单分子荧光检测技术

单分子荧光检测技术涂熹娟B200425010【摘要】单分子检测技术有别与一般的常规检测技术，观测到的是单个分子的个体行为，而不是大量分子的综合平均效应。

近年来随着相关学科的技术进步，单分子研究已经在从分子生物学到细胞生物学等生命科学领域有了迅速的发展和应用。

本文简要介绍了单分子荧光检测技术的研究背景、意义、原理，以及该项技术进展和应用。

【关键词】单分子荧光寿命荧光偏振单分子FRET1. 单分子检测技术的意义和发展背景1.1单分子检测技术的意义在统计力学的各态遍历假设中，系综个体物理量轨迹的时间平均等于该物理量在给定时间的系综平均[1]。

在一个包含完全相同个体的系综，当测量时间足够长的时候，系综测量和单分子测量结果相同（例如对于稀溶液中小分子的核磁共振谱线的测定，由于测量时间远大于小分子的翻滚时间，这时体系就可以看成是一个均匀的体系，并看作静态）；但是即使在均相体系中，分子本身并不是处于静态，而是在不断地运动，测量的参数具有涨落现象，而测量时间可能会小于分子的涨落时间；另一种情况是在非均相体系中，个体轨迹平均本来就不等于系综平均（实际上几乎所有生物体系都不是均相体系）。

这以上考虑到的两点都导致系综测量结果和单分子测量结果不等。

一般系综测量结果表示的是大量由一种或多种对象组成的一个整体所表现出来的平均效应和平均值。

这一平均效应掩盖了许多特殊的信息。

而这些特殊的信息有时是非常重要的，尤其在研究具有非均匀特性的凝聚相物质和生物大分子结构时。

而相比之下，单分子检测就可做到对体系中单个分子的行为进行研究，可以得到在特定时刻，特定分子的特殊位置和行为，因为在某一时刻，集团中的任何成员只能处于一种状态。

将此再与时间相关，还可得到单个分子的行为的分布状况。

这样我们就可以同时得到所研究的对象的整体行为和个体行为了，然后将数据综合处理，得到更为全面的信息。

1.2单分子检测技术的意义和发展背景既然单分子检测技术有这么多的好处，为什么直到近年来才逐渐发展起来呢？这与光学系统的进展有很大的关系。

其实人类很早以前就有探索微观世界奥秘的要求，但是苦于没有理想的工具和手段。

直到世界上第一台可以被称为显微镜的仪器在1675年由荷兰生物学家列文虎克制作出来。

在以后的几百年，人们一直用光学显微镜观察微观和探索眼睛看不到的世界，但是光具有波动性使光学显微镜的分辨率只能达到光波的半波长左右，人类的探索因此受到了限制。

即使消除掉透镜形状的缺陷，任何光学仪器仍然无法完美的成像。

人们花了很长时间才发现，光在通过显微镜的时候要发生衍射，即物体上的一个点在成像的时候不会是一个点，而是一个衍射光斑。

如果两个衍射光斑靠得太近，你就没法把它们分辨开来。

显微镜的放大倍数再高也无济于事。

对于使用可见光作为光源的显微镜，它的分辨率极限是0.2微米。

任何小于0.2微米的结构都没法识别出来。

提高显微镜分辨率的途径之一就是设法减小光的波长，或者，用电子束来代替光。

根据德布罗意的物质波理论，运动的电子具有波动性，而且速度越快，它的“波长”就越短。

如果能把电子的速度加到足够高，并且汇聚它，就有可能用来放大物体。

进人20世纪，光电子技术得到了长足的发展，1938年，德国工程师Max Knoll和Ernst Ruska制造出了世界上第一台透射电子显微镜（TEM）。

几十年来，又有许多新型的显微镜问世，1952年，英国工程师Charles Oatley制造出了第一台扫描电子显微镜（SEM）。

电子显微镜是20世纪最重要的发明之一。

由于电子的速度可以加到很高，电子显微镜的分辨率可以达到纳米级（10-9m）。

很多在可见光下看不见的物体——例如病毒——在电子显微镜下现出了原形。

用电子代替光，这或许已经是一个反常规的主意，但是还有更令人吃惊的：1983年，IBM公司苏黎世实验室的两位科学家Gerd Binnig和Heinrich Rohrer发明了所谓的扫描隧道显微镜（STM）。

