第八章 荧光分光光度法与检测技术

主管检验师资格考试临床免疫学和免疫检验复习习题第八章荧光免疫技术（附答案解析）1、荧光效率的决定因素是（）A、荧光素本身特性B、激发光波长C、激发光强度D、环境因素E、温度2、FITC的吸收波长为（）A、495nmB、520nmC、570nmD、450nmE、360nm3、荧光素发射荧光属于（）A、光照发光B、化学发光C、生物发光D、电化学发光E、偏振光4、纯化荧光素标记抗体时，去除游离荧光素可采用的方法是（）A、盐析法B、离子交换层析C、亲和层析D、透析法E、活性炭吸附5、下列何种方法的灵敏度最高（）A、荧光法B、磷光法C、分光光度法D、比浊法E、化学发光法6、下列哪项方法不属于免疫荧光细胞化学（）A、直接法B、夹心法C、间接法D、补体法E、捕获法7、为了保证免疫荧光细胞化学染色的准确性，排除某些非特异性染色，必须在初次实验时进行对照试验。

下列选项中不必要的（）A、替代对照B、吸收试验C、阴性对照D、阳性对照E、补体对照8、下列组成荧光显微镜的结构中，与普通光学显微镜相同的是（）A、光源B、滤板C、聚光器D、目镜E、物镜9、荧光色素中呈现明亮黄绿色荧光的是（）A、藻红蛋白B、四甲基异硫氰酸罗丹明C、四乙基罗丹明D、异硫氰酸荧光素E、亮绿10、荧光效率是（）=A、指荧光色素将吸收的光能转变为荧光的百分率B、指荧光色素产生荧光的强度C、指接受激发光后，荧光物质所产生的荧光的色调D、指特异性荧光和非特异性荧光的强度比E、指物质产生荧光的效率11、在荧光素标记抗体技术中，荧光素的抗体之间的结合是靠（）A、范德华力B、氢键C、离子键D、共价键E、静电引力12、免疫荧光技术的基本原理是（）A、将特异性抗体标记上荧光检测抗原B、将特异性抗原标记上荧光检测抗体C、将特异性抗体标记上荧光检测抗原或抗体D、将特异性抗原标记上荧光检测抗原或抗体E、以上都不对13、荧光免疫技术中，间接法所使用的第二抗体可以是（）A、抗种属特异性IgA荧光抗体B、抗种属特异性IgG荧光抗体C、抗种属特异性IgM荧光抗体D、以上都正确E、以上都不正14、免疫荧光技术的基本原理是（）A、将特异性抗体标记上荧光检测抗原B、将特异性抗原标记上荧光检测抗体C、将特异性抗体标记上荧光检测抗原或抗体D、将特异性抗原标记上荧光检测抗原或抗体E、以上都不对15、下列哪项方法不属于免疫荧光细胞化学（）A、直接法B、夹心法C、间接法D、补体法E、捕获法16、实验本身即可避免内源性非特异性荧光干扰的检测方法为（）A、时间分辨荧光免疫测定B、荧光偏振免疫测定C、荧光酶免疫测定D、直接荧光抗体染色法E、间接荧光抗体染色法17、下述间接法描述不确切的是（）A、第一抗体为针对抗原的特异性抗体.B、第二抗体为荧光标记抗体，是针对第一抗体的抗抗体C、可用于检测抗原，也可用于检测抗体D、操作简便，特异性高E、可以用于多种抗体的检测18、下列有关间接荧光法的叙述错误的是（）A、敏感性高于直接荧光法B、以荧光素标记针对抗原的特异性抗原C、既可检测抗原，也可检测抗体D、荧光素标记抗体是抗抗体E、一种标记物可对多种抗原进行检测19、用于标记抗体的荧光素应符合下列要求，除外（）A、与蛋白质分子形成离子键B、荧光效率高，与蛋白结合后仍能保持较高的荧光效率C、荧光色泽与背景组织色泽对比鲜明D、与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫学性质E、标记方法简单，安全无毒20、双标记法荧光素标记抗体技术的主要用途是（）A、提高荧光强度B、提高荧光效率C、可同时检测同一标本中两种抗原D、使用一种标记物可检测多种抗原E、减少非特异性荧光21、下列不符合荧光素标记免疫技术直接法的描述是（）A、荧光抗体直接加于标本上B、常用于抗核抗体的检测C、每检查一种抗原需制备特异的荧光素标记抗体D、灵敏度偏低E、特异性高，非特异荧光染色因素少22、目前公认的最有效的检测抗核抗体的方法（）A、ELISAB、放射免疫技术C、直接荧光法D、间接荧光法E、补体法答案部分1、【正确答案】 A【答案解析】荧光效率的决定因素是荧光素本身特性。

