剪切应力诱导成骨细胞钾离子通道开放的研究

生物医学工程与临床２００７年１１月第１１卷第６期ＢＭＥ＆ＣｌｉｎＭｅｄ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ２００７，Ｖｏｌ．１１，Ｎｏ．６适度的力学载荷作用于成骨细胞，可以促进成骨细胞增殖，在载荷作用下，细胞要经历复杂的信号转换和传递的过程。近年来的研究已证明许多细胞表面的离子通道在细胞膜受到机械作用数秒或数分钟后可引起Ｇ蛋白活化、第二信使释放、蛋白质磷酸化、生长因子的分泌、细胞骨架的变化、细胞和细胞外基质黏附的重建、基因表达的改变等［１］。骨组织是如何感受机械运动并将这种力的作用传入细胞内部，骨组织表面是否存在对骨组织敏感的受体，还是已知的信号转导途径或单一或联合的作用，这些都需要继续探索。膜片钳技术是一种以记录通过离子通道的离子电流来反应细胞膜上单一或多个离子通道分子活动的技术，该技术突破了以往无法记录单个通道电活动和无法应用于直径较小细胞的局限，将电生理学的研究水平带到分子水平。在笔者研究中通过膜片钳技术直接观察剪切应力对成骨细胞钾离子通道电活动的影响，为更加深入地探讨这种影响发生的分子机制提供可能。

１材料与方法

１．１实验材料

１．１．１动物与主要试剂

Ｗｉｓｔｅｒ大鼠乳鼠，鼠龄２～３ｄ，军事医学科学院

卫生环境研究所二级动物房提供。胶原（Ｓｉｇｍａ公司），ＨＥＰＥＳ（ＡｍｅｒｓｈａｍＬＩＦＥＳＣＩ－ＥＮＣＥ），ＥＧＴＡ（Ｓｉｇｍａ公司）。电极内液：ＫＣｌ１２０ｍｍｏｌ／Ｌ，

ＭｇＣｌ２２ｍｍｏｌ／Ｌ，ＨＥＰＥＳ１０ｍｍｏｌ／Ｌ，ＥＧＴＡ１０ｍｍｏｌ／Ｌ，

Ｎａ２ＡＴＰ５ｍｍｏｌ／Ｌ，用ＮａＯＨ调ｐＨ至７．３。细胞外液：

ＮａＣｌ１４０ｍｍｏｌ／Ｌ，ＫＣｌ５．４ｍｍｏｌ／Ｌ，ＭｇＣｌ２１ｍｍｏｌ／Ｌ，ＣａＣｌ２

１．８ｍｍｏｌ／Ｌ，ＨＥＰＥＳ１０ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｇｌｕｃｏｓｅ１０ｍｍｏｌ／Ｌ，用

摘要：目的探索成骨细胞如何应答机械应力刺激，并将刺激信号转导进入细胞内，从而调节骨改建的分子机制。方法利用膜片钳及自行设计的流动小室系统对体外培养的单层Ｗｉｓｔｅｒ大鼠乳鼠成骨细胞在可控流体剪切应力作用下诱导细胞膜Ｋ＋通道的开放进行了初步研究。结果剪切应力作用后，成骨细胞膜上Ｋ＋电流明显增大。结论成骨细胞细胞膜上存在剪切应力敏感的Ｋ＋通道，流动剪切应力可以通过影响成骨细胞膜上的Ｋ＋通道的开放引起穿细胞的离子通透性的增加，进而引起细胞内Ｃａ２＋浓度变化，同时诱导细胞内钙调节机制的激活，这些变化都可以进一步引起细胞信号转导机制的激活。关键词：剪切应力；成骨细胞；Ｋ＋通道；膜片钳

中图分类号：Ｒ３３８文章编号：１００９－７０９０（２００７）０６－０４３０－０４

・基础研究・剪切应力诱导成骨细胞钾离子通道开放的研究

王昊，张西正，郭勇，李瑞欣，吴金辉

文献标识码：ＡＳｔｕｄｙｏｎｓｈｅａｒｓｔｒｅｓｓｉｎｄｕｃｅｄｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓＫ＋ｃｈａｎｎｅｌｏｐｅｎｉｎｇＷＡＮＧＨａｏ，ＺＨＡＮＧＸｉ－ｚｈｅｎｇ，ＧＵＯＹｏｎｇ，ＬＩＲｕｉ－ｘｉｎ，

ＷＵＪｉｎ－ｈｕｉ（ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＨｅａｌｔｈＥｑｕｉｐｍｅｎｔ，ＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄｉｃａｌＡｃａｄｅｍｉｃ，Ｔｉａｎｊｉｎ３００１６１，Ｃｈｉｎａ）

Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＺＨＡＮＧＸｉ－ｚｈｅｎｇ．Ｅ－ｍａｉｌ：ｚ５６７８７＠ｓｏｈｕ．ｃｏｍ

Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｓｈｅａｒｓｔｒｅｓｓａｎｄｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇｓｉｇｎａｌｉｎｔｏｃｅｌｌｓａｎｄ

ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｂｏｎｅｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ．ＭｅｔｈｏｄｓＵｓｉｎｇｐａｔｃｈ－ｃｌａｍｐｔｅｃｈｎｉｑｕｅａｎｄｐａｒａｌｌｅｌ－ｐｌａｔｅｆｌｏｗｃｈａｍｂｅｒｓｙｓｔｅｍ，ｔｈｅｃｅｌｌｓ

ｍｅｍｂｒａｎｅ’ｓＫ＋ｃｈａｎｎｅｌｏｐｅｎｉｎｇｏｆｒａｔ’ｓｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎｖｉｔｒｏｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄｕｎｄｅｒｃｏｎｔｒｏｌｌａｂｌｅｓｈｅａｒｓｔｒｅｓｓ．ＲｅｓｕｌｔｓＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｎｏｎｓｈｅａｒｓｔｒｅｓｓ，Ｋ＋ｃｕｒｒｅｎｔｏｆｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ’ｓｍｅｍｂｒａｎｅｉｎｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎａｍｐｌｉｔｕｄｅａｆｔｅｒｓｈｅａｒｓｔｒｅｓｓｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＴｈｅｓｈｅａｒｓｔｒｅｓｓｓｅｎｓｉｔｉｖｅｉｏｎｃｈａｎｎｅｌｅｘｉｓｔｓｏｎｔｈｅｍｅｍｂｒａｎｅｏｆｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ．ＶｉａｔｈｅＫ＋ｃｈａｎｎｅｌ

ｏｐｅｎｉｎｇｏｆｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ’ｓｍｅｍｂｒａｎｅ，ｓｈｅａｒｓｔｒｅｓｓｃａｎｉｎｄｕｃｅｔｈｅｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｆｏｒｉｏｎｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎｉｎｃｅｌｌｓ，ｔｈｅｎｒｅｓｕｌｔｓｉｎｃｈａｎｇｉｎｇｏｆｃｅｌｌＣａ２＋ｃｏｎｖｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ａｎｄｉｎｄｕｃｅｓｔｈｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｃａｌｃｉｕｍｍｏｄｕｌａｔｉｏｎａｔｔｈｅｓａｍｅｔｉｍｅ，ａｌｌｔｈｅｓｅｃｈａｎｇｅｓａｃｔｉｖａｔｅｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｏｆｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓｆｕｒｔｈｅｒ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｓｈｅａｒｓｔｒｅｓｓ；ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ；Ｋ＋ｃｈａｎｎｅｌ；ｃｌａｍｐｐａｔｃｈ

作者单位：军事医学科学院卫生装备研究所，天津３００１６１收稿日期：２００７－０２－０９；修回日期：２００７－０８－２０作者简介：王昊（１９７７－），男，天津市人，硕士，住院医师，主要从事骨组织工程研究。基金项目：国家自然科学基金（１０１７２０９３）；全军医药卫生“十五”科

研基金（０１ＭＡ０８８）通讯作者：张西正。Ｅ－ｍａｉｌ：ｚ５６７８７＠ｓｏｈｕ．ｃｏｍ

４３０－－生物医学工程与临床２００７年１１月第１１卷第６期ＢＭＥ＆ＣｌｉｎＭｅｄ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ２００７，Ｖｏｌ．１１，Ｎｏ．６ＮａＯＨ调ｐＨ至７．３～７．４。

１．１．２主要仪器

膜片钳放大器Ａｘｏｐａｔｈ２００Ｂ（美国Ａｘｏｎ公司），Ａ／Ｄ－Ｄ／Ａ转换板Ｄｉｇｉｄａｔａ１３２２Ａ（美国Ａｘｏｎ公司）倒

置相差显微镜ＩＸ７０（日本Ｏｌｙｍｐｕｓ公司），微电极拉制仪Ｐ８７（美国ＳｕｔｔｅｒＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔ公司），微电极抛光

仪ＭＦ－８３０（日本Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ公司），三维微操仪ＭＰ－２８５（美国ＳｕｔｔｅｒＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔ公司），平衡防震台（中国

上海亿奥光学科技有限公司），微型蠕动泵ＢＴ０１－１００（中国河北保定兰格公司），摄像机ＴＫ－ｃ１３８１（日本ＪＶＣ公司），显示器ＴＭ－１７００ＰＮ－Ｓ（日本ＪＶＣ公司），

