间接 ELISA 试剂盒在猪乙型脑炎抗体检测中的应用效果评价

猪乙型脑炎症状表现及流行特点

猪乙型脑炎多发于日本、东南亚、俄罗斯、朝鲜、马来西亚、越南、新加坡、泰国、缅甸、斯里兰卡、印度尼西亚，我国的台湾和香港也有报道。下面我们了解一下猪乙型脑炎症状表现及流行特点。

一、猪乙型脑炎的临床症状

(1)人工感染的潜伏期3-4天。猪常突然发病，体温升高达40-41℃，呈稽留热。病猪精神委顿，喜卧，饮欲增加，结膜潮红，食欲减少或废绝，粪干呈球形，表面常覆有灰白色黏液，尿呈深黄色。少部分猪后肢轻度麻痹，有的后肢关节肿胀疼痛而跛行，有的病猪可能有视力障碍。

(2)怀孕母猪感染后，发生流产、早产或延时分娩，胎儿大小不等，且多是死胎或木乃伊胎。流产后，母猪症状减轻，康复后不影响下次配种。有的怀孕母猪临近预产期都不见腹部和乳房膨大，不泌乳。同窝仔猪的大小和病变有显著差别，有的出生后几天内就发生痉挛而死亡，有的却生长发育良好。

(3)公猪感染后除表现一般症状外，常发生睾丸肿胀，且多呈一侧性，程度不一；局部发热，有痛感；约数日后开始消退．多数缩小变硬，失去配种能力。

二、猪乙型脑炎的实验室诊断

(1)初步诊断：根据流行病学，同场公母猪的临床表现，妊娠母猪分娩后所产仔猪情况，病理剖检等资料进行初步诊断。确诊有赖于实验室进行的血清学检查或病毒分离。

(2)病毒分离鉴定：病毒分离是对疑似本病流产或早产的胎儿，采死产仔猪的脑组织，并将其制成悬液，接种于鸡胚卵黄囊内或1-5日龄乳鼠脑内，进行病毒分离，通过中和试验等方法确定分离病毒是否为jev。

(3)血凝抑制试验：乙脑的血凝抑制抗体较补体结合抗体出现的早，一般在发病后4-5天开始出现，病后2周左右达到高峰，并可持续1年左右。因此，测定血凝抑制抗体可以较早的做出诊断。一般按双份血清法判定，即恢复血清的血凝抑制效价为急性期的4倍以上才具有诊断意义。血细胞主要采自鹅、鸽和雏鸡。

·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报

基于重组EP153R蛋白的检测非洲猪瘟病毒抗体的

间接ELISA方法的建立

摘 要：为探究非洲猪瘟病毒（ASFV）EP153R蛋白的功能和建立ASFV抗体间接ELISA方法，本试验构建了EP153R蛋白杆状病毒表达系统，采用Western blot与IFA鉴定rEP153R蛋白的表达和免疫原性。结果显示，杆状病毒能高效表达rEP153R蛋白且可被小鼠多克隆抗体识别，具有良好的免疫原性。以此重组蛋白为抗原进行间接ELISA方法的建立，经方阵ELISA确定当抗原包被量2.5 μg/mL，ASFV阳性血清稀释比1∶1000时为最佳反应条件；以优化后的条件确定了抗体阳性临界值为0.259；特异性试验结果表明，该方法

仅与ASFV阳性血清发生反应，具有较强的特异性；重复性试验结果显示变异率小于10%，重复性良好。利用该方法对46份猪血清进行检测，与商品化试剂盒检测结果对比显示，符合率为91.3%，能较好的区分ASFV阴性血清与阳性血清。本研究的结果为后续EP153R功能研究和ASFV临床血清学诊断奠定了基础。

关键词：非洲猪瘟病毒；杆状病毒；EP153R；ELISA中图分类号： S852.651 文献标志码：A 文章编号：1674-6422（2022）02-0074-10

Development of Indirect ELISA for Detection of African Swine Fever Virus

Antibodies Based on Recombinant EP153R Protein

CHENG Jia1, LI Yao1,2,3, LIU Yingnan2,3, ZHONG Qiuping2,3, SHI Xinjin2,3, WEI Changqing2,3,

