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克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。
克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。
克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。
(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。
)其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。
是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体与表达载体的标志。
表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。
表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。
表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。
如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。
其基本骨架为来自pBR322与pUC的质粒复制起点与氨苄青霉素抗性基因。
在表达元件中，有一个杂合tac强启动子与终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。
（RBS位点：1974年Shine与Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG与一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。
这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。
表达载体的五个基本元件
表达载体是一个完全有效的信息传输系统，它借助五个基本元件（表达者、调节者、受众、时间和地点）来传输和接收信息。
表达载
体的复合体帮助收发信息的正常流程。
首先，表达者一般是消息发布者，它可以是一个个体，也可以是
一个团体。
表达者用自己的力量，通过不同的载体、渠道、工具和设备，把消息发给受众。
其次，调节者负责表达载体中信息的筛选、过滤、加工和编辑，
以便确保消息的内容和形式是恰当的。
调节者的作用是保证信息的传
播和公正性。
第三，受众是该信息最终的目的地，是这种传播行为的接受者。
受众接收传播的信息，对消息的内容做出反应，这可以是肯定、否定，或者介于两者之间。
第四，时间是传播过程中的一个重要元素，涉及到发布消息的时
间和受众接收消息的时间。
时间是形成可控制的环境的重要因素，也
是信息传播的重要因素。
最后，地点决定了受众的接收范围和影响范围，这取决于传播的场所和目的地，以及消息传递的距离和范围。
这反过来又决定着接收者的地理位置，以有效地传播消息，它必须考虑到地点因素。
五个基本元件组成的表达载体可以有效地传播和接收信息，并进行双向交流活动，使一方用以表达思想与意见，另一方便于了解表达者的意思。
传播过程中，受众通过表达者的主观信息，结合表达载体的五个基本元件，理解和了解信息的内容。
由此可见，表达载体的作用是至关重要的。
基因过表达载体
1、技术原理：
过表达载体主要是将目的基因的编码区（CDS）构建到相应的质粒或者病毒载体中，达到在目的基因过量表达的作用。
常规过表达载体主要元件：Promoter—gene—linker—Fluorescent gene—抗药筛选gene。
基因过表达载体又可以分为广泛启动子基因表达载体，组织特异性启动子基因表达载体和诱导启动子基因表达载体等，以达到不同研究所需要的目的。
2、技术优势：
① 多种工具载体可选，可提供各种基因表达载体构建服务；
② 多种工具载体经过优化，拷贝效率高，能促使目的基因在细胞中大量表达；
③ 具有丰富分子克隆经验和专业技术研究团队，载体插入目的片段最长能达10kb。
3、质量控制：
① 基因序列测序
② 载体酶切鉴定
③ 载体实验报告
4、应用：
功能学，药物靶点筛选，细胞信号传导通路分析，疾病治疗等等。
使用蛋白质表达技术进行异源蛋白质表达群的分析蛋白质表达技术是一种重要的实验手段，可以用于研究和生产异源蛋白质。
异源蛋白质表达群是指一组表达相同外源基因产物的细胞或生物体群体。
通过对异源蛋白质表达群的分析，可以揭示蛋白质的结构、功能及其在生物学过程中的作用，对于药物研发和基因工程等领域具有重要意义。
一、异源蛋白质表达群的构建在进行异源蛋白质表达群的分析之前，首先需要构建目标蛋白质的表达载体。
表达载体是一种带有目标基因的DNA分子，可以使该基因在细胞内得以表达。
常用的表达载体包括质粒、病毒和细胞系等。
1. 质粒表达系统质粒表达系统通常使用大肠杆菌作为宿主细胞。
将目标基因插入含有启动子、终止子和选择性标记等功能元素的质粒中，经过转化、筛选和培养等步骤，使目标基因在大肠杆菌中表达。
2. 病毒表达系统病毒表达系统常用于哺乳动物细胞。
将目标基因插入病毒载体中，经过转染和感染等步骤，使目标基因在宿主细胞中得到高效表达。
常用的病毒载体包括腺病毒、逆转录病毒和军团菌病毒等。
3. 细胞系表达系统细胞系表达系统是直接使用细胞系作为表达载体。
将目标基因通过基因操纵技术导入细胞系中，使其在细胞系中表达。
