未除去,它将被TdT加入到3 -末端cDNA尾中去,从而干扰互补同聚物尾与锚引物的杂交.如果不除去过剩的cDNA引物,其3 -末端将与c DNA末端竞争加尾,从而降低cDNA加尾的效率.加尾的cDNA 引物还可以与加尾的锚引物退火,与cDNA发生竞争,从而降低第二链cDNA合成的效率.这些小分子将会在下步用锚引物PCR反应中作为退火和延伸的底物,降低PCR的效率[10].为了去除过剩的自由核苷酸和引物,可采用分子排阻类方法如Centricon microc oncentrator(Amicon)[7].但更简便、更经济有效的方法是使用1 4体积的10mol L醋酸胺和3倍体积的100%的乙醇的两步沉淀法.5 -RACE加尾一个主要问题是所有的cDNAs,无论是不是全长,都被TdT加尾.一旦锚引物加到第二链合成中,这些切略了的cDNAs会在PCR中与全长产物竞争扩增[7].如果切略了的cDNA比全长cDNAs短得多的话,它们就可发生趋向性扩增[3],使得PCR反应不能积累足量的全长cDNA,因而不能检测到目的产物,降低这些切略了的cDNAs产生的唯一方法是优化反转录过程[7].另一个导致切略cDNAs产生的原因可能存在于第二链合成中.如果目标cDNA含有与anchor (N)15同聚尾互补的数个核苷酸构成的同聚物区,第二链合成就可从这个内部序列处引发,而不是从末端同聚区,从而会产生切略的第二链.Anchor(N)15的内部引发可以用许多方法克服.因为A T配对比G C配对的氢键要弱得多,使用A和T同聚物尾趋向于产生较少的内部引发[7,8].但是,对于富含AT的基因组中,anchor(N)15的内部引发率却较高[11].另一种降低非特异性的anchor (N)15引发的方法是在第二链合成中避免使用太多的引物或太低的杂交温度.2.3 加尾的其它替代方法上述加尾策略本身存在许多缺陷,有几个研究组独立地设计了RACE技术的改良方法以绕过cDNA的TdT介导的加尾.所有这些改良方法都使用RNA ligase以共价方式把寡核苷酸锚连在cDNA 的5 -末端[12~15]或直接连接在起始RNA群上[11,16,17].因此这些策略既可消除TdT加尾这一步,又可消除Anchor(N)15引发的第二链cDNA的合成.这样,Anchor(N)15的内部引发可能性就得以完全消除[15].在把Anchor直接连接在RNA上的方法中,从理论上讲,具有3 -末端anchor序列的任何切略cDNAs的产生都得以避免[11].有几个研究组发表了把DNA锚定寡核苷酸连接在cDNA上的方法[12~15].此种RACE变种通常称为锚连接PCR (Ligation-anchored PC R,LA-PCR)[12,13]或称单链cDNA末端的单链连接(Single-strand ligation to ss-cDNA ends,SLIC)[14,15].连接反应是通过T4RNA连接酶催化进行的,此酶具有连接单链脱氧核糖核酸和核糖核酸的能力[18].然后,使用特异的3 -末端引物和锚引物,连接了锚的cDNA可直接用于PCR 扩增,这与标准的RACE法相同.寡核苷酸锚在用于连接反应前,必须作两个修饰改变.首先,必须使其5 -末端磷酸化,才能使其成为T4RNA连接酶的底物[18].这可通过在合成寡核苷酸时或通过T4多核苷酸激酶和ATP的酶学方191第3期 李关荣等:cDNA末端快速扩增技术(RACE)的优化与改良法而完成[12];其次,寡核苷酸锚的3 -末端必须封闭,以避免形成寡核苷酸锚的串联体.这一种修饰也可以在体外合成中通过用已封闭了的氨基核苷酸类似物作为最后的碱基或在寡核苷酸合成后,用TdT介导的方法在其3 -末端加上一个双脱氧核苷酸[14,15]而实现;另一个要求是,c DNA合成使用的寡核苷酸必须具有一个5 -末端羟基,这样cDNA分子的5 -末端才不会成为RNA连接酶的底物[12,14]. cDNA合成后,RNA模板可通过化学方法用NaOH 在高温下处理降解.碱处理把RNA水解为带5 -OH 和3 -P或2 -P的核糖核苷酸,RNA的转化产物不是T4RNA ligase的底物[13].通过上述步骤除去或钝化了连接反应的所有竞争性抑制剂后,连接酶的唯一底物就只有寡核苷酸锚和cDNA分子的3 -OH.然后,连接了锚的c DNA就可用特异的3 -末端引物和锚引物直接进行PC R扩增.尽管LA-PCR避免了在第二链合成中由于第一链cDNA分子的内部同聚物与Anchor(N)15的退火产生的切略cDNAs,但其它产生切略cDNAs的途径仍存在.严格地讲,cDNA合成中产生的任何不完整的第一链cDNAs都将作为T4RNA连接酶的底物,都有寡核苷酸锚连在其3 -末端,PCR仍然可以扩增这些切略了的cDNAs.相反,RNA连接酶介导的RACE(RLM-RACE)[11],也称反转录连接介导PCR(RLPCR),可以避免所有5 -末端切略的产生.在此法中,RNA寡核苷酸锚序列被连接到mRNA的5 -末端.然后,此锚修饰了的mRNA反转录产生第一链cDNA,后者用3 -末端特异引物和一个DNA锚引物进行PCR 扩增[11,16,17,19],因为只有完全延伸为全长的cDNA 才具有3 -末端锚序列,在PCR中切略了的cDNA 将不会被扩增.切略cDNAs产生的唯一途径是在PC R过程中DNA锚引物的非特异性内部退火所致.此类问题可以通过仔细设计引物和调节PCR 参数而避免.在制备用于RLM-RACE的mRNAs时, mRNA必须用酶学或化学方法处理[16,17,19,20],除去共价交联在所有mRNA转录本5 -末端上的7-MeGppp帽子结构.化学方法去帽采用 -消除法: RNA通过用高碘酸钠 SDS和甘油的顺序处理而被氧化.氧化了的mRNAs然后用环己酰胺处理以去除7-Me G帽子.去帽后留在5 -末端的焦磷酸基团用CIP处理除去后,再用T4多核苷酸激酶和ATP 重新加上一个磷酸基团,使其5 -末端成为T4多核苷酸激酶的底物(5 -末端焦磷酸不是T4RNA ligase 的底物)[18].化学去帽的主要缺点是,降解的RNAs 和非mRNAs都可被多核苷酸激酶磷酸化,产生连接反应不需要的底物[11],非mRNAs将竞争RNA 锚引物,这可能导致mRNAs连接效率的降低.但更有害的是可能降解的mRNAs,其5 -末端也连有锚引物,在反转录时,此切略了的mRNAs会产生具3 -末端锚的切略的cDNAs,后者会在PC R中扩增.酶学方法去帽步骤少,避免了化学去帽的不足[11].RNA样品首先用碱性磷酸酶处理,除去所有降解了的RNAs和不具帽的RNAs的5 -末端磷酸基团[16,19],通过热钝化或用酚-氯仿抽提,使碱性磷酸酶失活后[16],其中的mRNAs用烟酸焦磷酸酶(TAP)处理去帽,此酶水解mRNA帽的三磷酸桥上的磷酸苷键[20].这样,TAP处理后,在去帽的mRNAs上留下了一个5 -P,因此只有具帽的mRNA 的5 -末端才转化成T4RNA ligase的底物.切略了的mRNAs却留下了5 -OH,锚引物不能与之连接.这样,只有未降解的mRNAs模板的全长cDNAs延伸产物的3 -末端才有锚引物序列[16].RNA寡核苷酸锚引物既可化学合成[16],也可通过用带有适当启动子(T7、T3和SP6)的线性化质粒模板的体外转录而合成[11,17].在这两种方法中,合成后的RNA寡核苷酸都不需要对其5 -末端进行修饰,因为体外转录产物已经具有了一个5 -末端PPP基团,而化学合成产物有一个5 -OH,它们都不是RNA ligase的底物.因此避免了RNA寡核苷酸锚的串联体的形成.从理论上讲,RNA寡核苷酸锚引物的长度不限,只要有数个核苷酸保证PCR 反应的特异性就行.通常用30nt长,只是要控制其内部二级结构的形成和与mRANs群体中的部分互补序列的退火,因为它们会造成连接反应的效率降低.设计RNA锚引物也应遵循通常的PC R引物设计原则.一旦设计和合成了适合的RNA寡核苷酸锚引物后,就可通过T4RNA ligase将其连接到磷酸化的mRNAs上去.有人曾报道,在连接反应中添加PEG 8000至终浓度25%可以增强连接效率.为了阻止mRNAs的环化,可在去帽前在其3 -末端加pCp[16]或用高碘酸钠处理RNA以除去3 -OH[17].在使用RLM-RACE扩增、克隆转录本的3 -末端的过程中,把DNA或RNA寡核苷酸锚连接到mRNAs分子的3 -末端.尽管DNA寡核苷酸在RNA 连接反应中不是有效的受体,但却是良好的供192 生 命 科 学 研 究 2003年体[18],因此,可采用更易操作的DNA锚替代RNA 锚.如果用DNA锚,则可简单地用T4多核苷酸激酶磷酸化后,然后用T4RNA ligase将之连接在mRNA的3 -末端上.反转录是由另一与连接上的锚完全互补的DNA寡核苷酸引发的,PCR使用锚互补部分作为3 -末端引物和一个与已知cDNA序列互补的5 -末端引物[11,17].因为3 -末端锚是连接在mRNA的尾部的,在整个RACE产物中都保留了完整的mRNA尾.因此,除了能够明确确定克隆的转录本的完整3 -末端外,还可获得转录本3 -末端的有关生化信息.