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癌胚抗原(CEA)ELISA试剂盒说明书本试剂仅供研究使用标本：体液癌胚抗原(CEA)ELISA试剂盒说明书试验原理：BFGF试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）.已知BFGF浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。
先将BFGF和生物素标记的抗体同时温育。
人碱性成纤维细胞生长因子ELISA 检测试剂盒洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。
再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。
产生颜色。
颜色的深浅和样品中BFGF的浓度呈比例关系。
癌胚抗原(CEA)ELISA试剂盒说明书自备材料1．蒸馏水。
2．加样器：5ul、10ul、50ul、100ul、200、500ul、1000ul。
3．振荡器及磁力搅拌器等。
安全性1．避免直接接触终止液和底物A、B。
一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。
2．实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。
3．不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。
癌胚抗原(CEA)ELISA试剂盒说明书操作注意事项1．试剂应按标签储存，使用前恢复到室温。
稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。
2．实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。
3．不用的其它试剂应包装好或盖好。
不同批号的试剂不要混用。
保质前使用。
4．使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。
5．使用干净的塑料容器配置洗涤液。
使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。
6．洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。
7．底物A应挥发，避免长时间打开盖子。
底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。
避免用手接触，有毒。
实验完成后应立即读取OD值。
8．加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。
9．按照中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。
癌胚抗原(CEA)ELISA试剂盒说明书样品收集、处理及保存方法1、血清-----操作过程中避免任何细胞刺激。
碧云天生物技术/Beyotime Biotechnology 订货热线：400-168-3301或800-8283301 订货e-mail ：******************技术咨询：*****************网址：碧云天网站 微信公众号Human IL-1β ELISA Kit产品编号 产品名称包装 PI305Human IL-1β ELISA Kit96次产品简介：碧云天的Human IL-1β ELISA Kit (Human Interleukin-1β Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Kit)，即人白细胞介素1β酶联免疫吸附检测试剂盒，是一种用于特异性地高灵敏地定量检测人血清、血浆、细胞或组织裂解液、或细胞培养上清液中的IL-1β的ELISA 试剂盒。
本产品检测灵敏度高，特异性强，重复性好。
多次重复检测结果表明，最小检出量为2.2pg/ml ，与人IL-1r α、IL-1sRII 、IL-1sRI 、小鼠IL-1α、小鼠IL-1β等均没有交叉反应，板内、板间变异系数均小于10%。
IL-1即白细胞介素-1(简称白介1)，其家族由IL-1α(也称IL-1F1)、IL-1β(也称IL-1F2)、IL-1受体拮抗剂(IL-1 receptor antagonist, 简称IL-1RA, 或IL-1F3)及IL-18、IL-33和IL-1F5~F10组成。
IL-1主要由巨噬细胞产生，此外几乎所有的有核细胞，如B 细胞、NK 细胞、体外培养的T 细胞、角质细胞、树突状细胞、星形细胞、成纤维细胞、中性粒细胞、内皮细胞以及平滑肌细胞均可产生IL-1。
正常情况下只有皮肤、汗液及尿液中含有一定量的IL-1，绝大多数细胞在受到外来抗原或细菌内毒素刺激后才能合成和分泌IL-1。
IL-1β在免疫和炎症反应、骨重建(bone remodeling)、发烧、碳水化合物代谢等生理、病理过程中都有重要作用。
本试剂盒只能用于科学研究，不得用于医学诊断人（Human）白蛋白（Albumin）ELISA检测试剂盒使用说明书检测原理试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。
往预先包被白蛋白（Albumin）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。
用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的白蛋白（Albumin）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。
样品收集、处理及保存方法1.血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2.血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。
3000转离心30分钟取上清。
3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4.组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。
3000转离心10分钟取上清。
5.保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
自备物品1.酶标仪（450nm）2.高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL3.37℃恒温箱操作注意事项1.试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。
从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。
2.实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。
3.浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或者空白；按照说明书操作时样本已经稀释5倍，最终结果乘以5才是样本实际浓度。
4.严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。
5.所有液体组分使用前充分摇匀。
上海笃玛生物科技有限公司试剂盒组成名称96孔配置48孔配置备注微孔酶标板12孔×8条12孔×4条无标准品0.3mL*6管0.3mL*6管无样本稀释液6mL3mL无检测抗体-HRP10mL5mL无20×洗涤缓冲液25mL15mL按说明书进行稀释底物A6mL3mL无底物B6mL3mL无终止液6mL3mL无封板膜2张2张无说明书1份1份无自封袋1个1个无注：标准品（S0-S5）浓度依次为：0、15、30、60、120、240ng/mL试剂的准备20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。
联科生物技术有限公司 全国免费电话：800 8571 184第四章细胞因子ELISA 试剂盒简介：美国Peprotech公司作为知名的重组细胞因子生产商，开发出了50余种细胞因子的ELISA检测试剂盒，试剂盒的检测灵敏度高，检测范围宽，为您的科研提供了又一有力的工具。
