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人PD_L1真核表达载体的构建及_省略_在HEK293细胞系中的稳定转染_朱云霞

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苏州大学学报(医学版)2009；29(3)基金项目：国家自然科学基金资助项目(30770947)；江苏省临床免疫学重点实验室基金资助项目收稿日期：2008-12-04作者简介：朱云霞（1979-），女，江苏盐城人，在读医学硕士，研究方向为肺癌。通讯作者、导师：黄建安

人PD-L1真核表达载体的构建及其在HEK293细胞系中的稳定转染

朱云霞1，胡振华2，陈永井2，李文香2，陈成1，黄建安1，张学光2

（1.苏州大学附属第一医院呼吸内科，江苏苏州215006；2.苏州大学医学生物技术研究所，江苏苏州215007）

摘要：目的构建含有人PD-L1基因的真核表达载体，并通过稳定转染获得稳定表达PD-L1分子的HEK293细胞系。方法从人心脏cDNA文库中扩增出PD-L1基因，通过双酶切（Xho1和EcoR1）装入真核表达载体pIRES2-EGFP中，脂质体法转染HEK293细胞，通过G418筛选，建立稳定高表达PD-L1分子的HEK293细胞系，通过流式细

胞术、RT-PCR及Westernblot分析PD-L1的表达。结果构建了真核表达载体pIRES2-EGFP/PD-L1，建立了稳定转染PD-L1目的基因的HEK293细胞系。结论成功构建了PD-L1真核表达载体并获得了稳定转染该分子的HEK293细胞系。关键词：PD-L1基因；真核表达载体；转染；HEK293细胞中图分类号：R392.2文献标识码：A文章编号：1673-0399（2009）03-0459-04

ConstructionofEukaryoticExpressingVectorofHumanPD-L1andEstablishmentofStableTransfectantHEK293CellLine

ZHUYun-xia1，HUZhen-hua2，CHENYong-jing2，LIWen-xiang2，CHENCheng1，HUANGJian-an1

，

ZHANGXue-guang2

（1．DeptofRespiration,theFirstHospitalAffiliatedtoSoochowUniversity,JiangsuSuzhou215006,China;2.MedicalBiotechnologyResearchInstituteofSoochowUniversity,JiangsuSuzhou215007,China）

Abstract:ObjectiveToconstructeukaryoticexpressingvectorofhumanPD-L1geneandtransfectHEK293cellssoastoestablishstableHEK293cellline.MethodsPD-L1genewasamplifiedbypolymerasechainreactionfromthehumanheartcDNAlibraryandconfirmedbyDNA-sequenceanalysis.ThePD-L1genewasthendigestedwiththerestrictionendonucleasesXho1andEcoR1andinsertedintoeukaryoticexpressingvectorpIRES2-EGFP.pIRES2-EGFP/PD-L1wastransfectedintoHEK293cellsbylipofectamineTM2000.AfterscreeningculturebyG418,stabletransfectedHEK293cellslinewasestablished,andtheexpressionofPD-L1wasidentifiedbyFCM,RT-PCRandWesternblot.ResultsTheeukaryoticexpressingvectorpIRES2-EGFP/PD-L1wasconstructed,stabletransfectedHEK293celllinewasestablished,andPD-L1genewasexpressedsuccessfully.ConclusionTheconstructionofeukaryoticexpressingvectorpIRES2-EGFP/PD-L1andtheestablishmentofstabletransfectedHEK293celllinehaveprovidedsolidexperimentfoundationforfurtherstudiesonthefunctionofPD-L1.Keywords:PD-L1;eukaryoticexpressingvector;transfection;HEK293cellline