常用的细胞系包括CHO细胞和HEK293细胞等。
二、异源蛋白质表达群的分析方法异源蛋白质表达群的分析主要通过鉴定和定量目标蛋白质的表达水平、结构特征和活性等方面。
1. 蛋白质鉴定蛋白质鉴定是对异源蛋白质表达群中的目标蛋白质进行鉴定和定位。
常用的方法包括质谱法、免疫印迹和糖基化分析等。
质谱法可以通过检测蛋白质分子质量和氨基酸序列来鉴定目标蛋白质；免疫印迹可以通过特异性抗体与目标蛋白质结合来检测目标蛋白质的存在；糖基化分析可以揭示蛋白质的修饰情况及其对结构和功能的影响。
2. 表达水平定量表达水平定量是对异源蛋白质表达群中目标蛋白质的表达量进行定量分析。
常用的方法包括荧光素酶报告基因法、荧光染料标记法和放射性同位素标记法等。
荧光素酶报告基因法通过检测报告基因与目标基因的转录水平关系来估计目标蛋白质的表达水平；荧光染料标记法可以通过检测荧光信号强度来定量目标蛋白质；放射性同位素标记法可以通过检测放射性同位素的衰减来估计目标蛋白质的表达水平。
克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。
克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。
克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。
(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA 分子。
)其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。
是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。
表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。
表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。
表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。
如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。
其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。
在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。
（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。
这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。
目前外源基因导入叶绿体基因组的方法主要有基因枪转化法、PEG介导转化法、显微注射及激光注射法、转运肤介导的叶绿体间接转化法、电击法等。
(1)基因枪转化法基因枪法是20世纪80年代后期发明的，它是将外源DNA(通常是带有目的基因的质粒载体)如附在金属颗粒(如钨、金等)表面，然后通过高压动力装置将金属颗粒轰击到受体细胞中的特定部位。
基因枪法是目前己被验证的叶绿体基因组转化转化效率最高、采用最多的方法。
大多数己经成功的叶绿体基因组转化都是用这种方法实现的。
它可以通过人为控制，将外源DNA导入到细胞核及细胞器(如叶绿体体、线粒体等部位)中。
基因枪法不受物种和基因型的限制，转化后的组织可以迅速再生成植株，并且这一方法适合于不同种类的植物，其缺点是成本较高，操作复杂，不易普及到所有实验室。
(2)PEG介导转化法PEG介导转化法是在PEG存在的情况下将去壁的受体细胞原生质体暴露在纯化过的外源DNA中，由于PEG的存在，原生质体会先缩水，然后细胞膜结构会发生重构，在细胞膜结构到达不可逆破坏之前除去PEG，细胞膜结构又会回复到原先的自然稳定状态。
在此过程中，外源DNA有机会进入胞内及质体内，从而实现外源基因的转化。
Golds等用PEG介导转化法成功地实现了烟草的原生质体转化，为质体转化提供了一条新的途径。
该方法虽然成本较低，但原生质体的制备和再生比较困难，使得转化植株的再生频率较低，从而限制了这一方法的普遍应用。
到目前为止，只有PEG法在烟草质体转化中获得成功的报道。
(3)显微注射及激光注射法显微注射及激光注射法就是利用能量很高、直径很小的激光微束引起细胞膜可逆性穿孔，从而使处于细胞周围的外源DNA随之进入细胞的转基因方法。
早在1987年，webe等就利用微束激光照射油菜细胞，将用荧光素标记的外源DNA 导入叶绿体，观察到荧光显示，并且发现这一处理对叶绿体的光合能力和细胞的分裂能力影响较小。
由于激光微束穿刺技术操作简便，转化频率高，从而引起了许多科学家的重视，由此带动了此项技术在原生质体遗传转化中的应用与发展。
表达载体导入微生物的方法
表达载体是将外源基因导入到微生物中进行表达的工具。
常见的表
达载体有质粒、噬菌体和人工染色体等。
下面介绍几种常用的表达载
体导入微生物的方法。
1. 转化法转化法是最为简单直接的一种方法，
适用于大多数革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。
该方法利用电击或热激
等手段使DNA进入细胞内部，然后通过自身复制来实现目标基因在宿
主细胞内部的表达。
2. 病毒感染法病毒感染法通常采用噬菌体作为载体，通过寄生于宿主细胞并注入其遗传信息来实现目标基因在宿主中
的表达。
这种方法可以快速高效地将外源基因导入到宿主中，并且能