试剂盒组分及重悬方法：包被抗体--100ug 经抗原亲和纯化的包被抗体，冻干粉重悬--用1ml无菌蒸馏水重悬成100ug/ml的贮存液保存--4-8℃，保存两个月；-20℃分装冻存可贮存6个月检测抗体--100ug 经抗原亲和纯化的生物素标记的检测抗体，冻干粉重悬--用1ml无菌蒸馏水重悬成100ug/ml的贮存液保存--4-8℃，保存两个月；-20℃分装冻存可贮存6个月标准品--准确计量的重组细胞因子冻干粉，具体含量见说明书重悬--按说明书1ml无菌蒸馏水重悬成适当浓度的贮存液保存--4-8℃，保存1周；-20℃分装冻存可贮存2个月亲合素偶联的过氧化物酶--60ul/瓶，液体分装--分装到10只小瓶中，每瓶6ul保存---20℃分装冻存可贮存2年实验所需的材料：ELISA酶标板：推荐Nunc maxisorp，产品编号：442404Tween-20：推荐Sigma，产品编号：P-7949BSA(牛血清白蛋白)：推荐Sigma，产品编号：A-7030ABTS底物溶液：推荐Sigma，产品编号：A-3219Dulbecco's PBS(10X)：推荐Gibco BRL，产品编号：14200-075相关溶液配制：PBS：用无菌蒸馏水将10X PBS稀释为1X PBS洗涤液：含0.05% Tween-20的PBS封闭液：含1% BSA的PBS，过滤除菌，4℃保存1周稀释液：含0.05% Tween-20和0.1% BSA的PBS，过滤除菌，4℃保存1周注：以上所有试剂在使用前必须复温至室温。
包板：1) 用PBS将包被抗体稀释成1ug/ml，立即加到酶标板中，每孔100ul；2) 密封酶标板，室温孵育过夜；3) 吸除孔中的液体，并用300ul洗涤液洗孔4次；4) 最后一次洗涤后，将酶标板倒置除去残留的液体，并倒扣在吸水纸吸干孔沿上的液体；5) 每孔加300ul封闭液，室温孵育至少1小时；6) 吸除孔中的液体，并洗孔4次。
肿瘤标志物检测与临床发布时间03年03月28日 10时54分在肿瘤的研究和临床实践中，早期发现、早期诊断、早期治疗是关键。
肿瘤标志物（Tumor Marker TM）在肿瘤普查、诊断、判断预后和转归、评价治疗疗效和高危人群随访观察等方面都具有较大的实用价值。
自80年代以来，随着应用B淋巴细胞杂交瘤制备肿瘤单克隆技术的不断成熟，出现了大量的抗肿瘤的单克隆抗体，并与同时出现且日新月异的免疫学检测技术（RIA、IRMA、ELISA、CLIA、IFA、TRFIA 等）相结合，发展了众多的肿瘤标志物检测项目并不断地应用于临床，已成为肿瘤患者的一个重要检查指标。
1、概述1.1 一般而论，肿瘤标志物主要是指癌细胞分泌或脱落到体液或组织中的物质，或是缩主对体内新生物反应而产生并进入到体液或组织中的物质。
这些物质有的不存在于正常人体内只见于胚胎中，有的在肿瘤病人体内含量超过正常人体内含量。
通过测定其存在或含量可辅助诊断肿瘤、分析病程、指导治疗、监测复发或转移、判断预后，这类TM称为体液TM。
随着分子生物学技术的发展，从分子水平发现基因结构或功能的改变以及具有一定生物学功能的基因产物的非正常表达均与肿瘤的发生、发展密切相关，所以测定癌基因、抑癌基因及其产物也属TM之列。
由于这些物质存在于细胞膜上或细胞内如激素受体、生长因子受体、白血病表型、分子基因等，故把这类物质称为细胞TM。
由于肿瘤发生发展的原因至今不明，因此，TM的定义还有待于进一步的完善。
1.2 "理想"的肿瘤标志物的特点：所谓"理想"的肿瘤标志物，一般认为应具有下列特点：(1)敏感性高，能早期测出所有肿瘤患者；(2)特异性好，鉴别肿瘤和非肿瘤患者应100％准确；(3)有器官特异性，能对肿瘤定位；(4)血清中浓度与瘤体大小、临床分期相关，可用以判断预后；(5)半衰期短，能反映肿瘤的动态变化，监测治疗效果、复发和转移；(6)测定方法精密度、准确性高，操作简便，试剂盒价廉。
双抗体夹心ELISA法检测样本中IL-1β的浓度检测原理:本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中IL-1β的浓度。
IL-1β捕获抗体已预包被于酶标板上，当加入标本或参考品时，其中的IL-1β会与捕获抗体结合，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。
当加入生物素化的抗人IL-1β抗体后，抗人IL-1β抗体与IL-1β接合，形成夹心的免疫复合物，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。
随后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素。
生物素与亲合素特异性结合，亲合素连接的酶就会与夹心的免疫复合物连接起来；其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。
最后加入显色剂，若样本中存在IL-1β将会形成免疫复合物，辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质，在加入终止液后呈黄色。
通过酶标仪检测，读其450nm处的OD值，IL-1β浓度与OD450值之间呈正比，通过参考品绘制标准曲线，对照未知样本中OD值，即可算出标本中IL-1β浓度。
标本收集:1.标本的收集请按下列流程进行操作：A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可；B.血清标本应是自然凝固后，取上清，避免在冰箱中凝固血液；C.血浆标本，推荐用EDTA的方法收集若待测样本不能及时检测；D.标本收集后请分装，冻存于－20℃，避免反复冻融。
2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂；3.标本应清澈透明，检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除；4.请勿使用溶血，高血脂或污染的标本检测，否则结果将不准确。
注：正常人血清或血浆样本请用标本缓冲液做倍比稀释后再检测。
注意事项:1.试剂盒请保存在2～8℃。
2.浓缩洗涤液因在低温下可能有结晶，请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液。
3.若标准品复溶后，请在三天内用完。
4.底物请勿接触氧化剂和金属。
5.加样时，请及时更换枪头，避免交叉污染。
6.严禁混用不同批号的试剂盒组份。
7.充分混匀对保证反应结果的准性很重要，在加液后请轻轻叩击边缘以保证混匀。
8.室温反应，请严格控制在25～28℃。
弥漫性大B细胞淋巴瘤Bcl—2蛋白与血管新生关系的研究作者：陈宝伶来源：《中国现代医生》2016年第36期[摘要] 目的探讨弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）Bcl-2蛋白的表达，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和微血管密度（microvessel density，MVD）的相关性，研究弥漫性大B细胞淋巴瘤Bcl-2蛋白与血管新生的关系。
方法采用免疫组织化学染色方法（EnVison）检测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者和对照组淋巴结组织中VEGF、Bcl-2、MVD表达情况。
结果弥漫性大B细胞淋巴瘤患者Bcl-2蛋白、MVD、VEGF 阳性表达均明显高于对照组，差异有统计学意义（P[关键词] 弥漫性大B细胞淋巴瘤；血管内皮生长因子；血管新生；B细胞淋巴因子2蛋白；免疫组织化学[中图分类号] R733.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）36-0032-05[Abstract] Objectives To investigate the relationship among the expression of Bcl-2 protein，VEGF and MVD and discuss the relationship between angiogenesis and Bcl-2 in diffuse large B cell lymphoma. Methods Immunohistochemical assay（EnVison） was performed to test the VEGF，Bcl-2 and microvessel density in diffuse large B cell lymphoma and control group. Results The expression of Bcl-2， MVD and VEGF in diffuse large B cell lymphoma was significantly higher than control group （P[Key words] Diffuse large B cell lymphoma； Vascular endothelial growth factor（VEGF）；Angiogenesis； B cell lymphoma 2 protein； Immunohistochemical assay弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤中最常见的一类侵袭性淋巴瘤[1]。
