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Protein At Beads 4FF

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1/5常州天地人和生物科技有限公司ProteinAtBeads4FF

目录

1.产品介绍…………………………………………………………………………..1

2.纯化流程………………………………………………………………..………...3

3.残留配体的去除………………………………………………………...………4

4.填料清洗……………………………………………………………………..…...4

5.问题及解决方案………………………………………………………..……….4

6.订购信息及相关产品………………………………………………..…………5

1.产品介绍

ProteinAtBeads4FF是用于分离和纯化单克隆抗体、多克隆抗体或Fc-融合蛋白的亲和

层析介质，具体性能见表1。ProteinA是一种分离自金黄色葡萄球菌的细胞壁蛋白，主要

通过Fc片段结合哺乳动物IgG。ProteinAtBeads4FF的配体蛋白ProteinAt是在天然

蛋白A的基础上进行生物工程突变得到的一种耐碱蛋白A(Alkalinetolerate，故缩写为At)。

该产品以0.1MNaOH进行200次在位清洗，介质载量几乎不变，以0.5MNaOH进行

100次在位清洗，载量仍可达到最初载量的80%，更加方便客户尤其是工业客户的清洗操

作，具体性能见图1。该产品采用较稳定的定向偶联，脱落量低（小于10ng/mgIgG,见图

2）。

ProteinAtBeads4FF是以高度交联的4%琼脂糖凝胶为基质，可以在相对较高的流速下

进行单克隆抗体和多克隆抗体的纯化，其耐压性能见图3，因此ProteinAtBeads4FF适

用于工业化抗体的大规模生产。表1.ProteinAtBeads4FF产品性能项目性能

介质高度交联的4%琼脂糖

平均粒径～90μm

配体耐碱性ProteinA

结合载量>40mg人lgG/ml介质

化学稳定性可耐受抗体纯化过程中的所有试剂

工作pH3-12

在线清洗0.1-0.5MNaOH

线性流速50-300cm/h

保存含20%乙醇的1XPBS，2℃-8℃

2/5

常州天地人和生物科技有限公司图1.ProteinAtBeads4FF的CIP清洗

图2.CIP清洗后ProteinAt脱落量

图3.介质的压力/流速曲线（层析柱BPG300,柱高

20cm）

0.000.050.100.150.200.250.30200300400500600700800

Velocity(cm/h)

Pressure(MPa)