·方法与技术·459SUZHOUUNIVERSITYJOURNALOFMEDICALSCIENCE2009；29(3)T细胞活化需要两种信号，第一信号为抗原递

呈细胞APC上的MHC-抗原肽复合体与TCR特异性结合，第二信号为APC上共刺激分子与T细胞上相应协同受体结合。PD-L1是共刺激分子B7家族的新成员之一[1]。近年来的研究显示，PD-L1主要传递抑制性信号而非正性信号[2]。PD-L1与其受体PD-1结合可抑制T细胞增殖分化及细胞因子的分泌。有研究显示，PD-L1还可通过其他途径或与其他非PD-1受体结合而发挥正向调控作用[3]。为更好地了解PD-L1分子在免疫反应中的作用，本研究构建了人PD-L1真核表达载体，筛选获得了能稳定表达人PD-L1分子的HEK293转染细胞系，为研究PD-1-PD-L1信号在免疫调节中的作用提供了良好的途径。1材料与方法1.1材料1.1.1载体、细菌及细胞克隆载体pMD18-T购自TaKaRa公司；真核表达载体pIRES2-EGFP、细菌Top10及细胞HEK293均由本所保种。1.1.2cDNA文库和引物人心脏cDNA文库为Clontech公司产品；人PD-L1上游引物:5’-TACTGCAGAAGATGAGGATATTTGCTGTC-3’(含Xho1位点),下游引物:5’-ATTGAATTCTTACGTCTCCTCCAAATGTG-3’(含EcoR1位点)，由上海英骏生物工程公司合成。1.1.3主要试剂脂质体LipfectAMINE购自Invitrogen公司；Polybren购自Sigma公司；PE标记的小鼠IgG蛋白、PE标记的鼠抗人PD-L1单克隆抗体购自美国BDPharmingen公司；各种限制性内切酶及T4连接酶购自日本TaKaRa公司；G418和琼脂粉（日本进口分装）购自上海华美公司。小量质粒抽提试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒及Westernblot试剂盒均购自上海华舜公司；小牛血清（FCS）购自杭州四季青公司；Trizol和RPMI1640培养基购自美国GIBCO公司；逆转录试剂盒购自MBI公司。1.2方法1.2.1真核表达载体pIRES2-EGFP/PD-L1的构建与鉴定以人心脏cDNA文库为模板，采用上述PD-L1引物进行PCR扩增。反应条件为：50μl体系加入1.5μlcDNA文库，5UTaqDNA聚合酶，94℃预变性4min后，94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，扩增35个循环，72℃延伸10min。PCR产物经试剂盒纯化后克隆入pMD18-T载体，转化感受态细菌Top10，并挑选阳性克隆，经重组质粒电泳、PCR和酶切鉴定，并测序进一步确证。测序正确的pMD18-T/PD-L1质粒用Xho1和EcoR1进行双酶切（37℃、5h），同时双酶切真核载

体pIRES2-EGFP（37℃、4h），割胶回收酶切后的目的片段，继而连接转化细菌。用上述方法鉴定获得重组真核载体pIRES2-EGFP/PD-L1。1.2.2HEK293细胞的转染和稳定表达抗性细胞

株的筛选HEK293细胞汇片至60%时进行转染实验。取

2μg质粒（分别包括质粒pIRES2-EGFP/PD-L1及空

质粒pIRES2-EGFP）溶于240μl无血清RPMI1640培养基，再取10μl脂质体溶于240μl无血清RP-MI1640，静置5min后将两液体混匀，室温下静置

45min。培养细胞用无血清RPMI1640洗两次，加

500μl无血清RPMI1640，滴入转染混合液，摇匀。

置37℃、50ml/LCO2的培养箱内培养6h，换液为RPMI1640(100ml/LFCS)。48h后，加入含有G418（600μg/ml）的选择性培养基，加压筛选6周，获得具有抗生素抗性的阳性细胞克隆，扩增培养。收集具有G418抗性的HEK293/PD-L1阳性细胞，以HEK293细胞转空质粒细胞作对照，用流式细胞仪在FITC波长下检测HEK293转基因细胞中绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的稳定表达。1.2.3流式细胞术检测HEK293/PD-L1细胞膜

表面目的蛋白的表达直标单抗PE-PD-L1与HEK293/PD-L1转基因细胞以及HEK293/mock细胞4℃下避光反应25min，PE标记的鼠抗人IgG作同型对照，检测人PD-L1蛋白在细胞膜上的表达。

1.2.4RT-PCR检测PD-L1在转基因细胞中的转录

收集HEK293/PD-L1转基因细胞及HEK293/mock细胞，用Trizol抽提总mRNA，按TaKaRa逆转

录试剂盒将mRNA逆转录成cDNA，取5μlcDNA为模板，以上述PD-L1特异性引物扩增该基因。1.2.5Westernblot检测PD-L1翻译水平的

表达抽提HEK293/PD-L1转基因细胞和HEK293/mock细胞膜蛋白，将获得的膜蛋白行12%SDS-PAGE电泳，Bio-Rad电转仪，150mA电转1h，电转