感兴趣的研究者可以根据各个克隆确定Poly(A)尾的长度及其长度的变化.同时还可确定特定转录本中是否具有经典的多腺苷酸化信号[11,17].2.4 PCR扩增关于PCR扩增技术及其参数的优化有很多的文献论述,本部分重点讨论某些简化和增强PCR 重复性的参数以及在PC R中遇到的问题的克服. 2.4.1 PCR的忠实性问题cDNAs的PCR扩增中的一个值得考虑的重要问题是聚合酶的忠实性.因为RACE技术是为确定未知cDNA序列设计的,必须注意使在PCR中引入的突变最少.现已有具3 5 校对核酸外切酶活性的商品嗜热聚合酶可供使用,如pfu(Stratagene)和Vent(Ne w England Biolabs)等.在这两种酶中,p fu的忠实性最高,每掺入一个核苷酸的突变率为1.6 10-6[21].据报道,Taq聚合酶的核苷酸误掺频率为2.5 10-5,比p fu高12倍左右[21].pfu酶还具有特别高的热稳定性,在95 ,60min仍有95%的活性[21].因此,可使用更高变性温度和变性时间的PC R循环而不会明显影响其聚合酶活性.Barnes报道[22],p fu和Klen Taq1(一种遗传修饰了的Taq聚合酶)以1:15混合,其忠实性几乎与pfu本身一样高,扩增时间比两酶单独使用要高得多.因此认为,反应混合物中的少量的pfu足以除去此Taq酶所添加的误配碱基,进而继续推断,PC R扩增通常只限于10kb以内的模板,因为Taq酶过早地终止了引物的延伸.因此,当大于10kb的分子作为PCR 模板时,此种误掺发生频率太高,理想的产物不能有效扩增.p fu聚合酶的校对活性的加入足以克服此种障碍.为了增加PCR反应的产率和特异性,已经设计了一些方法,先把不含模板[23]或模板和聚合酶或活性酶的其它PCR组分混合,只有当混合物预热到引物退火温度以上时,再加入这些组分.有人认为此种 热启动 (hot start)法能防止在室温装配试剂过程中事先变性的模板与引物发生非特异性退火,从而改善引物与模板相互作用的特异性[23]. Taq聚合酶延伸模板的速度较慢,室温下每分钟约15nt[21],因此,非特异性的引物与模板退火或引物与引物配对,在试剂装配和进一步的PCR扩增中都会延伸,从而产生高背景的非特异性产物[23].因为p fu在低温下的聚合酶和外切酶活性低得可以忽略[21],所有PC R的反应组分都可在冰上(或在处于4 的PCR仪)上装配,而不必担心非特异退火的引物或引物与模板被此酶的3 5 校对核酸外切酶活性的降解.由于pfu具有高耐热性,初始变性温度高达98 ,5min,而不会引起酶活性明显降低,尽管长的变性时间可导致PCR模板的损害.因此整个反应混合物都可在严谨的条件下变性,然后立即冷却到适宜温度,使引物退火和延伸.这样,模板的复性和非特异性引物的退火均达到最小化.2.4.2 引物的设计引物设计是另一个对PCR结果有重大影响的参数.PC R技术的使用者有许多经验规则,但却无实验证据[3].但还是有几个基本的规律和计算方法,能使研究者成功地设计出产生理想的PCR产物而无或低背景的引物.引物的正确设计与扩增分子的长度有某种依赖性,200~400bp的长度在PCR中扩增效率最高.许多设计算不上很好的引物,在此大小范围内仍能扩增出理想的产物[3].因理想的全长RACE产物的大小在PCR进行前大都未知,设计的引物应当尽可能符合许多优化参数.首先,应避免使用3 -末端有互补性的引物对,以防止引物二聚体的形成.即使3 -末端仅有几个互补碱基,仍可产生引物二聚体,因为Taq酶延伸引物速度快;同时,还应避免使用3 -末端有自我互补的引物,因此种引物将会以自己为模板而延伸.另外,所有PCR引物的3 -末端应设计为不稳定,以使从非目标部位引发降到最低.在目的位点杂交的稳定性是由引物的5 -末端和中部区域决定的,引物是连续延伸的.相反,如果引物与非目的位点序列有短的互补,不稳定的3 -末端在这个短暂杂合未结束前,不可能非特异性地退火和被延伸.Rychlick根据最近邻核苷酸分析创建了一个DNA双链形成的自由能值表,这些值可用于估算给定序列的DNA双链的稳定193第3期 李关荣等:cDNA末端快速扩增技术(RACE)的优化与改良性.Rychlick建议一个特异引物的3 -末端的5个碱基的稳定性不能超过-9kcal mol,这就是说,3 -末端的5个碱基不能超过两个G或C.他还建议,对于小于500bp的位点的扩增,引物长度应保持较短(16~18nt),而长的位点(5kb)的扩增应用较长的引物(大约20nt).尽管这些原则在使用含有克隆接头引物时,难以达到,但与目的分子互补的引物区应控制在16~18nt范围内.引物的GC AT比率要尽可能接近模板的GC AT比率.虽然RACE目的位点的大多数碱基对组成未知,但其GC AT比率却可以通过已知cDNA序列或目的基因组的GC AT比率而估算.2.4.3 PCR参数PC R参数显著影响特定PCR扩增的成败,特别是目的位点的大小有数千个碱基时[22].变性循环必须有足够高的温度和足够的时间,才能至少使目的分子的小段成功变性.从理论上讲,要实现最佳的PCR效率,只有所有的目的分子在每个变性循环中都变性才可能.但是,特别值得考虑的是, DNA脱嘌呤的速度随温度的升高和pH的降低而升高.在PCR中,在25 ,pH8.3的Tris buffer,当温度达到94 以上时pH将降低(在95 时pH值将降到6.1).当遇到一个脱嘌呤点时,Taq酶就不能继续延伸引物[22].据Barnes计算,PCR扩增目标在kb级或更小范围内脱嘌呤发生明显.因此,变性次数(时间)应当控制在成功PC R的最小要求内.94 ,10s这样短的变性循环曾用于成功扩增20kb以上的目的片段,加入助溶剂如甘油、DMSO 改进了这些实验的产率,这可能是由于降低了解链温度的原因.Cheng等也指出,PCR反应中高温的危害性,可通过使用在变性循环中pH稳定的PCR buffer而减低[27].如果使用一个温度系数比Tris小的buffer(如Tricine,Bicine,EPPS),在变性中就可以采用较高的温度,脱嘌呤的发生就会降低.对一特定PCR引物对,有许多计算理想杂交温度的公式[24,25].据报道,理想的杂交温度的计算也要求采用模板核苷酸的最近邻分析[3].但是,他们认为,如果引物设计适当,使其3 -末端不稳定,引物退火的最适温度范围相当宽.Schaefer发现,即使是最简单的退火温度估算公式:[2 (A T)+4 (G C)]-5=T Hyb对大多数引物都很适用[26].在此公式中,引物退火温度通过赋予每个A或T2 和每个G或C4 来计算.然后杂交温度计为低于退火温度的5 [24].在可能的情况下,最好使用退火温度相当的引物对.Cheng等报道,当使用退火温度为68 的引物时,变性温度为94 、退火 延伸温度都为68 的双温热循环效果都很好[27].在扩增目的片段时,一般每个kb需要延伸1min,尽管对于数个kb的目的片段的扩增,可能要求更长的延伸时间.在目的片段大小不清的RACE扩增中,要求的最大延伸时间可以通过Northern杂交中mRNA 转录本的大小估算.2.4.4 增加特异性除非RAC E克隆的目的c DNA很丰富,一次PC R扩增,通常不能产生足以用于克隆的理想产物.在RACE中,产生的许多非目的cDNAs的5 -末端都有锚定引物序列,这与使用两个特异的引物的PC R相比,RACE-PCR扩增的效率要低些,因为有相当量的锚定引物消耗在与非目的cDNAs序列的退火和后来的延伸中.非目的单链cDNAs的积累,增加了特异3 -末端引物的非特异性退火和聚合酶延伸的可能性,从而产生可在以后的循环中竞争核苷酸、聚合酶分子和两个引物的底物.但是,第一次PCR产物可经过纯化除去残留的引物后,使用锚定引物和另一个与第一次PCR 产物的cDNA序列互补的特异3 -末端引物进行第二次PCR扩增[2,9,19].Frohman报道,如果两次PCR 扩增的循环总数达到60个的话,理想的RAC E产物就会在琼脂糖胶上,经溴乙锭染色表现出特异的带.另一种可以增强特异PCR产物的产率的方法称为亲和捕获(Affinity capture).此种方法有许多变化,但其基本方法涉及到使用特异交联在亲和基质上的一个标签寡核苷酸(Tagged oligo)来捕获理想的产物.如与目标cDNA序列互补的生物素化的oligo在溶液中与变性的cDNA杂交后,杂合体用Streptavidin亲和柱捕获,然后用适当条件洗脱除去非特异退火的杂合体.这样明显富积了的特异目的cDNA序列就从柱上洗脱下来,再用于PCR扩增. 2.4.5 RAC E产物的克隆一旦获得可以检测到的RACE产物,就必须进行纯化、回收和克隆.因为PCR产物在经酚 氯仿抽提和乙醇沉淀的回收过程中,有相当大的损失[28],最好使用专门的试剂盒回收.纯化的产物可用适当的限制酶切割,在低熔点琼脂糖胶上电泳,直接连接到测序载体中.虽然有RAC E产物直接用于测序的报道[9],但由于有替代的转录起始位点[11,16]和反转录酶合成的第一链cDNA的3 -末端有非模板指194 生 命 科 学 研 究 2003年。