3/5常州天地人和生物科技有限公司2.纯化流程

2.1缓冲液的准备

所用水和缓冲液在使用之前建议用0.22μm或0.45μm滤膜过滤。

平衡/洗杂液：0.15MNaCl、20mMNa2HPO4，pH7.0

洗脱液：0.1M甘氨酸，pH3.0

中和液：1MTris-HCl，pH8.5。

2.2样品准备

上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和pH值，可以用平衡/洗杂液对血清样品、腹

水或细胞培养液稀释，或者样品用平衡/洗杂液透析。

样品在上样前建议离心或用0.22μm或0.45μm滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率

和防止堵塞柱子。

2.3ProteinAtBeads4FF装填

ProteinAtBeads4FF被广泛应用于工业纯化，因此，涉及到各种中压色谱层析柱的填装，

下面介绍使用ProteinAtBeads4FF填装层析柱的方法。

层析柱的装填（使用储液器装填）

1)用去离子水冲洗层析柱底筛板与接头，确保柱底筛板上无气泡，关闭柱底出口，并在柱

底部留出1-2cm的去离子水。

2)将树脂悬浮起来，小心的将浆液连续地倒入层析柱中。用玻璃棒沿着柱壁倒入浆液可减少

气泡的产生。

3)如果使用储液器，应立即在层析柱和储液器中加满水，将进样分配器放置于浆液表面，

连接至泵上，避免在分配器或进样管中产生气泡。

4)打开层析柱底部出口，开启泵，使其在设定的流速下进行。最初应让缓冲液缓慢流过层析

柱，然后缓慢增加至最终流速，这样可避免液压对所形成柱床的冲击，也可避免柱床形成

的不均匀。如果达不到推荐的压力或流速，可以用你所使用泵的最大流速，这样也可以得

到一个很好的装填效果。（注意：在随后的色谱程序中，不要超过最大装柱流速的75%）

当柱床高度稳定后，在最后的装柱流速下至少再上3倍柱床体积的去离子水。标上柱床

高度。

5)关闭泵，关闭层析柱出口。

6)如果使用储液器，去除储液器，将分配器置于层析柱中。

7)将分配器推向柱子至标记的柱床高度处。允许装柱液进入分配器，锁紧分配器接头。

8)将装填好的层析柱连接至泵或色谱系统中，开始平衡。如果需要可以重新调整分配器。

2.4样品纯化

ProteinAtBeads4FF装填好后，可以用各种常规的中低压色谱系统。

1)将泵管道中注满去离子水。去掉上塞子，将层析柱连接至色谱系统中，打开下出口，将预

4/5常州天地人和生物科技有限公司装柱接到色谱系统中，并旋紧。

2)用3-5倍柱体积的去离子水冲洗出储存缓冲液。

3)使用至少5倍柱床体积的平衡液平衡色谱柱。

4)利用泵或样品环上样。注:样品的粘度增加使得即使上样体积很少，也会导致层析柱很大

的反压。上样量不要超过柱子的结合能力。大量的样品体积也可能造成很大的反压，使得

进样器更难使用。

5)用洗杂液冲洗柱子，直到紫外吸收达到一个稳定的基线（一般至少10-15个柱体积）。

6)使用5-10倍柱体积的洗脱液洗脱，收集洗脱液，即目的蛋白组分。洗脱组分需要立即调

成中性，一般建议使用洗脱组分体积1/10的中和液进行中和。

注：首次使用时，可先按照4填料清洗中CIP清洗一遍，避免脱落的配体残留。

2.4SDS-PAGE检测

将使用纯化产品得到的样品（包括流出组分、洗杂组分和洗脱组分）以及原始样品使用

SDS-PAGE检测纯化效果。

3.残留配体去除

ProteinAtBeads4FF配体的脱落很低，小于10ng/mg抗体。但是很多产品需要完全去

除，可采用阳离子交换、阴离子交换或凝胶过滤等方法去除，具体参照阳离子交换树脂、阴

离子交换树脂和凝胶过滤树脂的使用。

4.填料清洗

ProteinAtBeads4FF可以重复使用而无需再生，但随着一些变性物质的沉淀和蛋白的聚

集，往往造成流速和结合载量都下降，严重影响柱子的性能，这时需要对树脂进行清洗。

CIP清洗

ProteinAtBeads4FF是一种耐碱亲和介质，可以耐受0.1M-0.5MNaOH溶液的清洗，

成本低，效果好，具体操作：

3倍柱体积的平衡液；

至少2倍柱体的0.1–0.5MNaOH，接触时间为15minutes；

5倍柱体积的平衡液冲洗。

注：因0.1–0.5MNaOH粘度大易造成压力增加，可进行反向冲洗。5.问题及解决方案

问题原因分析推荐解决方案柱子反压过高筛板被堵塞清洗或更换筛板填料被堵塞按照第4部分进行树脂CIP清洗裂解液中含有微小的固体颗粒，建议上柱前使用滤膜(0.22或0.45μm)过滤，或者离心去除。

样品纯化过程中曲线不稳样品或缓冲液中有气泡去除样品或柱子中的气泡

5/5常州天地人和生物科技有限公司样品和缓冲液进行脱气洗脱组分中没有目的蛋白样品中抗体浓度太低使用其抗原做配体的介质抗体被降解适当的提高洗脱pH回收率逐渐减低上样量太多减少上样量柱子太脏，载量降低按照第4部分进行树脂CIP清洗

5.订购信息及相关产品产品名称货号规格ProteinAtBeads4FFSA02301010mLSA02302525mLSA023100100mLSA023500500mLSA023C1LMabCapAt4FFSA023C111X1mLSA023C515X1mLSA023C151X5mLSA023C555X5mLSA023CS3X1mL+1X5mL

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免疫共沉淀Co-IP的实验优化

免疫共沉淀Co-IP的实验优化

免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation，Co-IP）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的，用于研究蛋白质间相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如下图所示，如果用蛋白质A的抗体免疫沉淀A，那么与A在体内结合的蛋白质B也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

爱必信生物爆款热卖产品abs955免疫(共)沉淀(IP/CoIP)试剂盒，超高性价比，一站式助力您的IP/CoIP实验！

免疫共沉淀的操作方法本身较为简单，我们abs955 IP/CoIP试剂盒说明书对操作流程有完整说明，但为了获得更好的实验结果，相关的实验步骤需要根据实际情况进行优化。

