几种表达载体

克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。

克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。

克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。

(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。

)其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。

是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体与表达载体的标志。

表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。

表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。

表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。

如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。

其基本骨架为来自pBR322与pUC的质粒复制起点与氨苄青霉素抗性基因。

在表达元件中，有一个杂合tac强启动子与终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。

（RBS位点：1974年Shine与Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG与一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。

这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。

植物基因工程常用的报告基因
指其编码产物能够被快速地测定、常用 来判断外源基因是否已经成功地导入寄 主细胞（器官或组织）并检测其表达活 性的一类特殊用途的基因。
作为报告基因的条件
在转化的寄主细胞中应不存在相应的内 源等位基因的活性，
其表达产物不仅不会损害寄主细胞，而 且还应具有快速、灵敏、定量和可重复 的检测特性。
检测方法
用于GUS基因检测的常用底物有三种： X-Gluc 5-溴-4-氯-3-I吲哚-B-D-葡萄糖苷酸酯 X-MUG 4-甲基伞形酮酰-B-D-葡萄糖苷酸酯 PNPG 对硝基苯B-D-葡萄糖醛酸苷 组织化学染色定位法 荧光法测定GUS活性 分光光度法测定GUS活性
组织化学染色定位法
该方法是将底物进入被测的植物组织。 将被检材料浸泡在含有底物的缓冲叶中保温，
cells).
Left, Down regulation of CaMV35S promoter in the syncytium of Heterodera schachtii monitored by expression of GFP (top). By comparison an unifected root shows regular GFP expression (bottom). Right, Image analysis of the mean red component of
植物表达载体构建
张玉刚 zyg4458@
载体 vector
克隆载体
载
体
原核表达载体
表达载体 真核表达载体
植物表达载体
质粒图谱及质粒构建
启动子 外源基因 终止子 启动子 报告基因 终止子
目的片段
（标记基因） 选择标记

表达载体的五个基本元件
表达载体是一个完全有效的信息传输系统，它借助五个基本元件（表达者、调节者、受众、时间和地点）来传输和接收信息。

表达载
体的复合体帮助收发信息的正常流程。

首先，表达者一般是消息发布者，它可以是一个个体，也可以是
一个团体。

表达者用自己的力量，通过不同的载体、渠道、工具和设备，把消息发给受众。

其次，调节者负责表达载体中信息的筛选、过滤、加工和编辑，
以便确保消息的内容和形式是恰当的。

调节者的作用是保证信息的传
播和公正性。

第三，受众是该信息最终的目的地，是这种传播行为的接受者。

受众接收传播的信息，对消息的内容做出反应，这可以是肯定、否定，或者介于两者之间。

第四，时间是传播过程中的一个重要元素，涉及到发布消息的时
间和受众接收消息的时间。

时间是形成可控制的环境的重要因素，也
是信息传播的重要因素。

最后，地点决定了受众的接收范围和影响范围，这取决于传播的场所和目的地，以及消息传递的距离和范围。

这反过来又决定着接收者的地理位置，以有效地传播消息，它必须考虑到地点因素。

五个基本元件组成的表达载体可以有效地传播和接收信息，并进行双向交流活动，使一方用以表达思想与意见，另一方便于了解表达者的意思。

传播过程中，受众通过表达者的主观信息，结合表达载体的五个基本元件，理解和了解信息的内容。

由此可见，表达载体的作用是至关重要的。

基因过表达载体
1、技术原理：
过表达载体主要是将目的基因的编码区（CDS）构建到相应的质粒或者病毒载体中，达到在目的基因过量表达的作用。

常规过表达载体主要元件：Promoter—gene—linker—Fluorescent gene—抗药筛选gene。

基因过表达载体又可以分为广泛启动子基因表达载体，组织特异性启动子基因表达载体和诱导启动子基因表达载体等，以达到不同研究所需要的目的。

2、技术优势：
① 多种工具载体可选，可提供各种基因表达载体构建服务；
② 多种工具载体经过优化，拷贝效率高，能促使目的基因在细胞中大量表达；
③ 具有丰富分子克隆经验和专业技术研究团队，载体插入目的片段最长能达10kb。