LOXL1-AS1对OGD 诱导的人脑微血管内皮细胞损伤的影响徐枫1， 黎村丰2， 朱观祥2摘要： 目的 考察长链非编码RNA （lncRNA ）LOXL1反义RNA 1（LOXL1-AS1）对氧糖剥夺（OGD ）诱导的人脑微血管内皮细胞（HBMEC ）凋亡和炎性因子表达的影响与机制。
方法 将HBMEC 分为对照组（正常培养）、OGD 组（OGD 损伤）、OGD+si -NC 组（转染si -NC+OGD 损伤）、OGD+si -LOXL1-AS1组（转染si -LOXL1-AS1+OGD 损伤）、OGD+miR -NC 组（转染miR -NC+OGD 损伤）、OGD+miR -761组（转染miR -761 mimic+OGD 损伤）、OGD+si -LOXL1-AS1+阴性对照组（转染si -LOXL1-AS1与anti -miR -NC+OGD 损伤）、OGD+si -LOXL1-AS1+miR -761抑制剂组（转染si -LOXL1-AS1与miR -761 inhibitor+OGD 损伤）。
RT -qPCR 检测LOXL1-AS1和miR -761表达，CCK -8法检测细胞存活率，流式细胞术检测细胞凋亡，Western blotting 检测B 细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl -2）蛋白、Bcl -2相关X 蛋白（Bax ）表达，酶联免疫吸附测定法（ELISA ）检测炎性因子白细胞介素-6 IL -6、IL -1β和肿瘤坏死因子-α（TNF -α）水平。
双荧光素酶报告实验检测LOXL1-AS1和miR -761的互补结合。
结果 与对照组相比，OGD 组HBMEC 的LOXL1-AS1表达量、凋亡率、Bax 表达量、IL -6、IL -1β和TNF -α水平均升高，存活率、Bcl -2表达量减少（均P <0.05）。
抑制LOXL1-AS1后，与OGD 组或OGD+si -NC 组相比，OGD+si -LOXL1-AS1组HBMEC 的LOXL1-AS1表达量、凋亡率、Bax 表达量、IL -6、IL -1β和TNF -α水平降低，存活率、Bcl -2表达量增加（均P <0.05）。
癌胚抗原(CEA)ELISA试剂盒说明书本试剂仅供研究使用标本：体液癌胚抗原(CEA)ELISA试剂盒说明书试验原理：BFGF试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）.已知BFGF浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。
先将BFGF和生物素标记的抗体同时温育。
人碱性成纤维细胞生长因子ELISA 检测试剂盒洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。
再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。
产生颜色。
颜色的深浅和样品中BFGF的浓度呈比例关系。
癌胚抗原(CEA)ELISA试剂盒说明书自备材料1．蒸馏水。
2．加样器：5ul、10ul、50ul、100ul、200、500ul、1000ul。
3．振荡器及磁力搅拌器等。
安全性1．避免直接接触终止液和底物A、B。
一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。
2．实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。
3．不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。
癌胚抗原(CEA)ELISA试剂盒说明书操作注意事项1．试剂应按标签储存，使用前恢复到室温。
稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。
2．实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。
3．不用的其它试剂应包装好或盖好。
不同批号的试剂不要混用。
保质前使用。
4．使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。
5．使用干净的塑料容器配置洗涤液。
使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。
6．洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。
7．底物A应挥发，避免长时间打开盖子。
底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。
避免用手接触，有毒。
实验完成后应立即读取OD值。
8．加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。
9．按照中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。
癌胚抗原(CEA)ELISA试剂盒说明书样品收集、处理及保存方法1、血清-----操作过程中避免任何细胞刺激。
产品信息和操作指南Human IL-1β预包被 ELISA kit Cat# : DKW12-1012-048 / DKW12-1012-096本试剂盒专用于科研，而非用于诊断Human IL-1βDKW12-1012目录产品简介 (1)知识背景 (1)试剂盒提供的试剂 (2)需要实验者自行准备的试剂与仪器 (2)注意事项 (3)试剂的配制 (5)操作过程 (7)结果分析 (9)试剂盒的保存 (9)操作步骤一览表 (10)参考文献 (11)ELISA测定中可能会出现的问题及解决方法 (12)预包被ELISA 试剂盒系列产品 (15)1、产品简介：达优®人IL-1β ELISA试剂盒是通过酶联免疫吸附技术，体外定量检测人血清、血浆、缓冲液或细胞培养液中的IL-1β，可同时检测天然的和重组的IL-1β。
本试剂盒为预包被板，“夹心一步”完成，整个过程孵育时间不超过4小时，洗涤6次，操作时间大大减少。
本试剂盒专用于科研，而非用于诊断。
使用前请仔细阅读说明书并检查试剂盒组分，若有任何疑问请与达科为生物工程有限公司联系，E-mail：*************.检测范围：500-15.6 pg/mL灵敏度：5 pg/mL重复性：板内、板间变异系数均＜10％。
2、知识背景：白细胞介素-1（Interleukin-1，IL-1）家族蛋白包括IL-1α、IL-1β和IL-1受体拮抗物。
除了皮肤角质化细胞、一些上皮细胞和中枢神经系统的一些细胞之外，IL-1并不在健康个体的未经刺激的细胞中分泌。
生理条件下IL-1的浓度仅在10-12-10-14M之间。
然而，为了应对刺激（如炎症物质、感染、细菌性内毒素），巨噬细胞和各种其它类型的细胞的IL-1分泌量将大大增加（1-4）。
3、试剂盒提供的试剂：试剂规格配制Cytokine standard 2/1瓶* 干粉状，按瓶上说明操作Biotinylated antibody 2/1瓶* 1：50用Dilution buffer R（1×）稀释Streptavidin-HRP 2/1瓶* 1：100用Dilution buffer R（1×）稀释Dilution buffer R（1×） 3/2瓶* 即用型Washing buffer（50×）1瓶 150∶用蒸馏水稀释TMB 1瓶即用型Stop solution 1瓶即用型Precoated ELISA plate 8×12或8×6*即用型封板膜 2/1张* 即用型说明书1份*：96/48 Tests4、需要实验者自行准备的试剂与仪器：1．酶标仪（建议参考仪器使用说明提前预热）2．微量加液器及吸头：P10，P50，P100，P200，P1000 3．蒸馏水或去离子水4．全新滤纸5．旋涡振荡器和磁力搅拌器5、注意事项：1.试剂应按瓶上标签说明储存，使用前室温平衡20-30分钟。