1）裂解和洗涤缓冲液

裂解和洗涤缓冲液是维持复合物形成的关键因素。我们试剂盒配备的Lysis buffer使用优化的非变性裂解缓冲液，许多蛋白间的相互作用将保持完整。一般认为含有非离子型洗涤剂的低离子强度缓冲液（即<120mM NaCl）不太可能破坏蛋白间的相互作用。另外应避免在洗涤期间用超声或涡旋处理的方法裂解细胞、裂解物或珠子结合的免疫复合物，以防止破坏复合物间的相互作用。离心过程中应轻柔处理样品以确保减少复合物的损失。

2）固相支持物beads的选择

用于免疫共沉淀的固相支持物一般有琼脂糖珠和磁珠两种。琼脂糖珠由于其多孔表面、通常具有更高的结合能力，而磁珠在有条件的实验室操作相对更简便。我们的试剂盒配备优质Protein A/G 琼脂糖珠，有效性经开发试验充分验证。

3）非特异性作用的高背景

由于细胞裂解物中存在大量蛋白质，因此在操作过程中可能会发生与目标复合物的非特异性结合。这些非特异性相互作用一般通过彻底清洗珠子结合的免疫复合物来打破，但也可以应用其他策略来优化非特异性结合，例如：

免疫沉淀SOP

免疫沉淀SOP

免疫沉淀（Immunoprecipitation）SOP

免疫沉淀技术通常是用于初步鉴定新蛋白抗原的方法之一。免疫沉淀、SDS-PAGE和免疫印迹结合，可以测量蛋白的相对分子量，观察蛋白质之间的相互作用，检测其翻译后修饰的调控，或确定蛋白质降解的速率。此方法是收集有关新抗原，为进一步分析其特性应用最为广泛的方法之一。

一、实验流程（以七鳃鳗血清为例）

1.将七鳃鳗血清放在冰水中融化

注：①在整个操作过程中，应尽量保证在冰水或4℃中进行。

②血清融化后，将血清10000 r/min，10min离心，因为血清中可能存在胶原蛋白，这样处理过以后，取上清以排除后续实验受到胶原蛋白的干扰。

2.取少量血清以备Western blot分析，剩余血清取出一部分与抗体混匀，并在4℃旋转混合孵育，2h～过夜（同时应该以同样条件设计一组空白对照和无关抗体的对照）。

注：①凭个人经验一般是5μl左右的血清混入10μg左右的抗体，这个比例是可以将血清中相应蛋白沉淀下来。当然，当遇到不同蛋白时还应当根据当时的情况具体分析。

②有时候血清与抗体混合时，要加入一定比例的PBS来补充到一定的体系，所以在设置空白和无关抗体对照时，也应以加入相同比例的PBS，这样可以保持整个反应体系的一致性，以便于最终上样也保持一致。

③在设置无关抗体对照时，还应当保证抗体来源种属的一致，即如果你选择的特异性抗体为兔源的，那你无关抗体最好选用未免疫兔子的血清纯化的抗体。

3.在血清抗体混合液中加入proteinA/G agaroge beads， 4℃旋转混合孵育，4h～过夜。

注：①凭个人经验，按照上面的体系，加15μl-20μl beads珠即可。理论上1ml proteinA/G

agaroge beads可以结合大于18mg的人IgG。即，按照上面的体系加1μl就行了，可是这在操作上是不便于进行的。那20μl的beads有多少呢？如图，箭头所指的位置就应该是20μl的beads大致的沉淀位置。

His-Tag蛋白纯化磁珠(Beads His-tag Protein Purification)

His-Tag蛋白纯化磁珠(Beads His-tag Protein Purification)