XIE Zhenhua2,3, LIAO Xinxin2, SONG Yingying2,3, CHEN Hongjun2,3

96猪业科学 SWINE INDUSTRY SCIENCE 2023年40卷第3期猪群保健HEALTH

随着生猪养殖行业的迅速发展，各种疫病的发生此起彼伏，其中猪乙型脑炎是由媒介蚊虫传播的人兽共患病，即流行性乙型脑炎，又称日本乙型脑炎，会对生猪养殖行业造成一种威胁，若不及时对该病进行防控，还会威胁到人民群众的生命安全。如今生猪养殖业向着规模化养殖转变，对该病的防控压力也在不断增加，而且因为该病可以通过蚊虫叮咬传播，防治更是棘手，养殖场也会因对该病的防治不及时=造成经济损失。对此，要充分了解猪乙型脑炎的流行特征、临床症状、病理变化，并结合其病症及实验室检测对该病进行诊断，针对猪乙型脑炎的发病原因提出具体的防控措施，以促进生猪养殖业的健康有序发展。1 流行特征1.1 病原猪乙型脑炎是由乙型脑炎病毒（称乙脑病毒）感染所致，该病毒是黄病毒科、黄病毒属，单股正链RNA，病毒粒子直径为30～40 nm，有囊膜且有血凝活性，可凝集鹅、鸡等动物的红细胞；该病毒对外部环境抵抗力弱，100℃、2 min或50℃、5 min即可灭活，易被常见消毒剂灭活，对常见的化学药品氯仿、高锰酸钾等较为敏感，但在低温、干燥环境下有较强耐受力。1.2 传染源 猪乙型脑炎是一种自然疫源性猪乙型脑炎的诊断与防控林谋运（福建省浦城县动物卫生监督所，福建 浦城 353400）疫病，被该病毒感染后的动物均会成为本病的传染源，其中对猪的感染最为普遍，感染后的猪会成为传染源。1.3 传播途径猪乙型脑炎的主要传播途径有通过媒介传播或垂直传播。该病可以通过蚊虫叮咬进行传播，该病毒可以在蚊虫体内进行繁殖，当蚊虫叮咬猪只后将卵留在猪只体内，并成为次年感染动物的来源，其传播过程为蚊—猪—蚊。抑或通过患病的怀孕母畜通过胎盘垂直传播于胎儿。1.4 易感动物该病对多种动物都存在感染的风险，对猪只和人类的感染风险最大，其中对不同品种，不同年龄阶段的猪只都会感染，感染后对母猪和公猪危害较大，仔猪和育成猪感染后多为隐性感染，临床症状不明显。1.5 流行特点该病通过蚊虫叮咬传播，对此该病的流行和蚊虫滋生及活动相关联，对季节性有明显要求，该病一般暴发于夏季初秋，蚊虫较多的季节。其次猪群的发病还与猪只的年龄与性成熟相关联；还有对新建场或是没有发生过该病的养殖场发病率高。2 临床症状猪只感染上乙型脑炎后，一般症状是猪只的体温常常升到40～41℃，呈现出稽留热，患病猪精神不振，食欲下降甚至废绝，病猪不喜活动，四肢关节肿大行走时出现跛行。2.1 公猪公猪患上该病后，除了一般临床症状外，公猪还会出现持续的高热，睾丸常出现发红、肿大、有热痛感，一般情况是单侧睾丸肿大，两侧睾丸肿大的情况也会发生，较正常大一倍。后期恢复正常后，部分患病猪只睾丸变小变硬，其性欲下降，精子质量较差，部分公猪丧失配种能力，若经治疗恢复正常后，依然可用于配种。2.2 母猪妊娠母猪患上该病后，除一般临床症状外，会发生突然流产，且流产前临床表现不太明显，只是采食减少或出现体温较小幅度升高，流产后表现出轻微症状，食欲、体温基本正常。对于初产母猪易发生流产、早产，或产出死胎、弱胎。存活的仔猪体质衰弱，站立不稳。