这种显微镜比电子显微镜更激进，它完全失去了传统显微镜的概念。

正是近年来这些在光谱学和光学显微镜方面的进展，使得在表面和溶液中检测和成像单分子成为了可能，而且可以对单分子的光谱性质进行检测并实时监控其动态过程。

使得我们终于可以看清单个分子与时间相关的行为，排除测量中的平均效应，发展单分子检测技术。

2. 单分子检测技术的原理2.1单个分子的荧光产生原理Fig.1 单个分子的荧光产生原理单分子的荧光产生原理如Fig.1所示[2]：S0，S1，S2分别为基态、第一激发单重态、第二激发单重态，T1为激发三重态。

分子吸收一个光子hνA后，被激发到较高的电子态S1或S2以上的能级后又快速弛豫到S1的最低振动能级，然后发射一个荧光光子ｈνF，同时使分子弛豫到S0的较高振动能级，最后快速弛豫到S0最低振动能级。

由于弛豫过程造成了能量损失，因此荧光光谱发生红移。

同时，分子也可能从S1无辐射系间窜跃到T1，由于自旋禁阻，其速度远低于从S1到S0的辐射跃迁时间。

然后从三重态弛豫到基态并发射一个磷光光子ｈνP。

单重态向三重态的跃迁会降低分子的荧光量子产率和缩短分子的荧光寿命，当处于S1态的电子弛豫到T1态时，分子的荧光很弱，乃至没有荧光，形成荧光暗态。

一旦当电子从T1态回到S0态时，分子处于新的一轮激发和发射的循环过程。

因而形成一个发射－暗态交替的量子跳跃过程，这种量子跳跃过程是单分子荧光的主要特征之一[3]。

这一重要特征导致了实验中观察到的单分子荧光光谱和荧光强度的涨落现象，并主要取决于单分子的局域环境及其淬灭途径。

因而测量单分子的荧光量子跳跃过程、荧光寿命和荧光量子产率可以提供很多关于单个荧光分子所在的局域环境的特性和变化情况的信息.单个荧光分子还具有唯一的固有荧光吸收跃迁偶极矩，分子只吸收那些偏振方向与其吸收跃迁偶极矩方向一致的光子，然后发出具有一定偏振方向的荧光。

荧光的偏振特性是单分子的另一重要特征[4]。

在单分子探测的广泛应用中，人们正是利用这种单个分子跃迁偶极矩的方向以及分子所处的环境的差异来研究和推测生物大分子的结构和功能。

以上是单个分子的荧光产生原理。

在单分子的实际荧光检测中是用激光激发荧光分子或用染料分子标记了的其他分子，分子发出荧光。

由于荧光物质通过激光束的时间( ms 级)比荧光的激发态寿命( ns 级)大得多，因此一个荧光物质分子在通过激光束的过程中可以被反复激发而在基态S0和电子激发态S1之间反复循环，发射出大量的荧光光子，即“光子爆发”。

通过这种在短时间内发出大量光子的“光子爆发”现象[5]可以把单个荧光物质分子的荧光同很强的背景杂散光区别开来，从而有效地探测单个荧光分子，并从这样的爆发中获取研究对象的相关信息。

荧光分子在激发光的照射下，反复经历多次激发、发射过程后，往往造成分子内部结构发生不可逆的变化，不能吸收更多的光子而进一步发射荧光。

这时就称该分子被光漂白了。

我们希望一个荧光物质分子在通过探测灵敏区时能够辐射尽可能多的荧光光子，这需要提高激光功率。

而当激光功率高时，荧光分子有可能在通过探测灵敏区的途中被漂白了，信噪比反而下降。

因此，在通过“光子爆发”提高荧光信号的同时，选择一个好的荧光分子和选取合适的激光功率以避免“光漂白”[6]也是非常重要的。

2.2单分子检测技术的关键将荧光基团标记在生物大分子上，可以通过其各种特性的变化来反映有关分子间的相互作用、酶活性、反应动力学、构象动力学、分子运动自由度及在化学和静电环境下活性改变等信息。