文章编号:1001-5949(2005)08-0510-03・论　著・细粒棘球蚴延伸因子-1基因的克隆、测序及特性分析3王　健,赵嘉庆,王娅娜,丁淑琴,赵　巍 [摘要]　目的　对细粒棘球蚴(E.granulosus)翻译延伸因子(translation elongation factor)EF-1基因片段进行分子克隆及序列分析。

方法　从细粒棘球蚴原头蚴中提取RNA,采用RT-PCR技术扩增出细粒棘球蚴EF-1基因片段,与p GE M-T载体重组并转化E.C oli JM109,经筛选扩增获得重组基因克隆,再进行序列测定和分析。

结果　成功构建了EF-1/p GE M-T/JM109克隆体系,测序表明该基因开放阅读框为693bp,与已发表基因核苷酸序列相比,同源性为99%,推导编码氨基酸序列同源性为99%。

结论　扩增获得的基因片段可能为细粒棘球蚴(E.granu2losus)翻译延伸因子EF-1基因片段。

[关键词]　棘球蚴病;基因,结构;克隆,分子;序列分析[中图分类号]　R532.32 [文献标识码]　ACloning and sequence analyzing of the EF-1gene from echinococcus granulosus of m ankind WANG Jian,ZH AO Jia-qing,WANG Ya-na,et al.(Ningxia Med.C oll.,Y inchuan750004,China)Abstract　Objective　T o obtain and analyze sequence EF-1gene,and lay bases for screening candidate antigen of echinococcus granulosus.Methods　T otal RNA was extracted from protoscoles of cysts from humam.The specific primers were designed according to published nucletid sequence in the genbank database.The EF-1gene of echinococcus granulosus was amplified by RT-PCR and cloned into p GE M-T vector for sequencing and analyzing.R esults　A cDNA sequence with an open reading frame of693bp has been amplified success fully by RT-PCR.C omparision of the DNA and amino acid sequence deduced from cDNA with the published EF-1gene sequence of echinococcus granulo2 sus in the genbank revealed99%identity samely.Conclusion　Because the EF-1play an importante role in energy metabolism of E.granulo2 sus,EF-1gene gained from protoscoles can be used as candidate antigene gene to develope vaccine and its biological functions studying.K ey w ords　Echinococcosis;G enes structural;Cloning molecular;Sequencing 细粒棘球蚴病又称包虫病,是世界上许多国家影响人类健康和经济发展的重要人兽共患病之一。