3、质量控制：
① 基因序列测序
② 载体酶切鉴定
③ 载体实验报告
4、应用：
功能学，药物靶点筛选，细胞信号传导通路分析，疾病治疗等等。

②外源基因的表达水平与细胞中基因的拷贝数有关， 拷贝数对于瞬时表达系统尤为重要。为此，可考虑 将载体构建为一种自主复制型载体。
该细胞株是目前应用最广泛的哺乳动物基因表达受体细胞 之一，已有多种外源基因如人组织型纤溶酶原激活剂（tPA）、 干扰素β、干扰素γ 、凝血因子Ⅷ等在CHO细胞中得到表达。
COS细胞
它来源于非洲绿猴肾细胞系，能组成性表达SV40的大T 抗原。
COS细胞的特点： ①细胞来源丰富；
②细胞易于培养和转染；
启动子和增强子
长为100～200bp，位于转录起始位点上游，一般由核心启动 子和上游启动子两部分组成。
目前构建的哺乳动物基因表达载体的启动子，主要来源于病 毒，如SV40早期和晚期转录启动子、腺病毒晚期启动子等。
病毒载体的增强子位于转录起始位点的上游，它可大幅 度提高启动子的转录水平。多数增强子具有宿主特异性。
常用的加poly(A)信号来自SV40，它是一段长为237bp的 BamH I-Bcl I限制酶酶切片段，它同时含有早期转录和晚期 转录单位的切割信号与加poly(A)信号。
剪接信号
mRNA剪接所必需的最短序列位于内含子5 ′和3 ′边界上。 在构建真核表达载体时都组入一个SV40的内含子，利用该内含 子及其剪接信号构建的载体，表达外源基因的水平比普通的载 体要高。 GT-AG法则
鼠骨髓瘤细胞的特点：
①细胞易于培养和转染，可在无血清培 养基中进行高密度悬浮培养； ②能进行分泌表达，且表达量高； ③能对蛋白质进行糖基化修饰。
提高哺乳动物基因表达系统表达效率的策略
（1）设法提高外源基因的表达水平和产量
方法包括：
①载体启动子的强度和宿主范围，是外源基因高表达 的关键因素之一，选择强启动子可获得高效表达。

使用蛋白质表达技术进行异源蛋白质表达群的分析蛋白质表达技术是一种重要的实验手段，可以用于研究和生产异源蛋白质。

异源蛋白质表达群是指一组表达相同外源基因产物的细胞或生物体群体。

通过对异源蛋白质表达群的分析，可以揭示蛋白质的结构、功能及其在生物学过程中的作用，对于药物研发和基因工程等领域具有重要意义。

一、异源蛋白质表达群的构建在进行异源蛋白质表达群的分析之前，首先需要构建目标蛋白质的表达载体。

表达载体是一种带有目标基因的DNA分子，可以使该基因在细胞内得以表达。

常用的表达载体包括质粒、病毒和细胞系等。

1. 质粒表达系统质粒表达系统通常使用大肠杆菌作为宿主细胞。

将目标基因插入含有启动子、终止子和选择性标记等功能元素的质粒中，经过转化、筛选和培养等步骤，使目标基因在大肠杆菌中表达。

2. 病毒表达系统病毒表达系统常用于哺乳动物细胞。

将目标基因插入病毒载体中，经过转染和感染等步骤，使目标基因在宿主细胞中得到高效表达。

常用的病毒载体包括腺病毒、逆转录病毒和军团菌病毒等。

3. 细胞系表达系统细胞系表达系统是直接使用细胞系作为表达载体。

将目标基因通过基因操纵技术导入细胞系中，使其在细胞系中表达。

常用的细胞系包括CHO细胞和HEK293细胞等。

二、异源蛋白质表达群的分析方法异源蛋白质表达群的分析主要通过鉴定和定量目标蛋白质的表达水平、结构特征和活性等方面。

1. 蛋白质鉴定蛋白质鉴定是对异源蛋白质表达群中的目标蛋白质进行鉴定和定位。

常用的方法包括质谱法、免疫印迹和糖基化分析等。

质谱法可以通过检测蛋白质分子质量和氨基酸序列来鉴定目标蛋白质；免疫印迹可以通过特异性抗体与目标蛋白质结合来检测目标蛋白质的存在；糖基化分析可以揭示蛋白质的修饰情况及其对结构和功能的影响。