自制流动小室。１．２实验方法

１．２．１大鼠成骨细胞分离、培养

分离：每次６只Ｗｉｓｔｅｒ大鼠乳鼠，放入７５％酒精中浸泡消毒１０ｍｉｎ，无菌操作取出颅盖骨；将颅骨置于含Ｄ－ｈａｎｋ＇ｓ液的培养皿中，清除骨膜、血管和结缔组织，并用Ｄ－ｈａｎｋ＇ｓ液洗涤３次；然后将颅盖骨移入含０．２５％胰酶消化液的小瓶中，静置３０ｍｉｎ，以消化清除骨髓和纤维组织；再将骨移入另一含０．１％Ⅰ型胶原酶的消化液小瓶中，用眼科剪在消化液内将其剪碎，于

３７℃振荡消化６０ｍｉｎ；用吸管吹打数次，将含细胞的消

化液移入无菌离心管内，在１０００ｒ／ｍｉｎ下离心１０ｍｉｎ，弃上清液，在沉淀的细胞团块中加入含１０％小牛血清的ＤＭＥＭ培养基，吹打使细胞悬浮，再静置。细胞培养：将制备的细胞悬液按２×１０５／ｍｌ接种

于２５ｍｌ培养瓶中培养，培养基的量为２．５ｍｌ；置培养瓶于３７℃、体积分数５％ＣＯ２培养箱内进行培养；２～３ｄ换液１次。１．２．２成骨细胞的鉴定

采取分次消化法提高细胞的纯度，经倒置相差显微镜观察细胞形态多为立方体，体积小，核圆。细胞长满培养瓶底时，近似方形。用免疫组化的方法检测碱性磷酸酶的活性为阳性；Ⅰ型胶原染色（钙钴法）阳性；钙结节均证明培养的细胞为成骨细胞。１．２．３Ｋ＋

电流的鉴定

将特异性电流阻断剂四乙基铵（ＴＥＡ，浓度为２０ｍｍｏｌ／Ｌ）注入细胞外液，测量电流变化。

１．２．４流体小室实验模型的构建

由蠕动泵、储液瓶及导管和圆形细胞培养皿构成流体小室，流体小室可提供一定的流动剪切应力。经过ＡＮＳＹＳ软件的有限元分析，进口处的剪切应力最大，出口处最小，由进口方向向出口方向随着流动进行剪切应力逐渐减小；小室底面距流体入口处１／３以上位置的流体流动近似于层流，方向基本一致。经过

培养皿中心后，剪切应力分布趋于稳定的数值，剪切应力数值约为２Ｐａ（２０ｄｙｎ／ｃｍ２）。培养皿边缘处的剪

切应力很低。１．２．５成骨细胞全细胞膜片钳记录

于显微镜下选取边缘齐整、表面光滑的成骨细胞进行实验。通过ＰＣＣｌａｍｐｅｘ８．１软件进行成骨细胞离

子通道电流的采集。在２２℃～２４℃室温下记录。由计

算机给予阶跃电压刺激，全细胞电流输入计算机，保

持电位及钳制脉冲顺序的设定、信号采集及贮存，结果分析借助计算机用ＰＣＣｌａｍｐｅｘ８．１软件完成。

１．３统计学方法

数据采用均数±标准差表示，采用ｔ检验，Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。

２结果

在全细胞电压钳制状态下，保持电位为－９０ｍＶ，给予细胞阶梯去极化方波刺激（图１）。测试电位从－９０ｍＶ至＋５０ｍＶ，每次增加１０ｍＶ。在原代及第二代细胞上均可记录到激活的外向电流（图２）。

Ｋ＋电流的鉴别：①Ｋ＋

电流在去极化至在－６０ｍＶ

左右时被激活；②由电流的Ｉ－Ｖ曲线可知，电流值随电压的增大而增大，随着钳制刺激电压的升高，电流

幅值也呈线性上升，存在显著电压依赖性；③加入Ｋ＋通道阻断剂后电流被明显抑制，如图３所示。以２Ｐａ（２０ｄｙｎ／ｃｍ２）剪切应力持续作用后，细胞

电压／ｍＶ２０００－２００－４０００２０４０６０时间／ｍｓ

图１细胞离子通道电流激发脉冲Ｆｉｇ．１Ｓｔｉｍｕｌｕｓｐｕｌｓｅｏｆｃｅｌｌｉｏｎｃｈａｎｎｅｌｃｕｒｒｅｎｔ

图２Ｋ＋离子通道电流Ｆｉｇ．２Ｋ＋ｃｕｒｒｅｎｔ

２０４０６０

电流／ｐＡ２５００２０００１５００１０００５０００－５００－１０００

时间／ｍｓ

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