实时荧光定量PCR操作步骤以下实验步骤仅供参考：1样品RNA的抽提①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。

②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。

手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。

4℃下12000rpm离心15分钟。

离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。

RNA全部被分配于水相中。

水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。

③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。

加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm离心10分钟。

此时离心前不可见的RNA 沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。

混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。

⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。

2RNA质量检测1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。

然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。

①浓度测定A260下读值为1表示40μgRNA/ml。

样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260×稀释倍数×40μg/ml。

具体计算如下：RNA溶于40μlDEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE 中，测得A260=0.21RNA浓度=0.21×100×40μg/ml=840μg/ml或0.84μg/μl取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35μl，剩余RNA总量为：35μl×0.84μg/μl=29.4μg②纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。

三、引物溶解稀释
1．干粉引物溶解稀释方法：
收到引物后，在开启离心管盖前在3000-4000转/分钟的转速下离心1分钟，以防开盖时引物干粉散失。

引物保存在高浓度的状况下比较稳定。

如果对实验的重复性要求较高，合成的OD数较大，建议分装，避免反复冻融。

引物一般配制成10-100pmol/ul(umol/l)。

三博远志的引物在出厂时都标有1OD 相当于多少umol 的计算结果，进行稀释时的引物加水量可以按以下公式计算：
稀释成100pmol/ul 1OD 需加水量（ul）=1OD相当于umol 数×10000
例如，您拿到的引物DNA合成报告单上标有1OD≈0.0035umol ，包装量是1OD/管，如果您希望将引物浓度定为
100umol/L，那么只需用35ul无核酸酶的双蒸水将1OD的引物干粉溶解即可。

2．液体引物再稀释可用下列公式：
稀释引物要达到的浓度（pmol/ul）＝母液浓度（pmol/ul）×汲取母液的体积（ul）÷（汲取母液的体积（ul）＋加水量（ul））四、引物保存
◆干燥制品很稳定，常温下数个月无问题。

但为保证万无一失，最好放置于- 20 ℃保存；
◆溶解后的溶液DNA短期内(1～2 周)使用可放置在4 ℃下，长期保存请放置于- 20 ℃；溶解DNA时，请注意使用无菌、无核酸酶的水或TE Buffer；
◆如果对实验的重复性要求较高，合成的OD数较大，建议分装，避免反复冻融；
◆荧光标记引物请避光保存。

蛋白表达纯化实验步骤(待改良)1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。

2、设计蛋白表达引物。

引物要去除信号肽,要加上适当的酶切位点和保护碱基。

3、RT-PCR,KOD酶扩增获取目的基因c DNA.4、双酶切,将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。

5、转化到DH5α感受态细菌中扩增,提质粒。

6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。

表达菌株如Bl21(DE3)、Rosetta gami(DE3)、Bl21 codon(DE3)等。

7、蛋白的诱导表达。

1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右,参加IPTG,浓度梯度从25μM到1m M。

37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。

2)SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。

注:目的蛋白包涵体表达量一般会到达菌体蛋白的50%以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带。

3)将有表达的菌株10%甘油保种,保存1ml左右就足够了,并记录IPTG浓度范围。

甘油是用0.22μm过滤除菌的,储存浓度一般是30%-60%,使用时自己计算用量。

4)用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度,低转速(140-180rpm),诱导过夜作为包涵体检测样品。

注意:1.如果表达的蛋白对菌体有毒性,可以在加IPTG之前的培养基中参加1%的葡萄糖用来抑制本底表达。

葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽,不会影响后面的表达。

2.保种可以取一局部分成50μl一管,每次用一管,防止反复冻融。

8、包涵体检测。

方案见附件29、如有上清表达,则扩大摇菌。

1)取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD>=1.5,约5h左右,视菌种的活性而异,也可过夜摇菌。

2)将上一步中的8ml参加300ml培养基中37度,250rpm摇至OD= 1.0左右(约2.5h~3h),然后加IPTG(浓度同包涵体检测中使用的浓度。

)注:菌液浓度要适当的浓一些,否则第二天收集不到足够的菌体,因为低温低转速细菌生长非常缓慢。

荧光定量PCR（qPCR）对基因表达的分析一、实验试剂SYBR Green premix（Takara，RR420A）二、试验设备和材料无RNase的离心管、PCR管、枪头。

三、操作步骤（一）引物设计原则（1）设计引物的长度一般为18–28个核苷酸。

（2）扩增产物长度80-150 bp最好，最长是300 bp。

（3）避免重复核苷酸延伸段。

（4）目标为50% GC含量，有助于防止错配稳定化。

（5）选择Tm值匹配的引物（相差在5°C范围内），60℃左右最好。

（6）避免一个Assay中采用的所有引物之间以及各引物内出现序列互补。

（二）总RNA提取（TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit，9767）准备工作：Buffer RL中加入50×DTT；Buffer RWB中加入无水乙醇；配制70%DEPC乙醇。

1. 动物培养细胞的 RNA 提取（1）细胞的裂解。

①倒出培养液，使用 1×PBS清洗一次。

②向培养细胞中加入适当量（Table 1 中推荐的使用量）的裂解 Buffer RL（使用前请确认已加入 50×DTT Solution），水平放置片刻，使裂解液均匀分布于细胞表面并裂解细胞，然后使用移液枪吹打细胞使其脱落。

（6 孔细胞培养板每孔加入 350μL）③将内含细胞的裂解液转移至离心管中，用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。

（2）裂解液室温静置2 min。

注：对于基因组含量较多的材料或者材料起始量较大时，可以直接按步骤 7 进行（否则 DNA 含量过高可能造成 gDNA Eraser Spin Column 堵塞），如基因组含量较低或材料起始量较少时，可以按步骤 3-6 进行。

（3）将gDNA Eraser Spin Column放到2 mL 的Collection Tube（试剂盒提供）上。

（4）将裂解液转移入到gDNA Eraser Spin Column中。

拟南芥abi5基因的分子克隆及其在原核细胞中的表达和纯化马燕林, 马建忠*, 王永刚兰州理工大学生命科学与工程学院, 兰州730050摘要: 拟南芥abi5基因编码了一个碱性亮氨酸拉链类转录因子, 它在ABA信号转导过程中发挥着关键调控作用。

本文以拟南芥为材料, 通过RT-PCR扩增、克隆了包含abi5基因编码区的片段。

核苷酸序列分析表明, 所克隆的基因与NCBI 数据库收录的abi5基因(GenBank登录号NM_129185.3)有99.0%的一致性; 氨基酸序列存在4个残基差异。

所克隆的abi5基因被进一步亚克隆至pET-32a表达载体。

序列测定核实构建正确的重组质粒(pET32a-ABI5)转化入大肠杆菌BL21 Star (DE3)中诱导表达。

表达产物经Ni-NTA亲和层析柱分离纯化、SDS-PAGE分析和质谱鉴定。

结果表明, 重组abi5基因在大肠杆菌表达的较适宜条件为: 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)终浓度为0.3 mmol∙L-1、30 ℃下诱导4 h, 可达到细菌裂解液上清蛋白的29.1%。