2. 表达水平定量表达水平定量是对异源蛋白质表达群中目标蛋白质的表达量进行定量分析。

常用的方法包括荧光素酶报告基因法、荧光染料标记法和放射性同位素标记法等。

荧光素酶报告基因法通过检测报告基因与目标基因的转录水平关系来估计目标蛋白质的表达水平；荧光染料标记法可以通过检测荧光信号强度来定量目标蛋白质；放射性同位素标记法可以通过检测放射性同位素的衰减来估计目标蛋白质的表达水平。

cccDNA在较高高的温度和PH值条件下才会变性，（较线 性和开放环结构的DNA），如果变性，由于团在一起，条 件恢复后，会很快复性，形成cccDNA，线性和环状的变 性后，复性会形成杂乱的大分子团状结构，从而从体系中 沉淀下来。
3. 质粒DNA的分子量和拷贝数：
按质粒的分子量大小，可分为量大类： 3――7kb，拷贝数多； 70－150kb，含有与质粒功能有关的更多基因，可自我传 递（可编码一套控制质粒DNA转移的基因，所以可从一 个细胞转到另一个细胞），如果一个细胞含有这种质粒， 他可以带动小质粒进行传递转移。这种质粒的拷贝数低。
质粒的拷贝数：分子的多与寡是决定产量的重要因素。
pBR322 拷贝数大于25个 ColE1 15个 产量0.23ug/ml 0.11 ug/ml
基因克隆尽量选择松弛型质粒，如果是严紧型要进行质粒 复制子改造。
质粒的大小：通常质粒越大，拷贝数也越少，所以我们 在进行基因重组时，首先要选择分子量小的质粒，其次 质粒分子量大的要使外源基因的片断长度合适，不要过 大。
பைடு நூலகம் 2、pUC质粒载体：
pUC质粒载体：是由美国加利福尼亚大学的专家构建 的。是在pBR322质粒载体的基础上，组入了一个带 有多克隆位点的LacZ’基因，而发展成为具有双功能 检测特性的质粒载体。
最常用的克隆载体，优点： 具有更小的相对分子量和更高的拷贝数。 在构建pUC质粒载体时仅留下pBR322的复制起始起 始位点和AMP抗性基因，分子大大减小，他的拷贝数 可以达到500－700个/个细胞。 适合组织化学法检测重组子。有利于检测 具有多克隆位点，便于片断的插入。
沉淀出来。
第一步：（1）在5m1含相应抗生素的LB培养基中接种 一单菌落，于37℃剧烈振荡培养过夜。（2）将1.5m1 培养物倒入Eppendorf管中，用微量离心机于4℃以 12000rpm离心30秒。 （3）吸去培养液，使细菌沉淀 尽可能干燥。（4）将细菌沉淀重悬于100μl用冰预冷的 溶液I中（溶液Ⅰ：50mmol／L 葡萄糖， 25mmol／L Tris· (pH 8．0)， 10mmol／L CI EDTA(pH 8．0，溶菌酶4－5mg，酶作用环境由缓冲 液提供)。剧烈振荡。须使细菌沉淀在溶液Ⅰ中完全分 散，将两个微量离心管的管底部互相接触，室温静止5 －30min，细胞壁降解。

克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。

克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。

克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。

(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA 分子。

)其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。

是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。

表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。

表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。

表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。

如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。

其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。

在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。

（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。

这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。

目前外源基因导入叶绿体基因组的方法主要有基因枪转化法、PEG介导转化法、显微注射及激光注射法、转运肤介导的叶绿体间接转化法、电击法等。

(1)基因枪转化法基因枪法是20世纪80年代后期发明的，它是将外源DNA(通常是带有目的基因的质粒载体)如附在金属颗粒(如钨、金等)表面，然后通过高压动力装置将金属颗粒轰击到受体细胞中的特定部位。