部分有神经症状，全身痉挛，不易存活。母猪康复后，部分出现子宫内膜炎、体温升高，流产后会从阴道流出红褐色恶臭液体，部分母猪流产后伴有胎衣不下现象，流产后的母猪不会影响下次配种。2.3 仔猪及育成猪仔猪及育成猪感染该病后，除一般临床症状外，仔猪会突发性抽搐，口中有白色泡沫状液体，感染作者简介：林谋运（1975—），男，中专，兽医师，福建浦城县人，研究方向：动物卫生监督与疫病防控Copyright©博看网. All Rights Reserved. 972023年40卷第3期 SWINE INDUSTRY SCIENCE 猪业科学猪群保健HEALTH后1～2 d死亡。育成猪一般呈现出隐性感染，无明显临床症状。3 病理变化对于公猪可以看到其睾丸有不同程度肿大，切开后可以看到大小不一的黄色坏死灶，并伴有出血症状。肿大至阴囊皱褶消失，鞘膜腔有大量黄褐色液体。若是慢性经过的患病猪会出现睾丸萎缩、硬化，与阴囊粘连，大多呈现结缔组织化。流产母猪解剖后可以看到其子宫内膜充血，肿胀，黏膜有黏液性分泌物，伴有黏膜糜烂和水肿，胎盘伴有炎性反应。流产胎儿可以看到皮肤呈现紫黑色或暗紫色，皮下水肿，胸腔、腹腔存在大量积液，部分胎儿大脑或小脑发育不全，脑部水肿积液严重，呈现非化脓性脑炎，各个脏器都有病理变化并伴有出血点，淋巴结充血，肝脏和脾脏有明显坏死灶，且血液无法正常凝固。4 诊断对于该病的诊断，根据该病的流行特征，临床症状，病理变化对病猪进行初步诊断，再结合实验室检测技术可以对该病进行确诊，同时要注意将该病与伪狂犬病与布鲁氏菌病进行鉴别诊断。4.1 实验室诊断抗原检测适用于流行病学调查及疾病诊断，如今常用荧光定量PCR方法对该病进行病原检测，PCR方法快捷、特异性强，从患病猪上采样，样品可以是其组织、粪便或血液，通过特定引物进行荧光定量PCR检测，可以准确灵敏的确诊该病。抗体检测是对患病猪的血清进行检测，检测其血清中是否含有该病抗体，常用ELISA方法进行检测，该方法操作简单是目前血清学诊断和流行病学调查的重要手段，还可用于疫苗免疫效果评价。 4.2 鉴别诊断（1）猪伪狂犬病猪伪狂犬没有明显季节性，直接接触和间接接触可以进行疫病的传播，对于母猪流产的胎儿大小差异明显。且母猪流产后会出现屡配不孕，但公猪患病后不会出现睾丸肿大。（2）猪细小病毒病 该病发生不存在明显的季节性，母猪初产或二胎母猪才会发生流产，除流产外没有其他明显的临床症状，但母猪会产出大小不一的木乃伊胎，可能产出存活的胎儿，也会产出畸形胎，且公猪没有明显临床症状。（3）布鲁氏菌病母猪感染该病会出现流产，发生在怀孕4—7周或11—15周，妊娠早期流产时，胎儿和胎衣会被母猪吃掉。母猪流产前没有明显的症状。流产的胎儿大多为死胎，并伴有胎衣不下及子宫炎，会影响后续配种，流产后又怀孕，重复流产现象较少。公猪出现睾丸炎和附睾炎，一侧或两侧无痛性肿大，局部有热痛，伴有全身症状。严重时公猪睾丸萎缩、硬化，性欲减退，丧失配种能力。感染猪只出现关节炎，大多在后肢，局部关节肿大，出现跛行。5 发病原因5.1 饲养环境不良猪乙型脑炎主要由蚊虫叮咬传播，一般在7—9月暴发流行，该时间段蚊虫活动加强，再加上夏秋季节，多雨、高温、高湿，蚊虫繁殖加快等因素，养殖场的饲养环境不良，造成该病在夏季秋初暴发；其次有的养殖场为了节省成本，养殖场建设不规范，周围环境恶劣，排污沟杂草丛生的情况，缺少防风林，蚊虫容易滋生并进入养殖场，造成该病的传播流行；养殖场环境管理不到位是猪乙型脑炎容易发生的原因之一，这不仅仅会给养殖户造成损失，还会阻碍生猪养殖行业的发展。