经Ni-NTA亲和层析柱纯化后的ABI5融合蛋白在SDS-PAGE电泳分析时呈现一条蛋白带。

该条带经串联质谱分析证明为重组ABI5融合蛋白。

关键词: 拟南芥; abi5; 分子克隆; 原核表达; 纯化; 质谱Molecular Cloning, Prokaryotic Expression and Purification of abi5 Gene from Arabidopsis thaliana L.MA Y an-Lin, MA Jian-Zhong*, WANG Y ong-GangSchool of Life Science and Engineering, Lanzhou University of Technology, Lanzhou 730050, ChinaAbstract: The abi5 gene from Arabidopsis encodes a basic leucine zipper transcription factor, which plays a key regulatory role in ABA signal transduction. In this paper, the coding region of the abi5 gene of Arabidopsis thaliana Columbia was ampli fi ed by RT-PCR and then c loned into a T-vector, pMD®19-T. The nucleotide sequenc ing showed that the cloned gene had a 99.0% identity with the abi5 gene sequence (GenBank No. NM_129185.3). The amino acid sequence of the cloned fragment exists four different residues. The abi5 gene was further subcloned into an expression vector, pET-32a. The recombinant plasmid construct (pET32a-ABI5) was veri fi ed by nucleotide sequencing, and transformed into Escherichia coli BL21 Star (DE3). The expression of the ABI5-fused protein was induced with 0.3 mmol∙L-1 IPTG, at 30 ℃for 4 h. Under this condition, the con-tent of the fusion protein could reach 29.1% of the total supernatant proteins of bacteria lysate. After Ni-NTA af fi nity chromatography puri fi cation, a single band was observed in the SDS-PAGE gel, with an 86.1% puri ty. The band was excised for MS/MS assay. The results of tandem mass spectrometry proved that the band con- tained the ABI5-fused recombinant protein.Key words: Arabidopsis thaliana; abi5; molecular cloning; prokaryotic expression; puri fi cation; mass脱落酸(absc isic ac id, ABA)作为一种重要的植物激素调节着植物生长发育过程中的诸多环节, 比如种子和芽的休眠、气孔关闭、生物与非生物性胁迫的响应、以及拮抗其它植物生长调节物质的作用等(F in ke lst e in 2010) 。