基因枪法是目前己被验证的叶绿体基因组转化转化效率最高、采用最多的方法。

大多数己经成功的叶绿体基因组转化都是用这种方法实现的。

它可以通过人为控制，将外源DNA导入到细胞核及细胞器(如叶绿体体、线粒体等部位)中。

基因枪法不受物种和基因型的限制，转化后的组织可以迅速再生成植株，并且这一方法适合于不同种类的植物，其缺点是成本较高，操作复杂，不易普及到所有实验室。

(2)PEG介导转化法PEG介导转化法是在PEG存在的情况下将去壁的受体细胞原生质体暴露在纯化过的外源DNA中，由于PEG的存在，原生质体会先缩水，然后细胞膜结构会发生重构，在细胞膜结构到达不可逆破坏之前除去PEG，细胞膜结构又会回复到原先的自然稳定状态。

在此过程中，外源DNA有机会进入胞内及质体内，从而实现外源基因的转化。

Golds等用PEG介导转化法成功地实现了烟草的原生质体转化，为质体转化提供了一条新的途径。

该方法虽然成本较低，但原生质体的制备和再生比较困难，使得转化植株的再生频率较低，从而限制了这一方法的普遍应用。

到目前为止，只有PEG法在烟草质体转化中获得成功的报道。

(3)显微注射及激光注射法显微注射及激光注射法就是利用能量很高、直径很小的激光微束引起细胞膜可逆性穿孔，从而使处于细胞周围的外源DNA随之进入细胞的转基因方法。

早在1987年，webe等就利用微束激光照射油菜细胞，将用荧光素标记的外源DNA 导入叶绿体，观察到荧光显示，并且发现这一处理对叶绿体的光合能力和细胞的分裂能力影响较小。

由于激光微束穿刺技术操作简便，转化频率高，从而引起了许多科学家的重视，由此带动了此项技术在原生质体遗传转化中的应用与发展。

表达载体导入微生物的方法
表达载体是将外源基因导入到微生物中进行表达的工具。

常见的表
达载体有质粒、噬菌体和人工染色体等。

下面介绍几种常用的表达载
体导入微生物的方法。

1. 转化法转化法是最为简单直接的一种方法，
适用于大多数革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。

该方法利用电击或热激
等手段使DNA进入细胞内部，然后通过自身复制来实现目标基因在宿
主细胞内部的表达。

2. 病毒感染法病毒感染法通常采用噬菌体作为载体，通过寄生于宿主细胞并注入其遗传信息来实现目标基因在宿主中
的表达。

这种方法可以快速高效地将外源基因导入到宿主中，并且能
够实现定向插入和高水平表达。

3. 电穿孔法电穿孔法是一种新型而有
效率较高的DNA转移技术，可应用于各类真核及原核细胞之间以及不
同组织器官之间进行DNA转移操作。

该技术利用脉冲电场对目标组织
进行刺激，在此过程中形成暂时性小孔从而使得外源 DNA 进行了有效
地输送与传递。

4. 化学处理法化学处理法也称为钙离子共沉淀（CaCl2）或者PEG共沉淀（聚乙二醇），即先将质粒与盐溶液或聚合物相结合
形成颗粒，再加上特殊条件如温度、时间等促进颗粒与受体微生物发
生黏附反应，并最后让其自然恢复正常状态完成整个过程。

总之，在
选择哪种方式去导入我们所需要使用到微生物里面时候还需根据具体
情况去考虑选取何种方式才更加符合我们所要求得结果！。

几种新型植物基因表达载体的构建方法摘要:利用基因工程技术手段研究基因功能过程中，构建基因表达载体处于转基因植物的主导地位，采用合适的构建方法会使实验效果事半功倍。

植物基因表达载体的构建方法除了传统构建法、Gateway 技术、三段T-DNA 法、一步克隆法等，还有近年来出现的几种新型的载体构建方法：基于竞争性连接原理快速构建小片段基因表达载体；Micro RNA 前体PCR 置换法适用于构建小分子RNA 表达载体；重组融合PCR 法特别适用于插入片段中含有较多限制性酶切位点的载体构建；利用In-Fusion 试剂盒可以将任何目的片段插入一个线性化载体的某个区域；构建多片段复杂载体可采用不依赖序列和连接的克隆方法(Sequence and ligation-independent cloning, SLIC) 法；Gibson 等温拼接法。

