蛋白质免疫印迹实验（Western Blot）
蛋白质免疫印迹（Western Blot）实验原理
蛋白质免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的一种蛋白质检测方法。对已知的表达蛋白，可以用相应的抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可以融合部分的已知片段进行检测，如HA-tag，Flag-tag，c-myc-tag等。Western Blot采用的是聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳，被检测的是蛋白质，其中检测探针是相应的抗体，显色是使用的标记后的二抗。经过PAGE凝胶分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，如醋酸纤维素膜，固相载体以非共价键的形式吸附蛋白质。然后以固相载体上的蛋白质作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，然后再与标记后的二抗起反应，经过底物显色以检测目的蛋白。
蛋白质免疫印迹（Western Blot）原理
蛋白免疫印迹法主要分为三个阶段进行
第一阶段是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
在这个阶段，经过变性处理的蛋白质样品经SDS处理后会带上阴性电荷,在聚丙烯酰胺
凝胶中在电场的作用下从阴极向阳极泳动,且分子量越小,泳动速度就越快。所以在此阶段，根据蛋白的泳动速度可以将样品中的蛋白质根据其分子量的大小进行分离，此阶段分离效果肉眼不可见。如果想观察蛋白的电泳情况，可以在电泳完成后进行考马斯亮蓝染色进行观察；
第二阶段为电转移，又称为转膜。
即将在凝胶中已经分离的蛋白质条带通过电场的作用转移至硝酸纤维素膜上, 一般选
用恒流300 mA，通电90 min即可将凝胶中的蛋白条带转移到醋酸纤维素膜载体上。转移到载体上的蛋白条带也是肉眼不可见的，如果想观察转移的效果，可以在转移后对载体进行丽春红染液染色。
第三阶段为酶联免疫显色检测
将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜(相当于包被了抗原的固相载体)依次与特异性抗体
和酶标第二抗体作用后,加入能形成不溶性显色物的酶反应底物,使目的条带蛋白显色。在该阶段中，常用的HRP显色底物为3,3'-二氨基联苯胺(呈棕色)和4-氯-1-萘酚(呈蓝紫色).阳性反应的条带清晰可辨,并可根据SDS-PAGE时加入的分子量标准, 确定各组分的分子量。
Western Blot实验流程
二、蛋白免疫印迹实验材料
1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29% (w/v)丙稀酰胺和1% (w/v) N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液：丙稀酰胺29 g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1 g，加H2O至100 ml，储于棕色瓶，4℃避光保存。严格保证PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。
2、十二烷基硫酸钠SDS溶液: 10% (w/v) 0.1 g SDS，1 ml H2O去离子水配制，室温保存。
3、分离胶缓冲液: 1.5 mmol/L Tris-HCL (pH8.8): 18.15 g Tris和48 ml 1mol/L HCL混合，加水稀释到100 ml终体积。
4、浓缩胶缓冲液: 0.5 mmol/L Tris-HCL (pH6.8): 6.05 g Tris溶于40 ml H2O中，用约48 ml 1 mol/L HCL调至pH 6.8加水稀释到100 ml终体积。过滤后室温保存。这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCl调节PH值，而不用Tris.CL。
5、 TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH太低时，聚合反应受到抑制。10% (w/v)过硫酸胺溶液。提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。去离子水配制数ml，临用前配制.
6、 SDS-PAGE加样缓冲液: pH 6.8 0.5 mol/L Tris缓冲液8ml，甘油6.4 ml，10% SDS 12.8 ml，巯基乙醇3.2 ml，0.05%溴酚蓝1.6 ml，H2O 32 ml混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮10 min混匀后再上样，一般为20-25 μl，总蛋白量100 μg。
7、 Tris-甘氨酸电泳缓冲液: 30.3 g Tris，188 g甘氨酸，10 g SDS，用蒸馏水溶解至1000 ml，得0.25 mol/L Tris-1.92 mol/L甘氨酸电极缓冲液。临用前稀释10倍。
8、转膜缓冲液：配制1L转移缓冲液，需称取2.9 g甘氨酸、5.8 gTris碱，并加入200 ml甲醇，加水至总量1 L。
9、丽春红染液储存液：丽春红S 2 g 三氯乙酸30 g 磺基水杨酸 30 g 加水至100 ml 用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液。使用后应予以废弃。
10、脱脂牛奶5% (w/v)。
11、 Tris缓冲盐溶液(TBS): 20 mmol/L Tris/HCL (pH 7.5)，500 mmol/L NaCl。
13、 Tween-20。
三、蛋白样品的制备
可以使用适当的裂解液，裂解细胞获得。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
四、SDS－PAGE电泳
（1）灌胶与上样
①玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。）
②按前面方法配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10 ml 枪吸取5 ml 胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水或者异丙醇，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）
③当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3 min 使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
④按前面方法配浓缩胶, 加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
⑤用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）
⑥测完蛋白含量后，计算含50 μg蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样品至0.5 ml 离心管中，加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。（上样总体积一般不超过15 μl，加样孔的最大限度可加20 μl样品。）上样前要将样品于沸水中煮5 min使蛋白变性。
⑦加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。
（2）电泳
电泳时一般采用200 V恒压，一般电泳45-60 min即可，具体时间则根据所使用的凝胶浓度，浓度越大，所需的时间越长，浓度越小，所需的时间越短。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。