北京索莱宝科技有限公司

第1页，共6

页His-Tag蛋白纯化磁珠（BeadsHis-tagProteinPurification）规格：5mL/2×50mL保存：2-8℃，保质期2年产品内容：组氨酸标签蛋白纯化磁珠具有超顺磁性，专为高效、快速纯化组氨酸标签蛋白而设计的一种新型功能化材料。可通过磁性分离方式直接从生物样品中一步纯化出高纯度的目标蛋白，极大地简化纯化工艺和提高纯化效率，适合科研和工业领域便捷地进行组氨酸标签蛋白纯化。与传统层析方式使用的金属螯合琼脂糖预装柱相比，采用磁珠纯化组氨酸标签蛋白，无需对样品进行多次长时间的高速离心和滤膜过滤、无需控制流速、更无需高昂的层析设备。样品与磁珠的特异性结合、洗涤以及目标蛋白的洗脱变得简单、快速、易操作。对于熟练的操作者而言，在1h内就能获得高纯度的目标蛋白，且能轻松实现高通量和大规模样品的平行处理，为研究者节省了时间和成本。本产品系列包括镍离子（Nickel）、钴离子（Cobalt）两种金属离子螯合磁珠，它们在目标蛋白结合量和非特异性吸附等性能上有所区别，用户可根据目标蛋白与不同种类金属的结合性能，以及对目标蛋白的产量和纯度的要求，选择不同种类的金属离子螯合磁珠。产品特性：产品名称BeadsIDA-Nickel镍离子螯合磁珠BeadsIDA-Cobalt钴离子螯合磁珠磁珠粒径范围30~150µm螯合金属离子Ni2+Co2+金属离子密度30~50µmol/mL磁珠蛋白结合量30~40mg/mL（100%磁珠）20~30mg/mL（100%磁珠）工作温度2~30℃悬液浓度10%（v/v）磁珠悬液保存液20%（v/v）乙醇注意：1、磁珠蛋白结合量与目标蛋白特性有关，此处仅做参考值2、1mL磁珠悬液中包含100µL磁珠3、磁珠溶剂耐受性请参考附录信息北京索莱宝科技有限公司

第2页，共6页适用范围：适用于纯化细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞等分泌或胞内表达的可溶性组氨酸标签蛋白，也可用于变性蛋白的纯化（包涵体需变性后再进行纯化）。操作步骤：1、缓冲液的准备目标蛋白与组氨酸标签蛋白纯化磁珠的结合性能将直接影响目标蛋白的纯化效率，而各种缓冲液配制也将在一定程度上影响目标蛋白的回收率和纯度。因此，在较大规模蛋白纯化之前，用户应该自行设计实验，筛选出适合纯化目标蛋白的缓冲液体系，主要包括BindingBuffer、WashingBuffer、ElutionBuffer。增加咪唑浓度进行洗脱是组氨酸标签纯化磁珠最常用的洗脱方法，首次使用时，在不确定最佳的洗脱咪唑浓度情况下，推荐在缓冲液中分别加入10mM、20mM、50mM、100mM、200mM、300mM、400mM、500mM咪唑，浓度从低到高分别洗脱，磁吸后收集蛋白上清液，之后通过SDS-PAGE电泳等方法鉴定洗脱结果。以下提供的缓冲液体系适用于多数组氨酸标签蛋白的纯化，供用户参考。BindingBuffer：20mMPhosphateBuffer，500mMNaCl，5~50mMImidazole，pH7.4WashingBuffer：20mMPhosphateBuffer，500mMNaCl，50~100mMImidazole，pH7.4ElutionBuffer：20mMPhosphateBuffer，500mMNaCl，500mMImidazole，pH7.42、样本处理（1）大肠杆菌、酵母等细胞内表达蛋白：表达细胞用适量的BindingBuffer稀释，加入蛋白酶抑制剂（如终浓度为1mM的PMSF），重悬细胞，冰浴超声裂解细胞，即为粗蛋白样品。如果样品过于粘稠，可根据需要在粗样品中加入适量核酸酶，冰浴30min，以降解核酸。另外，用户也可以根据实际需要对蛋白样品进行离心操作。（2）胞外表达蛋白：取胞外表达上清，用等量BindingBuffer稀释，即为粗蛋白样品。（3）动物细胞胞内表达蛋白：取适量动物细胞，先用适量PBS洗涤1次，弃上清；接着用适量含1%（v/v）TritonX-100或1%（v/v）NP-40的BindingBuffer重悬，加入蛋白酶抑制剂（如终浓度为1mM的PMSF），冰浴10min，即为粗蛋白样品。北京索莱宝科技有限公司

蛋白质纯化的原理和方法.

蛋白质纯化的原理和方法.

蛋白质纯化的原理和方法（Protein Purification Principles and Methods）

Proteins

•Complex, polymeric, asymmetric and sensitive molecules

•Contain covalent bound prosthetic groups and non-covalent bound cofactors •Many

non-covalent bounds e.g. Hydrogen-Bounds, Dipol-Interactions and Hydrophobic-Interactions

•“Weak” interactions are important for structure and function (activity) of the protein In

most cases the purification must be gentle!

Before the purification…

•Cultivation of bacteria

•Cell disruption: Periplasmic and cytoplasmic proteins are released

•Centrifugation leads to a soluble fraction(supernatant) which contains all soluble

periplasmic and cytoplasmic proteins and a membrane fraction from which membrane

bound proteins can be solubilised with detergents (e.g. Triton X-100)

•The soluble or membrane fraction are the start point of the further purification by