㊃论㊀著㊃基金项目:国家自然科学基金项目(81471972)作者简介:牛栋玲,女,博士,研究方向:粉尘螨温度应激响应㊂E-mail:niudl2010@ 通信作者:赵亚娥,E-mail:zhaoyae@粉尘螨HSP16-1原核表达体系构建与温度应激响应功能鉴定牛栋玲,赵亚娥,张宛钰,郭宏松,胡丽西安交通大学基础医学院病原生物学与免疫学系,陕西西安710061摘要:目的㊀建立原核表达体系,在蛋白水平确认粉尘螨HSP16-1蛋白的温度应激响应功能㊂方法㊀基于前期RNA-seq 获得的粉尘螨HSP16-1基因序列,设计特异性引物,PCR 扩增克隆测序;利用生物信息学软件,分析理化性质,预测亚细胞定位和三维结构;通过构建pET32a /HSP16-1原核表达质粒,转化大肠杆菌感受态细胞BL21;采用1mmol /L IPTG 在16㊁28和37ħ三个温度诱导HSP16-1重组蛋白表达,分别在2㊁4㊁6和8h 取样进行SDS-PAGE 分析;绘制热胁迫和冷胁迫下重组菌与空载菌生长曲线㊂结果㊀测序获得粉尘螨HSP16-1完整CDS 为462bp,编码153个氨基酸;BLAST 比对显示粉尘螨与近缘物种屋尘螨核苷酸和氨基酸序列相似度分别为84.63%和87.58%;亚细胞定位在细胞核;保守区预测含有α晶体HSP23超家族保守区㊂菌落PCR 及双酶切鉴定pET32a /HSP16-1重组质粒构建成功㊂SDS-PAGE 分析显示,HSP16-1蛋白被成功诱导表达,37ħ诱导6h 是最佳诱导条件㊂细菌生长曲线显示,pET32a /HSP16-1重组菌在热胁迫下的生长均优于pET32a 空载菌,而冷胁迫下则相反,空载菌生长要优于重组菌㊂结论㊀粉尘螨HSP16-1蛋白仅在热胁迫下发挥应激响应功能,而在冷胁迫未表现出相似的功能㊂关键词:粉尘螨;HSP16-1;原核表达;温度应激响应;功能鉴定中图分类号:R384.4㊀㊀文献标识码:A㊀㊀文章编号:1672-2302(2021)02-0064-07DOI 10.3969/j.issn.1672-2302.2021.02.002Construction of prokaryotic expression system of HSP16-1of Dermatophagoides farinae and functional identification of temperature stress responseNIU Dong-ling ZHAO Ya-e ZHANG Wan-yu GUO Hong-song HU LiDepartment of Pathogen Biology and Immunology School of Basic Medical SciencesXi an Jiaotong University Xi an 710061 Shaanxi Province ChinaCorresponding author ZHAO Ya-e E-mail zhaoyae@Abstract Objective ㊀To establish a prokaryotic expression system and confirm the temperature stress response function ofHSP16-1of Dermatophagoides farinae at protein level.Methods ㊀Based on the HSP16-1gene sequence of D.farinae ob-tained by previous RNA-seq specific primers were designed amplified by PCR cloned and sequenced.Bioinformatics soft-ware was used to analyze the physical and chemical properties subcellular location and three-dimensional structure.The pro-karyotic expression of plasmid pET32a /HSP16-1was constructed and transformed into E.coli BL21.The expression ofHSP16-1recombinant protein was induced by 1mmol /L IPTG at 16ħ 28ħand 37ħ and the samples were collected for SDS-PAGE analysis at 2h 4h 6h and 8h respectively.The bacteria growth curves of the recombinant strains pET32a /HSP16-1 and control strains pET32a under heat and cold stress were drawn.Results ㊀The sequencing resultsshowed that the complete coding sequence CDS of D.farinae HSP16-1was 462bp which encoded 153amino acids.BLAST alignment demonstrated that the nucleotide and amino acid sequences of D.farinae HSP16-1were in similarity by 84.63%and 87.58% respectively with the closely related species D.pteronyssinus .Subcell were localized in the nucleusand conservative region prediction revealed conservative region of αcrystallin HSP23superfamily.The recombinant plasmid pET32a /HSP16-1was successfully constructed and identified by bacteria liquid PCR and double restriction enzyme diges-tion.SDS-PAGE analysis showed that HSP16-1protein was successfully expressed and the best induction condition was37ħfor 6h.The bacterial growth curve indicated that the growth of pET32a /HSP16-1recombinant strains was better than that of pET32a control strains under heat stress yet the growth of control strains was better than that of recombinant strains㊃46㊃㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀热带病与寄生虫学㊀2021年4月第19卷第2期㊀㊀J Trop Dis Parasitol Apr.2021 Vol.19 No.2under cold stress.Conclusion㊀HSP16-1protein of D.farinae only generate stress response function under heat stress yet does not show similar function under cold stress.Key words Dermatophagoides farinae HSP16-1 Prokaryotic expression Temperature stress response Functional identifica-tion㊀㊀粉尘螨(Dermatophagoides farinae)是一种广泛存在于人类生活环境中的微小生物,是诱发人类过敏性疾病的重要病原体,可引起过敏性哮喘㊁过敏性鼻炎㊁过敏性皮炎和过敏性休克等变态反应性疾病,严重危害人体健康[1-3]㊂粉尘螨属于变温动物,一年四季都可存活,对外界环境温度具有很强的抵抗力,不仅能耐高温[4-6],还耐低温[7],这给粉尘螨的防制以及螨源性过敏性疾病的预防带来了极大困难㊂然而,粉尘螨抵抗环境温度胁迫的应激响应机制目前尚不清楚㊂㊀㊀本课题组前期通过转录组测序㊁qRT-PCR检测和RNA干扰,确认了热休克蛋白家族(HSPs)中有17种基因参与粉尘螨温度应激响应,起关键应激调节作用的基因有6种,即HSF㊁HSC71㊁HSP70㊁HSP83-1㊁HSP83-2和HSP16-1,且各关键基因调节规律各不相同㊂HSP70㊁HSP83-1㊁HSP83-2和HSP16-1只参与热应激响应,而HSF和HSC71在热应激和冷应激响应中均发挥调节作用[8-10]㊂该研究第一次在mRNA水平确认了公认的生物应激响应基因HSPs参与粉尘螨抵抗温度胁迫的应激响应㊂然而,mRNA水平的改变并不能直接反映蛋白质水平的改变㊂目前虽然能够检索到螨类HSPs原核表达的相关文献[11-13],但都是原核表达体系构建和重组蛋白诱导表达,缺乏蛋白水平的功能验证㊂㊀㊀本研究选择粉尘螨HSP16-1为目的基因,尝试建立原核表达体系,探索重组蛋白表达的最佳诱导条件,通过绘制重组菌和空载菌在热胁迫和冷胁迫下的生长曲线,从蛋白水平验证HSP16-1在温度胁迫下的应激响应功能㊂这些研究结果将为深入探讨粉尘螨HSF㊁HSP70s和HSP90s等重要HSPs在温度应激响应中的作用机制及生物学功能奠定实验基础㊂1㊀材料与方法1.1㊀材料1.1.1㊀螨虫培养与收集㊀实验用粉尘螨来自本实验室人工气候培养箱纯培养,设置温度为(25ʃ1)ħ,湿度为70%~75%㊂振筛分离法获取含螨粉尘[9],采用自制取螨针在显微镜下分离粉尘螨雌性成虫㊂1.1.2㊀主要仪器与试剂㊀智能人工气候培养箱和恒温水浴锅(东南仪器,中国);视频显微镜(麦克奥迪,中国);普通PCR仪(Thermo