收稿日期:2001201205基金项目:甘肃省自然科学基金资助项目(Z 59912A2320652Y )作者简介:江瑛(1964—),女,河南卢氏人,讲师,硕士.主要研究方向为病理学与病理生理学.博莱霉素肺损伤大鼠细胞凋亡及bcl 22/bax 基因的表达江 瑛1,祁 鑫2,王丽京2,邱 桐1(1.甘肃中医学院,甘肃兰州 730000; 2.兰州医学院,甘肃兰州 730000)摘 要:目的:探讨细胞凋亡与博莱霉素诱导大鼠早期肺纤维化及bax ,bcl 22对博莱霉素大鼠肺纤维化细胞凋亡的作用.方法:通过复制博莱霉素大鼠肺纤维化模型,采用T UNE L 、免疫组织化学、原位杂交及透射电镜等技术,观察博莱霉素大鼠肺组织细胞凋亡的变化及bax ,bcl 22,bcl 22mRNA 和蛋白的表达.结果:博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化细胞凋亡明显增加,肺上皮细胞bax 蛋白表达明显上调,bcl 22mRNA 及蛋白表达明显减弱,间质细胞bcl 22mRNA 及蛋白表达增加.结论:肺组织细胞凋亡及bcl 22表达下调可能参与博莱霉素诱导大鼠肺纤维化的发生,凋亡相关基因bax ,bcl 22mRNA 及蛋白参与博莱霉素诱导大鼠肺纤维化细胞凋亡的调控.关键词:肺纤维化;博莱霉素;细胞凋亡;bax ,bcl 22,bcl 22mRNA中图分类号:R 28516 文献标识码:A 文章编号:10012988Ⅹ(2001)022*******凋亡是细胞死亡的一种形式,也是一种细胞清除机制.细胞凋亡在炎症、损伤、组织修复过程中发挥着重要作用,如急性肺损伤的修复需要通过细胞凋亡清除肺泡腔和肺间隔增殖的间质细胞和炎性细胞,否则,就会因细胞毒性内容物的释放致使炎症扩大,间质持续增生,发生纤维化;但若过度凋亡,超过吞噬细胞清除能力,又会导致器官功能衰竭[1,2].bcl 22(B cell lym phoma/leukemia 22)是最早在人类细胞中发现的凋亡调控癌基因,bax (bcl 22ass ociated x gene )是在人前白细胞基因文库中发现的一种凋亡相关基因,二者在组织细胞中的表达量与细胞凋亡的调控紧密相关[3].以往关于博莱霉素(BLM )诱导肺纤维化的研究大多集中在细胞因子、黏附分子及基质蛋白等方面,而关于细胞凋亡与肺纤维化的研究报告甚少.国外学者发现[4],BLM 诱导小鼠肺纤维化,其支气管粘膜上皮细胞、肺泡上皮细胞发生了明显凋亡,P53,P21,FAS/FAS L 等凋亡调节蛋白在肺损伤和肺纤维化的发生机制中起了重要作用,但是有关bcl 22/bax 在BLM 肺纤维化中的作用,尚未见报道.笔者利用原位末端标记(T UNE L )、透射电镜、免疫组织化学(IHC )和原位杂交(ISH )的方法,对BLM 大鼠肺纤维化细胞凋亡及凋亡相关基因bax/bcl 22的表达及其意义进行了初步探讨.1 材料与方法111 材料11111 动物 Wistar 大鼠16只,雌性,体重250～300g ,由兰州医学院实验动物中心提供.11112 药品与试剂 BLM ,日本株式会社生产(391660).细胞凋亡原位检测试剂盒(in situ 16 第37卷2001年第2期 西北师范大学学报(自然科学版) V ol 137 2001 N o 12 Journal of N orthwest N ormal University (Natural Science ) cell detection kit ,Ap ),德国宝灵曼公司生产.鼠抗2bax (b 29)单克隆抗体和兔抗2bcl 22多克隆抗体,均为Santa Cruz 公司产品,购自武汉博士德生物工程有限公司.bcl 22质粒cDNA (质粒pDOR 2S B 814,含119kb 的bcl 22基因片段),由第四军医大学馈赠.cDNA 探针地高辛标记及检测试剂盒,德国宝灵曼公司生产.免疫组织化学S ABC (Strept avidin 2biotin 2peroxidase com plex )试剂盒,DAB 显色试剂盒等,均购自武汉博士德有限公司.112 方法11211 动物模型复制及标本制备 参照文献[5]方法,以1%戊巴比妥钠(40mg/kg 体重)腹腔麻醉大鼠,取仰卧固定位,常规消毒,行颈部正中切口,钝型分离暴露气管,于气管软骨环间隙穿刺注入BLM 生理盐水溶液012～013m L (BLM 5mg/kg 体重),立即将动物直立并行旋转,缝合皮肤,待动物自然清醒后置笼内常规饲养.对照组(假手术组)以等容量生理盐水(NS )注入气管代之.模型建立后第14d 心脏放血处死大鼠,取右肺中叶置4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,连续切片6张,2张贴于常规处理的载玻片上,2张贴于经明胶铬矾处理的载玻片上,2张贴于经氨基三乙氧基硅烷(APES )和焦碳酸二乙酯(DEPC )处理的载玻片上,切片厚4～6μm ,60℃干燥,拟行HE 、Mass on 、IHC 、T UNE L 和ISH.取右肺上叶1mm 3组织,以215%戊二醛和1%饿酸双固定,环氧树脂包埋,超薄切片,醋酸铀及枸橼酸铅双染色,拟行透射电镜观察.11212 T UNE L 染色 按细胞凋亡检测试剂盒提供的操作步骤进行,BCIP/NBT 显色.阴性对照用P BS 代替TdT 标记混合液.以整个细胞核的深蓝着色为阳性,每例选择5个不重叠同向移行的高倍(10×40)视野,用网络测试法计数阳性细胞数,凋亡指数=凋亡细胞数/mm 2.11213 IHC 染色 按S ABC 试剂盒提供的操作步骤进行,一抗浓度为1∶50bax 单抗工作液,1∶200bcl 22单抗工作液,DAB 避光显色.阳性对照由博士德公司提供,阴性对照采用缓冲液代替一抗.标本无阳性反应细胞或阳性反应细胞率<10%为(-),标本阳性细胞呈深棕黄色或阳性细胞率>50%,为(6),标本阳性细胞呈棕黄色或阳性细胞率介于10%～50%为(+).11214 ISH 探针标记参照德国宝灵曼公司地高辛标记试剂盒说明(随机引物法)进行.bcl 22mRNA 原位杂交按照德国宝灵曼公司原位杂交试剂盒提供的操作流程进行.bcl 22探针浓度为2×10-6g/m L ,BCIP/NBT 避光显色.设无探针为空白对照及不加地高辛抗体为阴性对照.原位杂交阳性结果细胞呈兰紫色,结果判定标准同IHC.2 结果211 HE 染色 模型组病变区域肺泡腔及肺间隔中大量巨噬细胞、淋巴细胞等炎性细胞浸润,间隔增宽,成纤维细胞增生,胶原纤维呈带状,肺泡腔变窄,肺组织中可见散在的体积缩小变圆、胞浆红染、胞核固缩兰染似凋亡的细胞,在病灶中心部位更多一些,但与坏死的细胞较难区别.212 TUNE L 检测模型组可见T UNE L 染色阳性的凋亡细胞多位于支气管粘膜上皮和肺泡上皮等,尤以病灶中心部位较多,虽然不能准确区分是哪种细胞凋亡,但凋亡细胞数目较对照组明显增多,26西北师范大学学报(自然科学版) 第37卷 Journal of N orthwest N ormal University (Natural Science ) V ol 137 存在显著性差异.对照组偶见T UNE L 染色阳性的凋亡细胞.结果见表1.表1 BLM 肺损伤大鼠肺组织的细胞凋亡( X ±s ,n =8)T able 1 Apoptosis in bleomycin 2induced lung injury in rats (mean ±s ,n =8)组别(group )T UNE L 阳性细胞数(T UNE L 2positive cells )(per mm 2)对照组(control ) 0180±0161模型组(bleomycin ) 7167±11973 3P <0105vs control 213 电镜观察对照组肺泡上皮细胞基膜结构完整,细胞间连接紧密,Ⅰ型肺泡上皮细胞扁平型,Ⅱ型肺泡上皮细胞镶嵌于Ⅰ型肺泡上皮细胞之间,游离面有稀疏而短粗的微绒毛,细胞器丰富,胞质内有多个同心圆状排列的电子密度较高的板层体,未见凋亡细胞.模型组多数上皮细胞间连接松散,上皮细胞基膜裸露、折叠、扭曲,Ⅱ型上皮细胞增生,成纤维细胞功能活跃,原胶原增多,并可见染色质边集沿核膜分布、核中央浅染、核周间隙增宽、细胞质浓缩、细胞器尚好的凋亡细胞及含有固缩核的Ⅱ型肺泡上皮凋亡细胞.214 IHC 观察对照组大鼠肺中bcl 22和bax 均有表达,二者都定位于细胞的胞浆,呈棕黄色,bcl 22在支气管粘膜上皮和肺泡上皮细胞表达阳性,bax 在支气管上皮细胞弱阳性表达.模型组肺损伤区细支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞bcl 22表达减弱,间质的细胞表达明显增强,尤以支气管周围为显著,bax 在肺损伤区支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞表达明显增强,在间质细胞表达增强(见表2).215 ISH 观察对照组大鼠肺组织中有bcl 22mRNA 表达,呈蓝紫色颗粒,定位于上皮细胞胞浆或细胞核膜.模型组肺损伤区bcl 22mRNA 表达减弱,尤以上皮细胞为显著,间质细胞表达增强(见表2).表2 BLM 肺损伤大鼠肺bax ,bcl 22蛋白及bcl 22mRNA 的表达T able 2 The expression of b ax ,bcl 22and bcl 22mRNA in bleomycin 2induced lung injury in rats组别(group )上皮细胞(epithelial cell )bax bcl 22bcl 22mRNA 间质细胞(mesenchymal cell )bax bcl 22bcl 22mRNA 对照组(control )-66--+模型组(bleomycin )6+++66 BLM 肺损伤大鼠肺组织的细胞凋亡观察图片附文后(图版I ).3 讨论细胞凋亡是一种广泛存在于多细胞生物体内,对不需要的细胞和受损伤的细胞发生的由众多基因参与调控的细胞自主的有序死亡过程,在组织损伤修复过程中,通过细胞凋亡机制不仅可以限制炎症反应的发展,而且可防止炎症后纤维增生和瘢痕形成.