本文将在总结分析前人工作的基础上，分析这6种新方法的特点，期望通过这几种新的方法给植物基因工程表达载体的构建提供新的思路。

关键词:Micro RNA 前体PCR 置换法，In-Fusion 试剂盒法，重组融合PCR 法，Gibson 等温拼接法，Golden Gate 拼接法基因克隆、载体构建是植物功能基因组研究中的常规步骤[ 1 ]。

而载体构建是基因工程和分子生物学研究中常用的基础技术。

随着植物基因工程技术的发展，适合于不同研究目的各种载体系统应运而生，其中在转基因植物中最常用的是质粒载体。

传统的载体构建方法在进行构建多片段拼接的复杂载体时，需要精心选择酶切位点[ 2 ]，有时还需要构建多个中间载体，操作比较麻烦，费时费力，因此寻找简单、高效、快捷的载体构建方法具有重要的现实意义。

从1969 年Arber 等发现了限制性切酶，载体的构建方法逐步发展，从传统构建方法到三段T-DNA、Gateway 等技术延伸出了许多新的载体构建方法。

本文结合自己的实验工作选择介绍了近年来其中几种新型的具有代表性的植物表达载体构建的方法，对其应用的方向、优缺点作出了评估，期望给植物基因工程表达载体的构建提供新的思路。