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稳定表达绿色荧光蛋白的HEK293T细胞的构建

稳定表达绿色荧光蛋白的HEK293T细胞的构建

稳定表达绿色荧光蛋白的HEK293T细胞的构建阳小飞;余意;刘孟雪;荣伊;林显光【摘要】为探讨绿色荧光蛋白(GFP)在传代细胞中是否能随细胞的增殖稳定表达,构建稳定表达GFP的细胞系统,选取HEK293T细胞,使用第三代慢病毒包装系统,包装表达了GFP的慢病毒,然后用包装好的慢病毒去侵染HEK293T细胞.通过细胞成像技术统计了不同代数细胞的荧光强弱并计算细胞形态大小,利用膜片钳记录了HEK293T细胞的电流-电压(I-V)曲线.实验结果显示,GFP能随细胞的增殖稳定表达,被慢病毒侵染后的细胞的形态及基本电生理活动与正常细胞相比,没有产生显著差异.%In order to investigate whether green fluorescent protein (GFP) can stably express with the proliferation of cells in the passage cells, HEK293T cells were infected by the third generation lentivirus to build a cell line stable expressing GFP.The fluorescence intensity and the morphology of the cells were measured by the cell imaging, the current voltage (I-V) curve of HEK293T cells was recorded by whole cell patch.The results showed that GFP could stably express with the proliferation of cells, and the morphology and basic electrophysiological activity were not significantly changed between experimental cells and control cells.【期刊名称】《中南民族大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2017(036)002【总页数】4页(P38-41)【关键词】绿色荧光蛋白;HEK293T细胞;慢病毒【作者】阳小飞;余意;刘孟雪;荣伊;林显光【作者单位】中南民族大学生物医学工程学院,脑认知国家民委重点实验室,医学信息分析及肿瘤诊疗湖北省重点实验室,膜离子通道与药物研发实验室,武汉430074;中南民族大学生物医学工程学院,脑认知国家民委重点实验室,医学信息分析及肿瘤诊疗湖北省重点实验室,膜离子通道与药物研发实验室,武汉430074;中南民族大学生物医学工程学院,脑认知国家民委重点实验室,医学信息分析及肿瘤诊疗湖北省重点实验室,膜离子通道与药物研发实验室,武汉430074;中南民族大学生物医学工程学院,脑认知国家民委重点实验室,医学信息分析及肿瘤诊疗湖北省重点实验室,膜离子通道与药物研发实验室,武汉430074;中南民族大学生物医学工程学院,脑认知国家民委重点实验室,医学信息分析及肿瘤诊疗湖北省重点实验室,膜离子通道与药物研发实验室,武汉430074【正文语种】中文【中图分类】Q813.6绿色荧光蛋白(GFP)是在水母体内发现的一种荧光蛋白. 经过改造后GFP其结构与光学性质更加稳定，在488 nm的激发光下会发出绿色荧光[1]. 由于其极强的稳定性，在细胞内蛋白的定位、基因表达的监测等实验中发挥了巨大的作用.慢病毒载体是对HIV-1进行改造后得到的慢病毒载体[2,3]，使用慢病毒载体可以有效地将外源shRNA或者基因在宿主细胞内表达[4]. 将慢病毒的几个核心元件(RRE、REV和VSVG)同时转染到体外培养的人胚肾细胞HEK293T中，元件表达后得到的蛋白会互相识别，组装成具有侵染能力的慢病毒[5-7]. HEK293T细胞生物学性质稳定，且表达5型腺病毒E1A蛋白和SV40大T抗原，转染效率高[8-10].选取HEK293T细胞作为宿主细胞. 通过慢病毒侵染的方法将GFP导入HEK293T细胞，侵染后的HEK293T细胞(HEK293T- GFP)在488 nm的激发光下会发出绿色荧光[11]。