最近的研究表明[6],上皮细胞的过度凋亡,使之抑制成纤维细胞增殖的功能丧失而导致成纤维细胞过度增生,产生过多的胶原蛋白,从而发生器官纤维化.肺纤维化是以上皮细胞的丢失和成纤维36 2001年第2期 江 瑛等:博莱霉素肺损伤大鼠细胞凋亡及bcl 22/bax 基因的表达 2001 N o 12 Apoptosis and expression of bax and bcl 22mRNA in bleomycin 2induced lung injury in rats 细胞的增殖为特征的.BLM 是从轮生链霉培养液中提取的含多种糖肽抗生素的水溶性混合物,属于细胞周期非特异性抗肿瘤药物,临床多用于治疗鳞癌、睾丸癌及淋巴瘤等恶性肿瘤.其主要的副作用是肺毒性,引起肺泡炎,并很快进展为肺纤维化.BLM 诱导的鼠肺纤维化模型病变特点类似于人类的弥漫性肺间质纤维化,成为国际上研究间质性肺病普遍采用的方法之一.BLM 引起肺纤维化的机制尚不完全清楚,在体研究表明[7],BLM 诱导的小鼠急性肺损伤是通过氧自由基的作用导致细胞DNA 单链断裂,阻止DNA 复制,干扰细胞分裂繁殖而发挥作用.文献报道[4],BLM 通过诱导细胞凋亡而致急性肺损伤,BLM 导致迅速而广泛的肺DNA 损伤及上皮细胞的凋亡与肺纤维化发生密切相关.透射电镜检查是目前鉴定细胞凋亡最具特征性的手段,T UNE L 检测法是细胞凋亡最敏感的方法之一.T UNE L 的原理是将带有标记的DNA 填补到凋亡细胞的断裂DNA 缺口,再通过一系列免疫反应显示出来.本实验结果发现,注入BLM 后14d 在电镜下看到凋亡的上皮细胞,T UNE L 染色阳性细胞在病变区明显增多,与Hagim oto 等[8]的结果类似.这提示细胞凋亡在BLM 诱导的大鼠肺纤维化过程中起着重要作用.细胞凋亡调控机制及信号传递系统的研究发现,多种基因及其表达产物如bcl 22,P53,c 2myc ,bax ,bad 等参与细胞凋亡的调控,其中bcl 22基因家族是凋亡研究中最受重视的基因之一,bcl 22被认为是细胞凋亡调控的最后通路之一.bcl 22属于跨膜蛋白,主要分布于核膜、线粒体膜和内质网膜上,bcl 22在生命旺盛的组织和细胞中表达明显[3].bcl 22高表达的细胞能耐受多种细胞毒性因子的杀伤作用,使细胞凋亡明显延迟、减少,而且在毒性因子去除后可使细胞迅速恢复增生.bcl 22编码的产物bcl 22蛋白可通过拮抗野生型P53蛋白的促凋亡作用,将c 2myc 蛋白由促凋亡逆转为抑制凋亡,稳定线粒体的结构和功能及阻断Caspase 酶类活化的上游信号传递通路等作用抑制多种因素诱发的细胞凋亡[6],一般认为bcl 22通过控制细胞核内外物质的运输和抑制Ca 2+的释放或阻断细胞内过氧化物的堆积而发挥抗凋亡作用[9].bcl 22家族有bcl 2x ,bax ,bak ,bad 等成员,其中bax 基因与bcl 22基因一样在组织广泛表达,其生物学作用是拮抗bcl 22,抑制bcl 22的抗凋亡作用.bax 与bcl 22在细胞中的比例决定细胞是否发生凋亡.bax 过量时,形成bax 2bax 同二聚体,诱导细胞凋亡;bcl 22过量时,形成bcl 222bax 异二聚体,抑制细胞凋亡.bax 蛋白作为P53的下游应答蛋白,与bcl 22,P53共同参与并调节细胞凋亡[10].bax 增高,促进细胞凋亡,但bax 单独不足以启动凋亡途径;bcl 22增高,抑制细胞凋亡.本实验结果表明,对照组大鼠肺组织中bcl 22和bax 均有表达,二者在同一细胞中的表达程度可能决定该细胞的生死存亡.BLM 导致大鼠肺损伤模型组与对照组比较,肺组织上皮细胞bcl 22蛋白及其mRNA 的表达明显降低,bax 蛋白的表达显著增强,肺间质细胞中bcl 22蛋白和mRNA 表达显著增强,提示在肺损伤时,肺泡上皮细胞的凋亡可能与bax 水平的上调、bcl 22水平的下调致使肺泡上皮细胞bcl 22/bax 比值降低有关.bcl 22蛋白与bcl 22mRNA 表达结果一致,表明bcl 22对BLM 肺损伤上皮细胞凋亡的调控至少是在基因转录或翻译水平进行的.而间质细胞bcl 22水平的上调,可能与间质成纤维细胞的凋亡缺乏有关,致使成纤维细胞的增殖大于凋亡,从而有助于肺纤维化的发展.推测BLM 诱导肺上皮细胞的凋亡可能与bcl 22的失活导致线粒体内死亡基因白细胞介素1β转化酶活化而发生凋亡有关.46西北师范大学学报(自然科学版) 第37卷 Journal of N orthwest N ormal University (Natural Science ) V ol 137 1模型组大鼠肺泡腔变窄,间质巨噬细胞、淋巴细胞等炎细胞浸润,成纤维细胞增生,胶原沉积(HE ×100);2模型组大鼠支气管上皮细胞、肺胞上皮细胞T UNE L 染色阳性(T UNE L ×400);3模型组大鼠肺泡上皮细胞凋亡,体积缩小,核内染色质边集,核周隙增宽(TE M ×10000);4模型组大鼠肺bax 的表达,支气管上皮细胞(6)(IHC ×400);5模型组大鼠bcl 22的表达,间质细胞(6),肺泡上皮细胞(+)(IHC ×100);6模型组大鼠肺bcl 22mRNA 的表达,间质细胞(6),肺泡上皮细胞(+)(ISH ×400)图版I BLM 肺损伤大鼠肺组织的细胞凋亡观察图片(限于篇幅,未示出对照组图片)56 2001年第2期 江 瑛等:博莱霉素肺损伤大鼠细胞凋亡及bcl 22/bax 基因的表达 2001 N o 12 Apoptosis and expression of bax and bcl 22mRNA in bleomycin 2induced lung injury in rats 参考文献:[1] P olunovskey V A ,Chen B ,Henke C ,et al.R ole of mesenchymal cell death in lung rem odeling after injury[J ].J Clin Invest ,1993,92:388—397.[2] Ogasawar A J ,Watanabe 2Fukunaga R ,Adachi M.Lethal effect of the anti 2fas antibody in mice [J ].Nature ,1998,364:806—809.[3] Jacobs 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staining ,electron microscopy ,terminal deoxynucleotigyl trans ferase 2mediated dUTP nick labeling (T UNE L ),immunohistochemisty (IHC )and in situ hybridization (ISH )methods were used.The results show that a single instillation of bleomycin leads to the appearance of apoptosis in bronchial and alveolar epithelia cells.The expression of bcl 22and bcl 22mRNA were downregulated and the expression of bax was upregulated in the alveolar epithelia cells.Those proves that the bcl 22/bax system may play a role in the apoptosis of bronchial and alveolar epithelia cells in this dis order.K ey w ords :lung injury ;bleomycin ;apoptosis ;bax ;bcl 22;bcl 22mRNA(责任编辑 孙晓玲) 66西北师范大学学报(自然科学版) 第37卷 Journal of N orthwest N ormal University (Natural Science ) V ol 137 。
小鼠B细胞淋巴瘤因子2 (Bcl-2)酶联免疫吸附测定试剂盒使用说明书产品编号：E-EL-M0175（本试剂盒仅供体外研究使用、不用于临床诊断!）声明：尊敬的客户，感谢您选用本公司的产品。
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用酶标仪在450nm波长处测OD值，Bcl-2浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线求出标本中Bc l-2的浓度。
标本收集:1.血清：全血标本于室温放置2小时或4℃过夜后于1000×g离心20分钟，取上清即可检测，收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。