转载一.九种表达载体Pllp-OmpA, pllp-STII, pMBP-P, pMBP-C,pET-GST, pET-Trx, pET-His, pET-CKS, pET-DsbA 二.克隆载体pTZ19RDNApUC57DNAPMD18TPQE30pUC18pUC19pTrcHisApTrxFuspRSET-ApRSET-BpVAX1PBR322pbv220pBluescriptIIKSL4440pCAMBIA-1301pGD926三.PET系列表达载体ProteinExpressionProkaryoticExpressionpETDsbFusionSystems39band40b ProteinExpressionProkaryoticExpressionpETExpressionSystem33b ProteinExpressionProkaryoticExpressionpETExpressionSystems ProteinExpressionProkaryoticExpressionpETExpressionSystemsplusCompetentCells ProteinExpressionProkaryoticExpressionpETGSTFusionSystems41and42 ProteinExpressionProkaryoticExpression ProteinExpressionProkaryoticExpressionpETVectorDNA ProteinPurificationPurificationSystemsStrepTactinResinsandPurificationKits四.PGEX系列表达载体TEcoR pGEX-1I/BAPpGEX-2TpGEX-2TKpGEX-3XpGEX-4T-1pGEX-4T-2pGEX-4T-3pGEX-5X-1pGEX-5X-3 pGEX-6P-1 pGEX-6P-2 pGEX-6P-3五.PTYBsystem PTYB1PTYB2PTYB11PTYB12六.真核表达载体-pPICZalphaA pGAPZαApBI121pEGFP-N1 pEGFP-C1pPIC9K如何阅读分析质粒图谱载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体;一、一个合格质粒的组成要素复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点;原核生物DNA分子中只有一个复制起始点;而真核生物DNA分子有多个复制起始位点;抗生素抗性基因可以便于加以检测,如Amp ,Kan多克隆位点MCS克隆携带外源基因片段P/E 启动子/增强子Terms终止信号加polyA信号可以起到稳定mRNA作用二、如何阅读质粒图谱第一步：首先看Ori的位置,了解质粒的类型原核/真核/穿梭质粒第二步：再看筛选标记,如抗性,决定使用什么筛选标记;1Ampr水解β－内酰胺环,解除氨苄的毒性;2tetr可以阻止四环素进入细胞;3camr生成氯霉素羟乙酰基衍生物,使之失去毒性;4neorkanr氨基糖苷磷酸转移酶使G418长那霉素衍生物失活5hygr使潮霉素β失活;第三步：看多克隆位点MCS;它具有多个限制酶的单一切点;便于外源基因的插入;如果在这些位点外有外源基因的插入,会导致某种标志基因的失活,而便于筛选;决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因;第四步：再看外源DNA插入片段大小;质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段;一般来说,外源DNA片段越长,越难插入,越不稳定,转化效率越低;第五步：是否含有表达系统元件,即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号;这是用来区别克隆载体与表达载体;克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体;选用那种载体,还是要以实验目的为准绳;启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号启动子－促进DNA转录的DNA顺序,这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游,是DNA 分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位,但启动子本身不被转录;增强子/沉默子－为真核基因组包括真核病毒基因组中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序;其作用与增强子所在的位置或方向无关;即在所调控基因上游或下游均可发挥作用;/沉默子－负增强子,负调控序列;核糖体结合位点/起始密码/SD序列Rbs/AGU/SDs：mRNA有核糖体的两个结合位点,对于原核而言是AUG起始密码和SD序列;转录终止顺序终止子/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列,此位点down－stream有一段GT或T富丰区,这2部分共同构成polyA加尾信号;结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列,此位点down－stream有一段GT或T 富丰区,这2部分共同构成polyA加尾信号;回答有人之前提出的一个问题：为什么质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针,那其实是代表两条DNA链,即质粒是环状双链DNA,它的启动子等在其中一条链上,而它的抗性基因在另一条链上.三、介绍一下关于载体的知识虽然课本上都有写1. 什么是载体即要把一个有用的基因目的基因——研究或应用基因通过基因工程手段送到生物细胞受体细胞,需要运载工具交通工具携带外源基因进入受体细胞,这种运载工具就叫做载体vector;.基因工程所用的vector实际上是DNA分子,是用来携带目的基因片段进入受体细胞的DNA2. 载体的分类―――按功能分成：1克隆载体都有一个松弛的复制子,能带动外源基因,在宿主细胞中复制扩增;它是用来克隆和扩增DNA片段基因的载体;所以有时实验时扩增效率低下,要注意是不是使用的严谨行载体2表达载体具有克隆载体的基本元件ori,Ampr,Mcs等还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体;―――按进入受体细胞类型分：1原核载体2真核载体3穿梭载体sbuttlevector指在两种宿主生物体内复制的载体分子,因而可以运载目的基因穿梭往返两种生物之间..穿梭质粒含原核和真核生物2个复制子,以确保两类细胞中都能扩增;3. 基因工程载体的3个特点：一都能独立自主的复制：载体DNA分子中有一段不影响它们扩增的非必需区域,如MCS,插在其中的外源DNA片段,能被动的跟着载体一起复制/扩增,就像载体的正常成分一样;二都能便利的加以检测：如载体的药物抗性基因,多是抗生素抗性基因,将受体细胞放在含有该抗生素培养板上培养生长时,只有携带这些抗性基因的载体分子的受体细胞才能存活;三都能容易进入宿主细胞中去,也易从宿主细胞中分离纯化出来;4. 载体的选择和制备：选择载体主要依据构建的目的,同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点;如果构建的目的是要表达一个特定的基因,则要选择合适的表达载体;载体选择主要考虑下述3点：1构建DNA重组体的目的,克隆扩增/表达表达,选择合适的克隆载体/表达载体;2.载体的类型：1克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小大选大,小选小;如<10kb选质粒;2表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭,哺乳类细胞表达载体;3对原核表达载体应该注意3点：①选择合适的启动子及相应的受体菌；②用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；③表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考;3载体MCS中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异,适应目的基因与载体易于链接,不产生阅读框架错位;选用质粒最常用做载体的4点要求：①选分子量小的质粒,即小载体1－→不易损坏,在细菌里面拷贝数也多也有大载体；②一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束,一般10个以上的拷贝,而严谨型质粒<10个;③必需具备一个以上的酶切位点,有选择的余地；④必需有易检测的标记,多是抗生素的抗性基因,不特指多位Ampr试一试;无论选用哪种载体,首先都要获得载体分子,然后采用适当的限制酶将载体DNA进行切割,获得分子,以便于与目的基因片段进行连接。