HIV-1整合酶真核表达载体的构建及在Hela细胞中的表达和定位

HIV-1整合酶真核表达载体的构建及在Hela细胞中的表达和定位


ｉ ｎ ｔ ｅ ｇ ｒ ａ ｓ ｅ ｗ ａ ｓ ｅ ｘ ａ ｍｉ ｎ ｅ ｄ ｂ ｙ ｉ ｍｍｕ ｎ ｏ ｌ ｆ ｕ ｏ ｒ ｅ ｓ ｃ ｅ ｎ ｃ ｅ ｗｉ ｔ ｈ ｃ ｏ ｎ ｆ ｏ ｃ ａ ｌ ｌ ｆ ｕ ｏ ｒ ｅ ｓ ｃ ｅ ｎ ｔ ｍｉ ｃ ｒ ｏ ｓ ｃ ｏ ｐ ｙ ． Ｔ ｈ ｅ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ｗｅ ｒ ｅ ｉ ｆ ｘ ｅ ｄ ｗ ｉ ｔ ｈ ４ ％
ＧＵ Ｗａ ｎ －ｇ ａ ｎ ｇ ”，Ｚ ＨＡＮＧ Ｌ ｉ ，Ｚ ＨＡＮＧ Ｘｕ ａ ｎ
（ １ ）Ｄ ｅ ｐ ｔ ． ｏ ｆＩ ｍ ｍｕ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ， Ｚ ｕ ｎ ｙ ｉ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ，Ｚ ｔ ｍｙ ｉ Ｇ ｕ ｉ ｚ ｈ ｏ ｕ ５ ６ ３ ０ ０ ０ ；２ ）Ｅ ｄ ｉ ｔ ｏ ｒ ｉ ａ ｌ Ｄ ｅ ｐ ａ ｒ ｔ ｍ ｅ ｎ ｔ ｏ ｆＫ ｕ ｎ ｍｉ ｎ ｇ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ； ３）Ｓ ｃ ｈ ｏ ｏ ｌ ｆＰ ｏ ｈ ａ ｒ ｍ ａ ｃ ｅ ｕ ｔ ｉ ｃ ａ ｌ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ＆ Ｙ ｕ ｎ ｎ ａ ｎ Ｋ ｅ ｙ Ｌ ａ ｂ ｏ ｒ ａ ｔ ｏ ｒ ｙ ｆＰ ｏ ｈ ａ ｒ ｍ ａ ｃ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ｆ ｏ ｒ Ｎ ｔｕ ａ ｒ ａ ｌ Ｐ ｒ ｏ ｄ ｕ ｃ ｔ ｓ ， Ｋ ｕ ｎ ｍ ｉ ｎ ｇ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｌ ａ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ，Ｋ ｕ ｎ ｍ ｉ ｎ ｇ Ｙ ｕ ｎ ｎ ａ ｎ ６ ５ ０ ５ ０ ０ ，Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）
酶 表达 以后 在 细 胞里 的定位 情 况进 行研 究 ．方 法 通 过 Ｐ Ｃ Ｒ扩增 和 定 向克 隆技 术构 建 重组 真 核表 达 载体
人转铁蛋白受体基因载体的构建与鉴定及在Hela细胞中的表达