5.2 防疫措施不到位防疫措施不到位也是造成该病传播的重要原因，因养殖场没有按规范建设，没有做好防蚊灭蚊的基本措施，圈舍内缺少纱窗，门口缺少纱网门，没有对养殖场周围进行灭蚊驱虫。其次养殖人员缺乏专业知识，防疫意识不到位，养殖过程中缺少消毒、接种疫苗等工作，从而导致疫病的发生；还有养殖场缺少消毒设备，通风设备等，导致养殖防疫设备不齐全，导致防疫工作难以开展，增加了该病暴发的风险。6 防治措施6.1 药物治疗对于感染上该病的猪只临床症状不太明显，可以采用中药治疗的方法，可取生石膏、板蓝根各120 g，大青叶60 g，生地、连翘、紫草各30 g，黄芩20 g，加水煎熬至100 mL，灌服，1 d/次，连用3～7 d。或是生石膏80 g，大黄10 g，元明粉、板蓝根、生地、连翘各20 g，加水煎熬，灌服，1 d/次，连用3～7 d。而若病猪出现全身症状时，可使用西药治疗。病猪肌肉注射10 mL安乃近注射液，1 d２次，使病猪体温下降到正常体温，其间避免患病猪只出现继发感染，可静脉注射20 mL的10%磺胺嘧啶钠注射液，或50 mL的25%葡萄糖注射液，或肌肉注射5万IU青霉素和5万IUCopyright©博看网. All Rights Reserved. 98猪业科学 SWINE INDUSTRY SCIENCE 2023年40卷第3期猪群保健HEALTH链霉素，避免出现继发感染。为保证健康猪群免疫力，可以在饲料或饮水中添加复合多维，提高猪群免疫力。6.2 疫苗免疫接种猪乙型脑炎病对生猪养殖危害较大，因此做好预防措施，疫苗免疫接种是预防该病的重要一步。由于该病的传播是通过蚊虫叮咬进行的，对此进行免疫接种，需要考虑到当地蚊虫旺盛活动前１个月注射，确保可以在猪体内产生相应的免疫作用，所以对猪群进行猪乙型脑炎活疫苗紧急免疫接种，一般是选择在4—5月初进行初次免疫，7—8月再进行二次疫苗免疫。确保猪群在蚊虫大肆活动的时间段对该病有一定的免疫力，可以更好地预防该病的发生。6.3 加强饲养管理科学的饲养管理对该病的防控也必不可少，强化饲养环境，提供干净舒适的圈舍环境，做好圈舍内的通风，维持好圈舍内的温湿度，同时要对猪群的活动场所进行清洁消毒工作，减少蚊虫的滋生；还要对养殖场周围进行灭蚊防蚊，要在圈舍安装纱网防止蚊虫进入养殖场，防止疫病的传播。在此基础上要做好饲养中的观察工作，观察猪群的采食、饮水、精神状态等情况，便于及早发现问题，并对问题进行处理，从多方面对该病进行有效的防控，减少疫病的发生。 7 结语猪乙型脑炎的发生与流行严重损害养殖户的经济效益，同时对生猪养殖业的发展也形成不小阻力，还会对人们的生命健康造成威胁，因此充分了解猪乙型脑炎尤为重要，针对该病的流行特征、临床症状及发病原因做到防治结合，运用中西医治疗相结合的方法，对感染该病的猪只进行治疗，同时也要加强对猪乙型脑炎的防控，从药物治疗、疫苗免疫接种、饲养管理等方面入手，避免猪乙型脑炎发生，确保养殖户收益和生猪养殖业健康发展。（收稿日期：2022-09-29）广告