逆转录病毒载体系统
杰特伟
选用的背景：由于重组腺病毒对于一些细胞类型难以转染，比如
各种类型的原代细胞、体内细胞，同时希望基因永久性表达，即将基 因整合入靶细胞的基因组中，此时可以考虑选用逆转录病毒。
逆转录病毒简介： 反转录病毒载体是常用的病毒载体之一，是
由具有感染性的小鼠的白血病病毒改造而来，能将非病毒基因导入细 胞体内或体外进行有丝分裂。这些载体能产生病毒基因组的单一拷贝 并高效准确地整和到宿主染色体 。
杰特伟杰特伟基因载体系统基因载体系统病毒载体系统病毒载体系统非病毒载体系统非病毒载体系统腺病毒载体体腺病毒载反转录病毒载体体反转录病毒载腺伴随病毒载体体腺伴随病毒载单纯疱疹病毒载体体单纯疱疹病毒载慢病毒载体体慢病毒载裸裸dnadnadna阳离子脂质复合物dna阳离子脂质复合物dna蛋白质复合物dna蛋白质复合物细胞内包装细胞内包装细胞外包装细胞外包装dna阳离子多聚物dna阳离子多聚物dnarna嵌合物dnarna嵌合物杰特伟杰特伟公司相应的病毒表达载体质粒sirna表达载体去除去除cmv启动子动子和和egfp荧启光蛋白光蛋白质粒较小质粒较小最好最好使用使用的的荧rnai质粒之一质粒之一杰特伟杰特伟质粒sirna表达载体cmv启动子动子和和egfp荧启光蛋白光蛋白荧杰特伟杰特伟诱导性的sirna表达启动子四环素四环素强力霉素强力霉素杰特伟杰特伟teton基因表达系统的小常识gossen等构建了受四环素负调节的teton基因表达系统
常用的病毒载体的特点：
杰特伟
病毒载体
反转录病毒载体 单链 RNA 病毒 8~10kb
腺病毒载体 双链 DNA 病毒 36kb
A AV 病 毒 载 体 单链 DNA 病毒 ~5kb
HSV 病 毒 载 体 双链 DNA 病毒 152kb

蛋白表达形式
蛋白表达形式主要有以下几种：
1. 原核表达系统：原核表达系统是最早被开发的蛋白表达途径之一，主要利用大肠杆菌（E.coli）作为宿主细胞。

该系统具有操作简单、表达量高等优点，适用于小分子量蛋白的表达。

在原核表达系统中，常用的表达载体包括质粒和噬菌体。

质粒表达途径通过将目标蛋白编码基因插入质粒中，然后将质粒导入宿主细胞，利用宿主细胞的代谢机制表达目标蛋白。

噬菌体表达途径则利用噬菌体感染宿主细胞，将目标蛋白编码基因插入噬菌体基因组中，然后利用宿主细胞的机制表达目标蛋白。

原核表达系统的主要限制是无法表达复杂的蛋白质结构和糖基化蛋白。

2. 真核表达系统：真核表达系统利用真核细胞作为宿主细胞，可以表达复杂的蛋白质结构和糖基化蛋白。

常用的真核表达系统包括酵母表达系统和哺乳动物细胞表达系统。

酵母表达系统主要利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或毕赤酵母(Pichia pastoris)等作为宿主细胞。