够实现定向插入和高水平表达。
3. 电穿孔法电穿孔法是一种新型而有
效率较高的DNA转移技术，可应用于各类真核及原核细胞之间以及不
同组织器官之间进行DNA转移操作。
该技术利用脉冲电场对目标组织
进行刺激，在此过程中形成暂时性小孔从而使得外源 DNA 进行了有效
地输送与传递。
4. 化学处理法化学处理法也称为钙离子共沉淀（CaCl2）或者PEG共沉淀（聚乙二醇），即先将质粒与盐溶液或聚合物相结合
形成颗粒，再加上特殊条件如温度、时间等促进颗粒与受体微生物发
生黏附反应，并最后让其自然恢复正常状态完成整个过程。
总之，在
选择哪种方式去导入我们所需要使用到微生物里面时候还需根据具体
情况去考虑选取何种方式才更加符合我们所要求得结果！。
表达载体一、原核细胞表达载体1. pBAD载体:特点; 该表达质粒含有araBAD(arabinose)操纵子的P BAD启动子和编码该启动子的正负调控子基因araC，具有紧密调控功能和高水平表达外源蛋白质的原核细胞表达载体。
请注意:1. 当要扦入其他信号肽片段，改建此载体时，请不要利用该载体上的Nde1 EcoR1 BamH1 Kpn1和 Pst1位点，以免造成重组困难，因为前述内切酶在此载体上均有二个位点，最好使用只有一个酶切位点的Sac1和Hind111位点。
同时记住，如在不含任何信号肽的P BAD表达质粒扦入信号肽，其非编码N-末端要包含核糖体结合位点(RBS)核苷酸序列。
2在使用含Omp A分泌信号肽的P BAD表达质粒时，请应用Omp A分泌信号肽上的Sac1以及载体Hind111酶切位点，这些在载体序列上都是单个酶切位点。
本公司目前有含Omp A分泌信号肽和不含任何信号肽的二种P BAD表达质粒，其多克隆位点区域图谱如下:(a)、含Omp A分泌信号肽的P BAD表达质粒多克隆区域SDP BAD….TACCCGTTT TTTTCC….GCTAG CAGGAGGAAACG ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG GCA CTG GCT GGTA M A E LTTC GCT ACC GTA GCC ATG GCC GAG CTC GGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGCCTGCAGGCATCCAAGCTTNco1 Sac1 Kpn1 Smal1 BamH1 Pst1 Hind111(b)、不含分泌信号肽的P BAD表达质粒多克隆区域EcoR1 Kpn1 BamH1 Pst1P BAD….TACCCGTTTTTTTGG….GCTAGCGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGCCTGCAGGCATCCAAGCTTNde1 Sac1 Smal 1 Hind111下图显示本公司应用pBAD表达载体完成的实验结果:pBAD载体驱动大分子蛋白质在原核细胞Origami(DE3)内高效表达2. pCAl-n & pCAl-pelB载体特点: 该原核细胞表达载体是来源于以T7 RNA聚合酶为基础的pET载体，含有T7/LacO启动子、编码钙调素结合多肽标鉴和凝血酶切点的核苷酸序列。
因此，该表达载体在E.coli BL21(DE3)或BL21(DE3)pLysS宿主菌中能高水平表达外源蛋白质、且这种表达的外源蛋白质因带有钙调素结合多肽和凝血酶切点，故该蛋白产物易于纯化和产业化。
此外，本公司利用分泌信号肽PelB，构建成新型的的原核细胞表达载体Pcal-PelB。
此载体表达的蛋白产物能在分泌肽PelB的指引下进入细胞周质。
(a). Pcal-nM K R R W K K N F I A V S A A N R F K K I S S S G A L L V P CA T ATG AAG GGACGATGGAAAAAACAATTTCATAGCCGTCTCAGCAGCCAACCCGCTTTAAGAAAATCTCA TCCTCCGGGGCACTTCTGGTTCC R G S P G I L D S M G R L E L K L R S AGCGTGGATCCCCGGGAATTCTAGACTCCATGGGTCGACTCGAGCTCAAGCTTAGATCCGCCBamH1 Sma1 EcoR1 Nco1 Sal1 Xho1 Sac1 Hnd111(b). Pcal-PelB:Nde1actggagact cat A TG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCG GCC CAG GGC M K Y L L P T A A A G L L L L A A Q PNco1 Msc1 BamH1 EcoR1 Sal1GCC ATG GCC aa ggatcc taagtaagtagaattctgagtaggtaagtcgacaatcgcgtct agagccc cgacgcgctgggA M A * * * * * *3. pPOW3.0 表达载体特点: 该原核表达质粒含有噬菌体的重叠λP R P L热诱导启动子和编码热敏感抑制子的C1857基因，可使宿主细胞在合成蛋白前获得高密度的宿主细菌，进行高水平目的蛋白表达，并对蛋白合成提供紧密控制。
PelB分泌信号肽能指引合成的外源蛋白通过胞浆膜进入胞质。
特别提示: 在进行重组质粒时，最好在N-未端用Nco1或Msc1位点，C-末端则可用BamH1、EcoR1位点进行拼接。