荧光分光光度法2015年版《药典》四部通则0405某些物质受紫外光或可见光照射激发后能发射出比激发光波长较长的荧光。

物质的激发光谱和荧光发射光谱，可用于该物质的定性分析。

当激发光强度、波长、所用溶剂及温度等条件固定时，物质在一定浓度范围内，其发射光强度与溶液中该物质的浓度成正比关系，可以用于该物质的含量测定。

荧光分光光度法的灵敏度一般较紫外-可见分光光度法高，但浓度太高的溶液会发生“自熄灭”现象，而且在液面附近溶液会吸收激发光，使发射光强度下降，导致发射光强度与浓度不成正比，故荧光分光光度法应在低浓度溶液中进行。

测定法所用的仪器为荧光计或荧光分光光度计，按各品种项下的规定，选定激发光波长和发射光波长，并制备对照品溶液和供试品溶液。

通常荧光分光光度法是在一定条件下，测定对照品溶液荧光强度与其浓度的线性关系。

当线性关系良好时，可在每次测定前，用一定浓度的对照品溶液校正仪器的灵敏度；然后在相同的条件下，分别读取对照品溶液及其试剂空白的荧光强度与供试品溶液及其试剂空白的荧光强度，用下式计算供试品浓度：为供试品溶液的浓度；式中 cX为对照品溶液的浓度；cr为供试品溶液的荧光强度；Rx为供试品溶液试剂空白的荧光强度；RXb为对照品溶液的荧光强度；RrRrb为对照品溶液试剂空白的荧光强度。

因荧光分光光度法中的浓度与荧光强度的线性较窄，故（Rx -RXb）/（Rr-Rrb）应控制在0.5～2之间为宜，如若超过，应在调节溶液浓度后再进行测定。

当浓度与荧光强度明显偏离线性时，应改用标准曲线法进行含量测定。

对易被光分解或弛豫时间较长的品种，为使仪器灵敏度定标准确，避免因激发光多次照射而影响荧光强度，可选择一种激发光和发射光波长与供试品近似而对光稳定的物质配成适当浓度的溶液，作为基准溶液。

例如蓝色荧光可用硫酸奎宁的稀硫酸溶液，黄绿色荧光可用荧光素钠水溶液，红色荧光可用罗丹明B水溶液等。

在测定供试品溶液时选择适当的基准溶液代替对照品溶液校正仪器的灵敏度。

荧光分光光度法原理荧光分光光度法是一种基于物质吸收与发射荧光的分析技术。

它利用物质在吸收紫外光能量后，发生电子从基态跃迁到激发态，再经过热辐射和无辐射跃迁的复合过程，从激发态退回基态，释放出的能量以荧光形式发射出来。

通过测量荧光的强度和波长分布，可以对样品中的化合物进行定量和定性分析。

1.激发：激发光源照射样品溶液，激发光源通常为紫外光和可见光，其波长需要与所研究的物质的激发波长匹配。

激发光源经过滤波器选择特定波长的光线，然后通过光导纤维引导到样品室中。

2.激发态产生：样品中的物质吸收光能量，使得物质的电子由基态跃迁到激发态。

激发态的产生取决于样品中的化合物种类，以及激发光源的能量和波长等因素。

3.荧光发射：激发态的物质经过热辐射和无辐射跃迁的复合过程，返回基态。

在这个过程中，部分能量以荧光的形式发射出来。

发射的荧光波长与激发光的波长不同，可以通过光栅或者单色仪分离出来。

4.荧光光谱测量：通过荧光光谱仪对荧光进行测量，荧光光谱仪通常由光栅、检测器（如光电倍增管）和数据采集系统组成。

荧光光谱仪能够选择特定波长范围的荧光进行测量，并将荧光信号转化为电信号。

5.信号处理：荧光信号经过光电器件转换为电信号后，通过放大、调理和滤波等处理，最终通过数据采集系统记录和分析。

荧光分光光度法的优势在于其高灵敏度、高选择性和广泛的应用范围。

它可以应用于环境、食品、制药、生物化学等领域的定量分析和荧光标记分析。

此外，荧光分光光度法还可以结合其他技术，如高效液相色谱、毛细管电泳等，提高其分析的准确性和灵敏度。

荧光分光光度法的一些应用包括：药物分析、痕量元素测定、蛋白质分析、环境污染物检测、核酸分析、生物标记等。

在荧光分析中，还有一些常用的技术方法，如荧光共振能量转移（FRET）、荧光探针和荧光染料等，这些方法进一步扩展了荧光分光光度法的应用范围和分析手段。

总之，荧光分光光度法基于物质的吸收与发射荧光原理，通过测量荧光的强度和波长分布，实现对物质的定量和定性分析。

简述荧光分光光度法的原理荧光分光光度法（Fluorescence Spectrophotometry）是一种分析化学技术，利用物质在荧光激发下发出更长波长的荧光辐射来测定物质的含量或性质。