2.血浆：抗凝剂推荐使用EDTA.Na2，标本采集后30分钟内于1000×g离心15分钟，取上清即可检测。
避免使用溶血，高血脂标本。
3.组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，以去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。
将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样本对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。
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1、加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。
在酶标包被板上标准品准确加样50µl，待测样品孔中先加样品稀释液40µl，然后再加待测样品10µl （样品最终稀释度为5倍）。
加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
2、温育：用封板膜封板后置 37℃温育30分钟。
3、配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用
4、洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此
重复5次，拍干。
5、加酶：每孔加入酶标试剂50µl，空白孔除外。
6、显色：每孔先加入显色剂A50µl，再加入显色剂B50µl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色
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7、终止：每孔加终止液50µl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。
8、测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。
测定应在加终止液后15分钟以内进行。
REV20190716仅供研究，不用于临床诊断。
客服热线: 400-7060-959﹡技术支持邮箱: **************公司官网: 目录简介 ......................................................................................................................................................................... - 3 -检测原理 ................................................................................................................................................................. - 3 -试剂盒组分 ............................................................................................................................................................. - 4 -储存条件 ................................................................................................................................................................. - 5 -其他实验材料 ......................................................................................................................................................... - 5 -注意事项 ................................................................................................................................................................. - 5 -样本收集处理及保存方法 ..................................................................................................................................... - 6 -试剂准备 ................................................................................................................................................................. - 6 -操作步骤 ................................................................................................................................................................. - 8 -操作流程图 ............................................................................................................................................................. - 8 -操作要点提示 ......................................................................................................................................................... - 9 -结果判断 ................................................................................................................................................................. - 9 -结果重复性 ........................................................................................................................................................... - 10 -灵敏度 ................................................................................................................................................................... - 10 -特异性 ................................................................................................................................................................... - 10 -参考文献 ............................................................................................................................................................... - 10 -该产品由北京四正柏生物科技有限公司研制。
淋巴瘤免疫组化特征说实话淋巴瘤免疫组化特征这个东西，特征挺有意思的。
让我想想这个特征，哎呀，有点复杂，不过我可以慢慢讲。