图示为启动子、PelB分泌信号肽和多克隆位点区域Xho1λP R P L 启动子ggggtgtgtgatacgaaacgaagcattggcgcc tcgagt aatttaccaacactactacgttttaactgaaacaaRBS Nde1actggagact catATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCGM K Y L L P T A A A G L L L L ANco1 Msc1 Sal1GCC CAG GGC GCC A TG GCC taagtaagtagaattctgagtaggtaagtcgacaatcgcgtct agagccc A Q P A M A * * *说明: RBS 为核糖体结合位点; * 为终止密码子二、真核细胞表达载体1.pCMVp-NEO-BAN载体特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。
更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。
扦入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。
注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。
2.pEGF P, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector)特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。
Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。
此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。
用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。
借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。
亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。
Excitation maximum = 488 nm; Emission maximum = 507图示为启动子分泌信号肽和多克隆位点区域：Ase1.pCMV…cc g cta gcg cta ccg gtc gcc acc atg- .EGFP…BamH1…SV40 poly A+Nhe1 Age13. pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。
Neo 抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。
此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。
用途: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。
Excitation maximum = 488 nm; Emission maximum = 507图示为启动子和多克隆位点区域：.Nhe1….Age1…Bgl11BamH14. pSV2表达载体特点：该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的，克隆位点为Hind111。
SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性。
此载体不含neo基因，故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株。
图示为启动子和多克隆位点区域：Pvu11…pSV40….Hind111….SV40 IVS….SV40 polyA+ 5．CMV4 表达载体特点:该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动，多克隆区域酶切位点选择性较多。
含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点。
但值得注意的是，该表达载体不含有neo基因，转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株。
图示为启动子和多克隆位点区域：CMVp…Bgl11…Kpn1…Mlu1…Cla1…Hind111…Xbal1…Sma1…GH…….SV40 ori其他常用克隆Vector ： pBluscript II KS DNA 15 ug pUC18 DNA 25 ug pUC19 DNA 25 ug保存液: TE Buffer TE Buffer 组成:10 mM Tris.HCL(Ph 8.0)1 mM EDTA产品说明: pBluescript II kS 、pUC18 & Puc19载体适合于DNA 片段的克隆、DNA 测序和对外源基因进行表达等。
这些载体由于在lacZ 基因中含有多克隆位点，当外源DNA 片段扦入，转化lacZ 基因缺乏细胞，并在含有IPTG 和X-gal 的培养基上培养时，含有外源DNA 载体的细胞将为白色菌落，而无外源DNA 片段载体的细胞则为兰色菌落，由此易于筛选有无外源DNA 片段的载体。
此外，这些载体中有便于测序的M13、T7和T3的通用引物进行DNA 测序。