养猪ＳＷＩＮＥ　ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ（３）　２０１７　◆Ａ疫苗组■Ｂ疫苗组▲Ｃ疫苗组★空白对照组　１　ｗ　２　Ｗ　３　Ｗ　４　Ｗ　５　Ｗ　６　Ｗ　７　Ｗ　图１猪ＪＥ疫苗免疫组与空白对照组抗体阳性率比较　３小结与讨论　猪是ＪＥＶ最重要的传染源、储存宿主和扩大器网。　猪在感染ＪＥＶ后病毒血症维持时间较长，而且猪感　染后一般不出现脑炎症状，而种猪感染后的症状主　要为流产、死胎等。随着猪的饲养量日渐增多，并且　猪群每年的更新速度很快，而新生仔猪由于母源抗　体的消失，同时在未进行疫苗免疫接种的情况下，对　ＪＥＶ十分易感，可由携带ＪＥＶ的蚊虫叮咬后发生感　染从而成为新的传染源［５１。　通过对Ａ、Ｂ弱毒苗免疫组和空白对照组ＪＥ抗　体阳性率的比较分析发现，两个弱毒苗免疫组在免　疫后４周抗体水平均可达到９０％以上，并可维持到　７周以上。Ａ、Ｂ两种疫苗均为ＳＡ１４—１４—２毒株的弱　毒苗，表明两个厂家生产的ＪＥ疫苗，在免疫效果上　无明显差异。　Ｃ疫苗组为灭活疫苗组，在免疫后４周抗体水　平达到８５％，５周后抗体水平均可达到９０％以上，也　可维持到７周以上。与Ａ、Ｂ弱毒苗免疫组相比，免　疫效果上也无明显差异。　另外，在本试验过程中还发现，空白对照组在第　５周后出现了抗体转为阳性的情况，出现这种情况　的原因有可能是本次试验选用的疫苗中有弱毒苗，　各试验组之间只是相对分栏，但还是饲养在一栋栏　舍内，疫苗毒有可能通过蚊虫叮咬而传染给其他栏　舍内的猪；其次，由于检测抗体所用的ＥＬＩＳＡ试剂　盒无法区分疫苗毒和野毒，也无法排除有可能是野　毒感染后而产生的抗体。　通过本次试验，显示弱毒疫苗与灭活疫苗在免　疫效果上无明显差异，表明乙型脑炎疫苗对猪进行　免疫接种后，均可达到较理想的免疫效果，说明乙型　脑炎疫苗的预防接种仍然是现阶段防控乙型脑炎最　有效的预防措施之一。因此，对于乙型脑炎的防控，　首先要做好免疫预防，在此前提下，还要切实做到加　强饲养管理，做好环境消毒、灭蚊等生物安全工作，　才能防止本病的发生。　参考文献　ｆｌ１殷震，刘景华．动物病毒学【Ｍ】．２版．北京：科学出版社，１９９７：　４７０－４７３．　［２］段正赢，周丹娜，郭锐，等．浅谈猪乙型脑炎的防治［Ｊ】＿湖北畜　牧兽医，２０１５，３６（８）：２５—２６．　【３】刘刚潴乙型脑炎抗体检测试验叨．黑龙江畜牧兽医，２０１４（１）：　６６－６７．　『４１陈孝明，亓文宝，张桂红，等．广东省部分规模化猪场乙脑抗　体的监测与分析　广东农业科学，２０１０（９）：１５４—１５５．　【５１张海明，薛红，段晓冬，等．猪流行性乙型脑炎免疫抗体消长　规律的研究『Ｊ］．黑龙江畜牧兽医，２０１３（９）：１０９一ｌ１２．　（编辑：郭玉翠）　睡觉缓解慢性疼痛好于镇痛药　【埃菲社伦敦５月８日电】题：多睡觉或摄入咖　啡因缓解慢性疼痛效果好于镇痛药　英国《自然》周ＴＪＪＴＩＩ登的一篇新研究报告显示，多　睡觉或摄入含咖啡因等提神成分的食物，可以明显缓　解慢性疼痛，其效果要好于布洛芬、吗啡等镇痛药。　波士顿儿童医院和哈佛大学医学院联合进行　的一项研究通过在小鼠身上的实验，对重度或慢性　睡眠不足与对疼痛刺激敏感度之间的关联进行了分　析和评估。　睡眠医学专家克洛艾・亚历山大博士介绍说，　研究人员用玩具、游戏等娱乐活动对小鼠进行了睡　眠剥夺，以此模拟那些用夜间睡眠时间看电视的人　的生理状况。然后，研究人员又对这些小鼠对疼痛　刺激的敏感度进行了评估和测定，这些刺激来自一　定程度的热、冷、挤压以及辣椒素。研究人员记录了　小鼠对每一种疼痛刺激的反应时间。　亚历山大说：“我们发现，连续５天的适度睡眠　剥夺会显著加剧健康小鼠对疼痛的敏感度。”而令　人惊讶的是，布洛芬、吗啡等常用镇痛药并不能抑制　由睡眠剥夺导致的疼痛敏感度提升。而实验表明，　咖啡因、莫达非尼等觉醒促进剂则可以在小鼠身上　有效抑制睡眠剥夺导致的疼痛敏感度提升。　亚历山大表示，这一研究发现提供了一种以前　不为人知的新镇痛机制，这种机制取决于承受疼痛　的动物的生理状况。许多患者陷于疼痛与睡眠不足　的恶性循环之中，而咖啡因等觉醒促进剂可以打破　这种恶性循环，发挥镇痛药无法达到的效果。　（转自参考消息『Ｎ］，２０１７—０５—１０）　８　６　４　２　１　Ｏ　０　Ｏ　Ｏ　０