人转铁蛋白受体基因载体的构建与鉴定及在Hela细胞中的表达


转染前后的表达水平 ， 鉴定转染效果 。结果
以ｐ Ｏ Ｔ Ｂ ７ 一 Ｔ Ｆ Ｒ Ｃ质粒为模 板 ， 运用 Ｒ Ｔ — Ｐ Ｃ Ｒ的方法 进行
ｈ Ｔ ｆ Ｒ基因编码 区的扩展 ， 成 功构建 了 ｐ Ｃ Ｄ Ｎ Ａ ３ ． １ （＋） 一 ｈ Ｔ ｆ Ｒ高表达 质粒 ， 测 序鉴定 正确 ； 通 过脂 质体 转染 Ｈｅ ｌ ａ 细胞 ， 瞬时转染效率约 ７ ０ ％； Ｒ Ｔ — Ｐ Ｃ Ｒ显示转染 ｐ Ｃ Ｄ Ｎ Ａ ３ ． １ （＋） 一 ｈ Ｔ ｆ Ｒ质 粒组较 对照组 生成 的ｈ Ｔ ｆ Ｒ ｍ Ｒ Ｎ Ａ明显增 高（ １ ． １ ７ ９± ０ ． ０ ４ ７ ｕ ｓ ．０ ． ２ ６ ０ ， ｔ ＝１ ６ ． ８ ， Ｐ＞ ０ ． ０ ５ ） ； Ｗｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎ — Ｂ ｏ ｌ ｔ 显示 转染组 较对 照组编码 的 Ｔ ｆ Ｒ蛋 白明显 增高 （ ０ ． ６ ４ ８±０ ． ０ ２ ５ ．０ ． ３ ３ ３ ， ｔ ＝１ ０ ． ８ ， Ｐ＜０ ． ０ ５ ） 。结论 成 功 构建 了 ｐ Ｃ Ｄ Ｎ Ａ ３ ． １ （＋） 一 ｈ Ｔ ｆ Ｒ表达质粒 ； 质粒转染 Ｈ ｅ ｌ ａ细胞后表 达 的 ｈ Ｔ ｆ Ｒ ｍ Ｒ Ｎ Ａ及 ｈ Ｔ ｆ Ｒ蛋 白均 明显增 高 ； 为 下一步分子影像学 的实 验奠定了基础。
．
基 础 研 究 ．
人 转 铁 蛋 白受 体 基 因载 体 的构 建 与 鉴 定 及 在 Ｈｅ ｌ ａ细胞 中 的表 达
张斌 杨 卉 肖煜 东 秦燕
【 摘要 】 目的
周顺科
运用人转铁蛋 白受体 （ ｈ Ｔ ｆ Ｒ） 作为 ＭＲ报告基 因 ， 制作包 含 ｈ Ｔ ｆ Ｒ蛋 白编码 区的 通过 脂质
ｆ ｕ ｒ ｔ ｈ ｅ ｒ ｍｏ ｌ ｅ ｃ ｕ ｌ ａ ｒ ｉ ｍａ ｇ ｉ ｎ ｇ ｒ ｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ ． Ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｓ Ｈｅ ｌ ａ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ｌ ｉ ｎ ｅ ｗｉ ｔ ｈ ｈ ｉ ｇ ｈ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｈ Ｔ ｆ Ｒ ｗａ ｓ ｅ ｓ ｔ ａ ｂ ｌ ｉ ｓ ｈ ｅ ｄ
真核表达载体pcDNA3.1—Beclin1的构建及其对子宫内膜癌HEC细胞增殖的影响

真核表达载体pcDNA3.1—Beclin1的构建及其对子宫内膜癌HEC细胞增殖的影响

真核表达载体pcDNA3.1—Beclin1的构建及其对子宫内膜癌HEC细胞增殖的影响目的：构建自噬基因Beclin1的真核表达载体pcDNA3.1-Beclin1，检测人子宫内膜癌HEC细胞转染pcDNA3.1-Beclin1后，外源性基因Beclin1在蛋白水平的表达，并观察其对HEC 细胞增殖的影响。

方法：通过RT-PCR和T/A克隆等方法，构建自噬基因Beclin1的真核表达载体pcDNA3.1-Beclin1，并通过脂质体介导的方法将外源性Beclin1基因导入人类子宫内膜癌细胞株HEC中，通过实时PCR检测转染后Beclin1在HEC 中表达的情况，并设立实验组（转染pcDNA3.1-Beclin1真核载体）、空质粒对照组（转染pcDNA3.1空载体）、空白脂质体对照组，用Western blot法检测子宫内膜癌HEC细胞中Beclin1的表达情况，MTT法检测Beclin1对HEC细胞体外生长的影响等，研究Beclin1基因与子宫内膜癌的关系。

结果：经限制性内切酶鉴定及测序，证明Beclin1基因真核质粒的序列完全正确，将其转染HEC细胞，转染后的HEC细胞在体外能继续增殖，但增殖能力明显下降。

结论：Beclin1基因pcDNA3.1-Beclin1真核表达载体构建成功，并能在HEC细胞中表达，转染HEC细胞体外增殖能力明显降低，Beclin1基因用于子宫内膜癌基因治疗具有重要靶向价值。

Beclin1；真核表达载体；细胞；增殖子宫内膜癌（EC）是仅次于乳腺癌和宫颈癌的常见女性生殖系统恶性肿瘤，占女性生殖系统恶性肿瘤的20%～30%[1]。

其发病率每年10万人约有24.6人，在我国近二十年来也呈逐年上升趋势，但其发生、发展机理仍不十分明确。

多数学者认为其发生发展与雌激素水平密切相关[2]。

长期无拮抗的雌激素刺激可能是主要发病因素，在实验动物中可观察到雌激素引起子宫内膜有丝分裂增多的现象。