除此之外，还有分泌型表达载体、带纯化标签的表达载体、表面呈现表达载体、带伴侣的表达载体等多种表达形式，并且每种表达形式都有其独特的特点和应用场景。

生物中表达载体的名词解释生物学领域中，表达载体是指用于转入目标细胞并表达外源基因的一类分子工具。

它们在基因工程和生物技术研究中起着重要的作用，被广泛应用于基因克隆、基因表达和蛋白质表达等领域。

本文将探讨表达载体的起源、结构和应用。

一、表达载体的起源表达载体的概念最早起源于20世纪70年代，当时科学家们迫切需要一种能够稳定传递外源基因并在细胞内进行表达的工具。

最早的表达载体采用的是基于质粒的系统。

质粒是一种环状DNA分子，通常存在于细菌细胞内，具有自主复制和稳定性。

质粒可以经过基因工程技术被改造成表达载体，使其能够载入外源基因并在细胞内进行表达。

随着技术的进步，科学家们还开发了其他类型的表达载体，如病毒载体、人工染色体等。

病毒载体利用病毒的感染能力将外源基因带入细胞，并利用细胞内的机制进行表达。

人工染色体则是一种人工合成的染色体，能够稳定携带大量外源基因。

二、表达载体的结构表达载体的结构包括：启动子、序列标记、选择标记和多个限制性酶切位点等。

1. 启动子：启动子是表达载体中的一个重要元件，用于调控外源基因的转录水平。

它通常与靶基因位点连接，使得靶基因能够被蛋白质转录和翻译。

常用的启动子包括嗜热菌的T7启动子、哺乳动物的CMV启动子等。

2. 序列标记：序列标记是用于辅助表达载体的构建和检验的重要元素。

常见的序列标记有引物序列、激素依赖性增殖元素、克隆位点等。

它们可以帮助科学家们进行基因克隆、DNA测序和表达定量分析等实验。

3. 选择标记：选择标记是表达载体中的另一个重要组成部分，用于筛选和鉴定携带外源基因的细胞。

常见的选择标记有抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。

通过将选择标记与外源基因连在一起，可以较为方便地筛选出携带目标基因的细胞。

4. 限制性酶切位点：限制性酶切位点是表达载体中可控制外源DNA序列进入和退出的位置。

科学家们可以利用限制性酶切位点，通过酶切、连接和合成等操作将目标基因插入载体中，实现基因的转入和表达。

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2）终止子：依赖于ρ 因子或不依赖于ρ 因子（遇茎环结构
而终止）。
3）核糖体结合位点(ribosome binding side, RBS)：
Shine-Dalgarno (SD)序列，ATG与RBS之间的距离很重要， 一般3-11bp。
2、表达形式 完整单一蛋白：单一基因的编码区表达。 融合蛋白(fusion protein)：多个基因的编码区的串联体，
但构成一个整体的单一ORF，如果融合标签蛋白有利于蛋白 的定向、纯化，如果融合多个目标蛋白，则类似于直接表达 了一个多酶复合体一样，可减少载体构建难度，而且可以偶 连两个或多个相关基因的表达。
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3、表达的控制
诱导表达系统：IPTG 防渗漏表达系统：lacIq PL启动子受cⅠ的调控，低温(30℃)下阻抑转录， 高温(40-45℃)下解除抑制。 二、利用T7噬菌体启动子的表达载体 pET系列，表达能力强，可控性好，只受T7噬 菌体RNA聚合酶识别，不受大肠杆菌RNA聚 合酶识别，可用IPTG诱导表达。
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2 ） 植 物 Ac-Ds 转 座 子 双 因 子 插 入 突 变 ： 玉 米 Ac (activator) 因子是一个转座子，含有完整的转 座酶， Ds (dissociation) 是 Ac 缺失转座酶基因 的缺失体，但具两端的反向重复序列。
分别构建含Ac 和Ds 的质粒载体载体并分别转化植物， 转基因植株杂交 (Ac×Ds) 后代中会发生转座事件 而产生突变体。 利用Ac-Ds序列作探针或引物克隆目标基因。
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3 、内含肽表达载体：如 NEB 公司的 Impact-Twin 系 统，将目的蛋白放在两个可自裂解的内含肽 (intein)中间，在得到融合蛋白以后不通过蛋白 酶消解、只需要调节pH值等条件就将标签蛋白切 除。 4 、分泌表达载体：产物可跨膜分泌至胞周间隙， 可避免受细胞内蛋白酶的降解，或使其正确折叠， 或去除N-端甲硫氨酸，以维护活性。 信号肽(signal peptide) 有碱性磷酸酶信号肽、蛋 白质 A 信号肽（如 Amersham 公司的 pEZZ18 系统）。

真核细胞常见表达载体真核细胞, 表达载体1、pCMVp-NEO-BAN载体特点：该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。

更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在,转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。

插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。

注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。

2、pEGFP，增强型绦色荧光蛋白表达载体（Enhanced Fluorecent Protein Vector)特点：pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。

载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。

Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV—TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。

此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达.用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点,将外源基因扦入这些位点,将合成外源基因和EGFP的融合基因。

借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位.亦可用于检测克隆的启动子活性（取代CMV启动子,Acet1-Nhe1）。

3、pEGFT-Actin，增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点:pEGFP—Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达.载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。