scientific,美国);实时定量PCR仪(Agilent Mx3005P,美国);超声波细胞破碎仪(上海之信,中国);脱色摇床(其林贝尔,中国);扫描仪(Umax,美国);微量RNA提取试剂盒(Qiagen,美国);逆转录试剂盒㊁高保真酶Prime-STAR HS DNA Polymerase㊁Bam HⅠ㊁XhoⅠ㊁T4连接酶(TaKaRa,中国);E.coli DH5α和BL2(DE3)感受态细胞(天根,中国);胶回收试剂盒(OMEGA,美国);BCA蛋白定量试剂盒(鼎国,中国);SDS-PAGE快速凝胶试剂盒(赫特,中国);预染蛋白Marker(Thermal Fisher,美国);细菌裂解液(行知生物科技,中国);蛋白上样缓冲液(赫特,中国);凝胶成像系统(赛智,中国);电泳仪(伯乐,美国)㊂1.2㊀方法1.2.1㊀粉尘螨总RNA提取与cDNA合成㊀选取本实验室人工气候培养箱纯培养的粉尘螨,振筛分离法获取含螨粉尘,平铺在干净玻片上,静置几分钟后,于显微镜下挑取活雌性成螨约500只,置于15mL无菌无酶离心管,液氮研磨破膜㊂按照微量RNA提取试剂盒说明书提取粉尘螨雌性成螨总RNA,用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA, -20ħ保存备用㊂1.2.2㊀粉尘螨HSP16-1基因克隆㊀根据转录组测序获得的粉尘螨HSP16-1基因的完整开放阅读框(ORF,Genbank:MK896232)设计引物,设计带有正向Bam HⅠ酶切位点的引物:5'-CGGGATCCATGTT-GGCTCTTCCACGAC-3'和反向XhoⅠ酶切位点的引物:5'-CCGCTCGAGTTATTTCTGTTGTTCAACAGCTG-3'(下划线为酶切位点)㊂采用高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase对粉尘螨HSP16-1带酶切位点的完整ORF进行PCR扩增㊂反应体系为:5ˑPrime STAR Buffer(Mg2+Plus)10.0μL,dNTP Mix-ture(2.5mmol/L)4.0μL,F引物(10μmol/L) 1.0μL,R引物(10μmol/L)1.0μL,cDNA模板< 200ng,ddH2O补齐至50.0μL,PrimeSTAR HS DNA polymerase(2.5U/μL)0.5μL㊂PCR反应程序:98ħ变性10s,55ħ复性15s,72ħ延伸30s,共30个循环㊂1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物,用胶回㊃56㊃热带病与寄生虫学㊀2021年4月第19卷第2期㊀㊀J Trop Dis Parasitol Apr.2021 Vol.19 No.2㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀收试剂盒回收并纯化目的片段㊂1.2.3㊀pET32a /HSP16-1重组质粒构建与鉴定㊀纯化Bam H Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切的HSP16-1ORF 和pET32a 载体,采用T4连接酶连接后,转化E.coli DH5α感受态细胞进行克隆㊂通过Amp(+)LB 固体培养基筛选阳性克隆,随机挑取单菌落进行质粒PCR 鉴定,阳性克隆送苏州金唯智生物科技有限公司进行测序,通过BLAST 比对确认序列及近缘物种㊂1.2.4㊀HSP16-1生物信息学分析㊀用ProtParam软件预测蛋白质组成和理化性质㊂用ExPASy 中的Prot Scale 软件进行氨基酸的疏水性分析㊂蛋白质信号肽用signalP-5.0预测㊂用NCBI Conserved Do-mains Search(https:// /Struc-ture /)预测保守区㊂蛋白亚细胞定位预测使用soft-berry 软件( /berry.phtml?topic =protcom pan &group =programs &subgroup =proloc)㊂使用在线软件SWISS-MODEL (https:// /interactive)对其空间结构进行预测㊂1.2.5㊀重组蛋白的诱导表达和条件优化㊀将测序正确的pET32a /HSP16-1重组质粒转化到E .coli BL21(DE3)感受态细胞中,PCR 电泳初步鉴定阳性克隆㊂提取进一步扩大培养,当OD 600为0.4~0.6时,用1.0mmol /L IPTG 诱导表达,诱导温度选择16㊁28和37ħ[14],诱导时间选择2㊁4㊁6和8h,分别取菌液5mL㊂4ħ10000ˑg 离心10min,弃上清,加入1000μL PBS 重悬洗涤㊂往重悬菌液中加入细菌裂解液150μL,冰上静置30min 后,超声破碎细胞膜,超声功率90W,工作10s 间隙10s,约5~10个循环,直至液体澄清㊂参照BCA 蛋白定量试剂盒说明书进行蛋白浓度测定,绘制BSA 蛋白定量标准曲线,计算样品浓度㊂加入5ˑ上样缓冲液重悬,金属浴煮沸10min 使蛋白样品变性,离心收集上清,经10%SDS-PAGE 电泳检测分析蛋白表达结果,筛选HSP16-1重组蛋白表达的最佳诱导条件㊂1.2.6㊀原核重组表达菌温度胁迫下生长曲线绘制将pET32a 和pET32a /HSP16-1菌株各单克隆3个,在液体LB 培养基中37ħ培养,OD 600为0.4~0.6时,加入IPTG 在最佳条件下诱导蛋白表达,调节各菌液OD 值一致,取1%接种到新鲜培养基,37ħ培养,每隔1h 测定一次各菌液OD 值,并记录数据,绘制诱导后37ħ生长曲线㊂然后分别在41ħ水浴锅和-7ħ冰盐浴处理6㊁12和24h,再次1%接种,37ħ培养,最后绘制热胁迫和冷胁迫下细菌生长曲线㊂1.2.7㊀数据分析㊀采用GraphPad Prism 6.2软件进行数据分析,结果以均数ʃ标准差( x ʃs )表示㊂采用单因素方差分析进行多组间差异分析,两两比较采用LSD-t 检验㊂以P <0.05为差异有统计学意义㊂2㊀结㊀果2.1㊀粉尘螨HSP16-1序列比对与分析㊀粉尘螨HSP16-1经特异性引物PCR 扩增,电泳显示的条带与目的片段大小一致,见图1A;经克隆测序获得462bp 核苷酸序列,比对显示与转录组测序的HSP16-1基因开放阅读框(Genbank:MK896232)完全一致,未发现碱基突变,可编码153个氨基酸,见图1B㊂核苷酸和氨基酸序列经BLAST 比对,覆盖度为100%的分别只比对上一条序列,均为近缘物种屋尘螨α晶体蛋白A 链(XM _027339750,XP _027195551),相似度分别为84.63%和87.58%㊂㊀㊀注:A 为HSP16-1PCR 扩增,M 为DL1000DNA marker,1为HSP16-1ORF;B 为HSP16-1核苷酸氨基酸序列比对,红色字体为预测的保守区;C 为HSP16-1三维结构㊂图1㊀粉尘螨HSP16-1PCR 扩增㊁核苷酸氨基酸比对和三维结构㊃66㊃㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀热带病与寄生虫学㊀2021年4月第19卷第2期㊀㊀J Trop Dis Parasitol Apr.2021 Vol.19 No.2㊀㊀ProtParam分析显示,粉尘螨HSP16-1分子量为17.93kDa,理论等电点为6.83,带负极残基(Asp+ Glu)22个,正极残基(Arg+Lys)22个,总原子数2506,预测分子式为C786H1249N225O237S9㊂在编码的153个氨基酸中,含量最多的为Lys(K)9.2%,其次为Asn(N)8.5%㊁Asp(D)8.5%㊁Gln(Q)8.5%和Val (V)8.5%㊂不稳定系数47.98,为不稳定蛋白;亲水性指数GRAVY-0.808,为疏水性蛋白;脂肪指数74.44㊂蛋白定位综合预测显示HSP16-1定位于细胞核,得分2.5㊂signalP-5.0预测HSP16-1未发现信号肽㊂预测的粉尘螨HSP16-1三维结构如图1C 所示㊂㊀㊀粉尘螨HSP16-1保守区预测,发现氨基酸序列有一个α晶体蛋白HSP23超家族的保守区,共74个氨基酸(在54~127位氨基酸),即NFDVRNFDPN SVQVKLDGNNLQVQAKQEKKADGHYEYREFVRHV TVPQNVQSDQLKCKMDKDGVLRFEAPLKQI;与屋尘螨和梅内欧尘螨相似度高达93%和92%㊂2.2㊀重组质粒构建㊀重组质粒菌液PCR检测显示均有阳性条带,表明转化成功,见图2A㊂挑取阳性单克隆于37ħ恒温振荡过夜培养后提取质粒,双酶切成功得到pET32a和HSP16-1两条带,说明原核表达质粒pET32a/HSP16-1构建成功,见图2B㊂㊀㊀注:A为粉尘螨pET32a/HSP16-1重组质粒菌液PCR,M为DL1000DNA