并且标记上去的荧光团对宿主的性质影响很小。

在稀溶液中，吸光光度法检测单个分子的吸光值的准确度较低，而荧光发射检测因背景值较低，所以较为灵敏，信噪比较高。

正如Keller所说“单分子检测能力的高低与其说是检测灵敏度的提高，不如说是背景噪音的降低”[7]对单分子荧光的探测必须满足两个基本要求[8]：（1）在被照射的体积中只有一个分子与激光发生相互作用，这一点可以很方便地通过调整研究体系的浓度（密度）来达到；（2）确保单分子的信号大于背景干扰信号。

可以通过减少拉曼散射、瑞利散射及其杂质荧光所造成的干扰来达到。

杂散光背景是影响单分子荧光检测信号的重要因素。

为了有效地检测单个分子，必须大大降低杂散光的干扰。

背景杂散光的主要来源为：溶液瑞利散射光、拉曼散射光和光学器件的散射光。

单分子检测在降低由瑞利散射、拉曼散射及溶剂杂质荧光产生的背景干扰时，因为单分子信号与探测体积无关，而背景则正比于探测体积，所以为减少单分子检测时背景杂散光的干扰，采用了降低探测体积这一有效途径。

因此，要获得理想的信噪比需要将激发体积最小化。

目前文献报道的流体聚焦法的检测体积可达到1～10pL的级别；微滴法也可达到pL级，共聚焦显微法的探测体积则在fL至亚fL级，因此背景可忽略不计，具有很高的信噪比，但这种方法由于布朗运动导致分子进入探测区域的概率较小，使得分子检测的效率较低。

如何平衡检测体积的减小与检测效率的提高亦是单分子检测技术亟待解决的问题之一。

另外，还有人使用毛细管和微通道来达到降低检测体积的目的。

为了消除杂散光，还可以采用的方法[5]：(a)光谱滤波：有滤光片去掉其它颜色的杂散光（如瑞利散射光，光学器件散射光，溶液杂质的荧光）；(b)利用荧光和杂散光在时间特性上的区别来消除拉曼散射光。

由于荧光强度是一条指数衰减曲线，荧光发射有几个ns的延迟，因此采用高重复频率的激光器并结合时间门符合技术可以把单个染料分子的荧光信号同很强的背景杂散光区别开来。

3. 单分子检测技术目前用于单分子研究的技术很多，包括观察其构象的变化、功能活动，以及与其它分子相互作用的动力学过程，可揭示出过去检测多分子集体行为平均化所掩盖的“个性”和蕴藏的丰富信息，从而深入了解生命活动的微观规律。

可将其归纳成以下两个方面：扫描探针技术和光学和光谱技术。

在扫描探针技术中，主要有扫描隧道显微技术(SEM)、原子力显微技术(AFM)和扫描离子电导显微镜技术(SICM)等相似技术家族。

而在光学和光谱技术中，则包括了扫描近场光学显微技术(SNOM)、光钳技术(OT)和荧光技术(Fluorescence)。

而且现在根据需要，还发展出各种组合技术，如AFM/光钳、SNOM/共焦显微术、SNOM/FRET等。

STM利用针尖与样品在近距时的隧道电流，AFM利用针尖与样品直接接触时的力，SICM利用针尖与样品间的电导达到成像的目的。

由于这类技术可在常温常压下进行，而且分辨率很高(10-9－10-10m水平)，因此对于显示单个分子的形貌具有很大的优越性。

目前应用AFM比较普遍，它不仅可以观察处于溶液状态的单个分子，更接近于生理状态，而且可以测量力谱，即和大分子一部分接触，并通过施力与距离的关系了解分子的力学性质，特别适合于对生物分子折叠与解折叠的研究。