先说说CD20这个指标吧，这在很多B细胞淋巴瘤里是很关键的一个点。
就好像是B细胞淋巴瘤大军身上一个独特的标记，好多时候看到这个CD20阳性，心里就有个大概的想法，觉得可能是B细胞来源的淋巴瘤。
不过这里面也有坑，有次我就看错了，把一个弱阳性的当成强阳性来判断类型了，后来经过反复对比才发现错误。
这就像是在一群穿相似衣服的人中，你一开始以为那个衣服颜色深的是某个队伍里的，结果仔细一看只是颜色有点接近但没那么深。
还有CD3，这个经常和CD20对比着看呢。
CD3呢，就是T细胞淋巴瘤那里要重点关注的一个指标，就像T细胞这个小群体手里拿着的特殊旗帜一样。
如果在免疫组化片子里看到CD3阳性细胞多，那得好好考虑下是不是T细胞淋巴瘤。
但这里也不是绝对的呀，有的时候肿瘤细胞比较狡猾，它会表达一些少见的表型，让人一时摸不着头脑。
Ki - 67这个也是不得不提的。
这个指标就像一个生活中的速度计一样，可以告诉我们细胞增殖的速度大概有多快。
如果Ki - 67的阳性率很高，那就说明这个淋巴瘤细胞就像疯了一样在拼命繁殖，情况可能就不太乐观。
像我之前看到的一个病例，Ki - 67达到百分之八九十，当时就特别惊讶，这细胞分裂得也太快了，就像一群失控的小机器人一直在复制自己。
再说说CD10，在有些淋巴瘤类型里，它就像一把特定的钥匙。
比如在滤泡性淋巴瘤等一些情况中，如果CD10阳性，就像给这个淋巴瘤又找到一个佐证它身份的东西。
不过不同地区的检测方法或者判断标准可能有一点差别，这也是我的一个困惑。
我有次参加一个交流活动，发现其他地方对于CD10微弱阳性的判断和我们这里有点不同，这就很让人头疼，就像你们家的秤和别人家的秤不太一样，量出来的值都需要重新考虑。
然后还有Bcl - 2，它在判断淋巴瘤的过程中也起着重要的作用。
这个呢，有点像细胞的一个小保护壳，如果Bcl - 2阳性，说明这个细胞在某些方面就像给自己加了个保护罩，它更不容易凋亡。
人B细胞淋巴瘤因子2（Bcl-2）ELISA检测试剂盒,ELISA试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用标本：血清或血浆上海乔羽生物专业供应：使用目的：本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本B细胞淋巴瘤因子2（Bcl-2）含量。
试验原理：Bcl-2试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）.已知Bcl-2浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。
先将Bcl-2和生物素标记的抗体同时温育。
洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。
再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。
产生颜色。
颜色的深浅和样品中Bcl-2的浓度呈比例关系。
试剂盒内容及其配制试剂盒成份（2-8℃保存）96孔配置48孔配置配制96/48人份酶标板1块板（96T）半块板（48T）即用型塑料膜板盖1块半块即用型标准品：80ng/ml 1瓶（0.6ml）1瓶（0.3ml）按说明书进行稀稀空白对照1瓶（1.0ml）1瓶（0.5ml）即用型标准品稀释缓冲液1瓶（5ml）1瓶（2.5ml）即用型生物素标记的抗Bcl-2抗体1瓶（6ml）1瓶（3.0ml）即用型亲和链酶素-HRP 1瓶（10ml）1瓶（5.0ml）即用型洗涤缓冲液1瓶（20ml）1瓶（10ml）按说明书进行稀释底物A 1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）即用型底物B 1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）即用型终止液1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）即用型标本稀释液1瓶（12ml）1瓶（6.0ml）即用型自备材料1．蒸馏水。
2．加样器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。
3．振荡器及磁力搅拌器等。
安全性1．避免直接接触终止液和底物A、B。
一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。
2．实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。
3．不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。
操作注意事项1．试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。
稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。
2．实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。
3．不用的其它试剂应包装好或盖好。
不同批号的试剂不要混用。
保质前使用。
4．使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。
5．使用干净的塑料容器配置洗涤液。
使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。
6．洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。
7．底物A应挥发，避免长时间打开盖子。
底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。
避免用手接触，有毒。
实验完成后应立即读取OD值。
8．加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。
9．按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。
样品收集、处理及保存方法1、血清－－－－-操作过程中避免任何细胞刺激。
使用不含热原和内毒素的试管。
收集血液后，1000×g离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2、血浆－－－－-EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。
1000×g离心30分钟去除颗粒。
3、细胞上清液－－-1000×g离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4、组织匀浆－－－－-将组织加入适量生理盐水捣碎。
1000×g离心10分钟，取上清液5、保存－－－－－－如果样品不立即使用，应将其分成小部分-70 ℃保存，避免反复冷冻。
尽可能的不要使用溶血或高血脂血。
如果血清中大量颗粒，检测前先离心或过滤。
不要在37℃或更高的温度加热解冻。
应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
试剂的准备1．标准品：标准品的系列稀释应在实验时准备，不能储存。
稀释前将标准品振荡混匀。
稀释比例按下表中进行：80 ng/ml （6号标准原倍浓度不用稀释直接加入50ul。
品）40 ng/ml （5号标准100ul的原倍标准品加入100ul的标准品稀释液品）20 ng/ml （4号标准100ul的5号标准品加入100ul的标准品稀释液品）10 ng/ml （3号标准100ul的4号标准品加入100ul的标准品稀释液品）5.0 ng/ml （2号标准100ul的3号标准品加入100ul的标准品稀释液品）2.5 ng/ml （1号标准100ul的2号标准品加入100ul的标准品稀释液品）0 ng/ml （空白对照）原始浓度不用稀释直接加入50ul。
2．洗涤缓冲液（50×）的稀释：蒸馏水50倍稀释。
操作步骤1．使用前，将所有试剂充分混匀。
不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。
2．根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。
每个标准品和空白孔建议做复孔。
每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。
标本用标本稀释液1：1稀释后加入50ul于反应孔内。
3．加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。
立即加入50ul的生物素标记的抗体。
盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育1小时。
4．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。