ladder,1-12为pET32a/HSP16-1重组菌单克隆1-12;B为双酶切鉴定,M1为1kb DNA ladder,1为pET32a/HSP16-1重组质粒,2为双酶切pET32a/HSP16-1质粒,M2为DL1000DNA ladder,白色箭头表示双酶切的HSP16-1ORF㊂图2㊀粉尘螨pET32a/HSP16-1重组质粒菌液PCR和双酶切鉴定结果㊀㊀注:A为BSA蛋白标准曲线;B为不同诱导条件HSP16-1重组蛋白表达SDS-PAGE分析,M为蛋白Marker,NC为pET32a空载菌㊂图3㊀HSP16-1重组蛋白浓度测定与不同诱导条件表达SDS-PAGE分析2.3㊀重组蛋白诱导表达㊀BSA蛋白标准曲线为y=0.1063x+0.0195,R2=0.9995,说明线性关系良好,能够准确定量待检蛋白浓度,见图3A㊂HSP16-1重组蛋白可被成功诱导表达,融合蛋白分子量约为35.8kDa,为HSP16-1(17.9kDa)与pET32a标签蛋白(17.9kDa)分子量之和㊂选择16㊁28㊁37ħ三个温度和2㊁4㊁6㊁8h四个诱导时间,SDS-PAGE显示37ħ诱导6h为最佳诱导条件,诱导效果最好,见图㊃76㊃热带病与寄生虫学㊀2021年4月第19卷第2期㊀㊀J Trop Dis Parasitol Apr.2021 Vol.19 No.2㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀3B㊂2.4㊀温度胁迫对HSP16-1重组菌生长的影响㊀细菌生长曲线显示,pET32a/HSP16-1重组菌和pET32a空载菌在37ħ未诱导时生长曲线一致(t=1.580,P=0.1400),见图4A;而在37ħ诱导6h 后,重组菌随着诱导时间的延长,生长好于空载菌,差异有统计学意义(t=5.334,P<0.05),见图4B㊂㊀㊀注:A为37ħ未诱导时生长曲线;B为37ħ诱导后生长曲线;无差异表示两组比较,P>0.05;∗∗∗表示两组比较,P<0.001㊂图4㊀pET32a/HSP16-1重组菌和对照菌未诱导和诱导后细菌生长曲线㊀㊀注:A为41ħ热胁迫6h;B为41ħ热胁迫12h;C为41ħ热胁迫24h;∗∗∗∗表示两组比较,P<0.0001㊂图5㊀pET32a/HSP16-1重组菌和对照菌在41ħ热胁迫生长曲线㊀㊀41ħ分别热胁迫6㊁12和24h,pET32a/HSP16-1重组菌和空载菌生长曲线均明显好于37ħ诱导菌;重组菌生长曲线好于空载菌(t=8.767㊁6.942㊁6.320,P均<0.05);细菌生长曲线与胁迫时间有关,热胁迫时间越长,起初1~3h细菌生长越缓慢,但之后细菌繁殖速度呈快速增长的趋势,见图5㊂㊀㊀在-7ħ分别冷胁迫6㊁12和24h,则结果有所不同㊂冷胁迫后,pET32a/HSP16-1重组菌和空载菌的生长直接受到影响,生长曲线在起初7~8h内低于37ħ诱导菌,之后细菌快速生长,高于37ħ诱导菌;空载菌生长好于重组菌(t=8.874㊁7.158㊁5.550,P均<0.05),见图6㊂㊃86㊃㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀热带病与寄生虫学㊀2021年4月第19卷第2期㊀㊀J Trop Dis Parasitol Apr.2021 Vol.19 No.2㊀㊀注:A为-7ħ冷胁迫6h;B为-7ħ冷胁迫12h;C为-7ħ冷胁迫24h;∗∗∗∗表示两组比较,P<0.0001;∗∗∗表示两组比较,P<0.001㊂图6㊀pET32a/HSP16-1重组菌和对照菌在-7ħ冷胁迫生长曲线3㊀讨㊀论㊀㊀本研究在前期从mRNA水平确认粉尘螨多个HSPs参与温度应激响应的背景下,选择HSP16-1尝试建立原核表达体系,完成了蛋白水平的功能确认㊂选择HSP16-1作为原核表达的目的基因,其原因主要有:相对于HSP70s㊁HSP90s和HSF等多个HSP 基因,HSP16-1基础表达量高(FPKM为3864.36),核苷酸序列较短(462bp),利于PCR扩增测序;相对于HSP16-2在41ħ热胁迫上调3.27倍,HSP16-1上调4.00倍,调节作用强[10]㊂经过生物信息学分析,发现粉尘螨HSP16-1属于HSPs中的α晶体蛋白A链亚家族成员,与HSPs的典型结构特征相一致[15]㊂检索NCBI数据库,目前收录的螨类HSP16s 基因序列仅有4条,涉及屋尘螨(Genbank: XP027195551)㊁梅内欧尘螨(Genbank:OTF73758)㊁地里纤恙螨(Genbank:RWS26778)和二斑叶螨(Genbank:XP015781289),而粉尘螨HSP16基因未被收录㊂我们以前期RNA-seq获得的HSP16-1序列为模板,设计特异性引物,经逆转录㊁PCR扩增和测序,成功获得了粉尘螨HSP16-1全长编码区序列(coding sequence,CDS),全长462bp㊂经序列比对,与RNA-seq获得的ORF模板完全一致,没有碱基突变㊂已投递至GenBank,为今后粉尘螨HSPs基因的研究提供了序列模板㊂㊀㊀蛋白质生物学功能的发挥依赖于正确折叠的三维结构,因此对蛋白质三维结构的预测十分必要㊂常采用计算机模拟来预测三维结构,同源建模是目前比较主流的思路㊂通过对预模拟的蛋白质序列与PDB数据库中的序列进行相似性搜索,根据相似序列的结构来预测,具有预测速度快㊁结果准确度高的优点㊂本研究选择的SWISS-MODEL在线软件基于同源建模方法进行,成功预测出了粉尘螨HSP16-1蛋白质三维结构,为更好地从空间结构的角度研究HSP16-1蛋白的生物学机制奠定了基础㊂㊀㊀要实现蛋白水平的功能研究,第一步是要获得重组蛋白㊂本研究选择大肠杆菌原核表达系统,尝试对粉尘螨HSP16-1进行蛋白表达㊂大肠杆菌表达系统是最早被采用和目前掌握最为成熟的表达系统,它具有遗传背景清楚㊁繁殖快㊁产量高㊁成本低㊁IPTG诱导表达相对简便㊁表达产物容易纯化㊁稳定性好㊁抗污染能力强以及适用范围广等优点,是生产重组蛋白最常用的系统[16-17]㊂载体选择pET32a,是因为pET载体在大肠杆菌原核表达系统中,基础表达水平最低,更利于目标基因的表达㊂研究设计了3个诱导温度和4个时间梯度,最终筛选出粉尘螨HSP16-1最优诱导表达条件为37ħ诱导6h㊂㊀㊀近年有多项通过绘制细菌生长曲线以揭示非生物胁迫对玉米㊁番茄和木薯等植物生长功能影响的研究[18-20]㊂本研究借鉴这一技术,观察HSP16-1蛋白对重组菌和空载菌在热胁迫和冷胁迫下生长曲线变化,验证蛋白功能㊂研究发现,热胁迫时重组菌的生长要明显好于空载菌,可能是HSP16-1蛋白在重组菌中被大量诱导表达,发挥热应激响应功能,使得重组菌对热胁迫的抵抗力增强;而冷胁迫时重组菌的生长相对于空载菌较差,说明HSP16-1蛋白在冷胁迫不具有应激响应功能㊂这与前期HSP16-1(下转第81页)膜血吸虫尾蚴检测结果的比较[J].中国热带医学,2020,20(7):617-620,636.[3]㊀丁兆军.灾区血吸虫病应急处理措施和效果分析[J].现代预防医学,2008,35(18):3638.[4]㊀尹晓梅,王珍丽,汪奇志,等.长江特大洪水溃堤洲滩灾后血吸虫病疫情监测[J].热带病与寄生虫学,2010,8(4):192-194.[5]㊀洪青标,闻礼永,钟波,等.适宜技术:消除血吸虫病进程中的推进器 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2022，44（2）DOI ：10.13836/j.jjau.2022047Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiensis http ://江西农业大学学报一株虹鳟源枯草芽孢杆菌产胞外蛋白发酵条件优化樊丹1，2，3，4，邓福容1，2，3，4，李绍戊1，2，卢彤岩1，2，刘红柏1，2，王荻1，2*（1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江哈尔滨150070；2.黑龙江省水生动物病害与免疫重点实验室，黑龙江哈尔滨150070；3.上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心，上海201306；4.上海海洋大学国家水生动物病原库，上海201306）摘要：【目的】为提高虹鳟源枯草芽孢杆菌益生菌候选株RT-BS07胞外蛋白分泌能力，对其发酵条件进行了优化，并对发酵产物抑菌特性进行比较分析。

【方法】以不同培养条件下RT-BS07株产胞外蛋白浓度为指标，结合单因素试验和正交试验对其发酵条件进行优化，并测定不同发酵条件下胞外蛋白对嗜水气单胞菌等5种水产养殖过程中常见条件致病菌的抑菌活性。

【结果】初始pH 值为7.0，盐度3%的LB 培养基，33℃下振荡培养36h ，空气浴摇床转速150r/min 为菌株最佳蛋白分泌的发酵条件，在此条件下菌株胞外蛋白浓度可达（22.91±0.91）mg/mL ，显著高于常规培养下的（12.74±0.26）mg/mL （盐度1%、初始pH 值7.0，摇床转速120r/min 、28℃下培养24h ）。

该胞外蛋白对鲁氏耶尔森菌、维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌等水产常见条件致病菌具有较好的抑菌效果，抑菌面积分别为（13.87±1.03）mm 2、（11.78±0.46）mm 2、（7.93±0.21）mm 2。

【结论】枯草芽孢杆菌RT-BS07株可分泌具有较强抑菌性能的胞外蛋白，并可通过优化发酵条件显著增加蛋白产量。