重复此操作3次。
如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
5．每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。
6．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。
重复此操作3次。
如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
7．每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育10分钟。
避免光照。
8．取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。
9．在450nm波长处测定各孔的OD值。
建议使用的实验方案标准品浓度（ng/ml）A 80 80 样品样品样品样品样品样品样品样品样品样品B 40 40 样品样品样品样品样品样品样品样品样品样品C 20 20 样品样品样品样品样品样品样品样品样品样品D 10 10 样品样品样品样品样品样品样品样品样品样品E 5.0 5.0 样品样品样品样品样品样品样品样品样品样品F 2.5 2.5 样品样品样品样品样品样品样品样品样品样品G 0 0 样品样品样品样品样品样品样品样品样品样品H 样品样品样品样品样品样品样品样品样品样品样品样品局限6号标准品以上的结果为非线性的，根据此标准曲线无法得到精确的结果。
B细胞淋巴瘤因子2（Bcl-2）ELISA试剂盒性能1. 灵敏度：最小的检测浓度小于1号标准品。
稀释度的线性。
样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.990。
2. 特异性：不与其它细胞因子反应。
3. 重复性：板内、板间变异系数均小于10%。
结果判断与分析1、仪器值：于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值2、以吸光度OD值为纵坐标（Y），相应的Bcl-2标准品浓度为横坐标（X），做得相应的曲线，样品的Bcl-2含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度。
3、检测值范围：0-80ng/ml4、敏感度：0.1 ng/ml上海乔羽生物专业生产供应的试剂盒类产品有：双抗夹心ELISA检测、ELISA试剂盒、人ELISA试剂盒、酶联检测试剂盒、国产进口试剂、代测elisa试剂盒、ELISA检测试剂盒、大鼠ELISA试剂盒、小鼠ELISA试剂盒、凋亡相关因子试剂盒、白介素ELISA试剂盒、VIP ELISA kit等实验室产品，产品品质，质量保证。
The performance of kit:1 sensitivity: minimum detection concentration is less than 1 standard. Linearity of dilution. Sample linear regression and the expected concentration correlation coefficient R value is 0.990.2: no specific reaction with other cytokines.3 repeatability: plate, plate between the coefficients of variation were less than 10%.Human type III procollagen amino terminal peptide ELISA kit steps:1 before use, all reagents and mixing. Do not allow liquid to produce a large number of bubbles, so as to avoid adding a large number of bubbles, resulting in the addition of the error.2 according to determine the number of sample number plus standard strip number. Each standard and blank hole is recommended to do the hole. Each sample can be made according to its own quantity, and can be used as a hole in the hole.3 diluted after standard 50ul in reaction hole, added to the sample 50 UL in reaction hole to be measured. Immediately joined the 50 UL antibody biotin. Cover the membrane plate, gently oscillating mixing, 37 degrees Celsius for 45 minutes.4 left hole liquid, each hole filled with washing liquid, oscillating 30 seconds off the washing liquid, pat dry with absorbent paper. Repeat this operation 4 times. If the washing machine with washing, washing times increased once.5 per hole adding chain affinity enzyme -HRP 100ul, gently oscillating mixing, 37 degrees 30 minutes incubation.6 left hole liquid, each hole filled with washing liquid, oscillating 30 seconds off the washing liquid, pat dry with absorbent paper. Repeat this operation 4 times. If the washing machine with washing, washing times increased once.7 per hole adding substrate A, B 50ul, gently oscillating mixing, 37 degrees 5 minutes incubation. Avoid light.8 remove ELISA plate, quickly add 50ul terminated liquid, adding the stop solution immediately after the determination results.9 od determination of each hole at the wavelength of 450nm.The result of judgment and analysis:1, instrument value: Yu Bo 450nm ELISA od read the hole on the instrument2, to the OD value as a vertical coordinate (y), corresponding ot standard concentrations as a horizontal coordinate (x), do have corresponding curve, sample ot content can be according to the OD value by standard curve conversion out corresponding concentration, multiplied by the dilution multiple; or with the standard concentration and the OD value calculated the regression equation of the standard curve, the sample OD value in the equation to calculate the sample concentration, multiplied by the dilution factor is the actual concentration of the sample.3, detection range: 0-100ng/ml4, sensitivity: 0.39ng/ml。