与紫外-可见分光光度法相比，荧光分光光度法对于具有天然或人工诱导荧光性质的分析物具有更高的灵敏度和选择性。

荧光分光光度法的原理基于分子的电子能级结构和电荷转移的量子化学过程。

当物质吸收辐射能量而处于激发态时，其分子内的电子会跃迁至高能级的激发态轨道，而随后又会返回到基态。

返回基态时，分子会通过非辐射跃迁散失能量，部分以辐射形式释放出来，即发出荧光。

荧光的波长通常较原始激发辐射能量的波长长，一般在可见光或近紫外光区域。

荧光分光光度法的基本设备包括激发源、选择性的滤光片或光栅、样品室、接收器和数据处理器。

光源通常是一个Xe闪光灯、汞灯或激光器，可提供适当波长的辐射。

这些辐射经过选择性的滤光片或光栅进行波长选择，然后照射到样品上。

样品与激发光发生作用后，会发射出荧光，其中一部分被收集并导入接收器中。

接收器随后将荧光信号转换为电信号，并通过数据处理器进行进一步分析和处理。

荧光分光光度法具有以下优点：1.高灵敏度：荧光信号的检测灵敏度远高于吸收光度法。

这是因为荧光信号的检测不受激发光波长影响，而仅受物质的荧光效率影响。

2.高选择性：由于荧光分光光度法是通过分子特征的电子能级来分析样品，因此具有较高的选择性。

可以通过设计适当的荧光探针或使用特异性荧光标记物来分析特定物质。

3.宽测量范围：荧光信号的测量范围通常宽于吸收光度法。

这是因为吸收光度法所测量的信号是来自于激发光的吸收，而荧光信号的测量是来自于荧光发射。

4.低背景噪声：相对于吸收光度法，荧光分光光度法的背景噪声通常较低。

这是因为背景荧光的产生通常很少，且荧光信号较强烈，很容易与背景噪声区分开来。

5.可检测多组分：荧光分光光度法可以使用不同的激发波长和荧光波长来分析多组分样品。

荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的含量一．实验目的1.学习荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的分析原理。

2.掌握荧光分光光度计的操作技术和测定多维葡萄糖粉中维生素B2的方法。

二．实验原理1.荧光光度法原理（1）常温下，处于基态的分子吸收一定的紫外可见光的辐射能成为激发态 分子，激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级，再以辐射跃迁的形式回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。

在稀溶液中，荧光强度IF 与物质的浓度c 有以下的关系： bcI I F εφ0303.2=当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系： Kc I F =这是荧光光谱法定量分析的理论依据。

（2）荧光分析法的特点：a. 与紫外-可见分光度法比较，荧光分析法具有更高的灵敏度。

b. 选择性好。

荧光法既能依据发射光谱，又能依据吸收光谱来鉴定物质。

c. 所需试样量少、操作方法简便。

（3）荧光光谱激发光谱：固定测量波长(选最大发射波长)，化合物发射的荧光强度与照射光波长的关系曲线。

激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大。

发射光谱：固定激发光波长(选最大激发波长), 化合物发射的荧光强度与发射光波长关系曲线。

固定发射光波长进行激发光波长扫描，找出最大激发光波长，然后固定激发光波长进行荧光发射波长扫描，找出最大荧光发射波长。

激发光波长和发射荧光波长的选择是本实验的关键。

（4）荧光分析仪器常用的荧光分析仪器由激发光源、单色器、液槽、检测器和显示记录器五部分构成，如下图所示：荧光分析仪器与分光光度计比较主要差别有两点： a.荧光分析仪器采用垂直测量方式，以消除透射光的影响；b.荧光分析仪器有两个单色器，能够获得单色性较好的激发光并消除其它杂 散光干扰。

2. 荧光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的含量维生素B 2（又叫核黄素，VB 2）是橘黄色无臭的针状结晶，其结构式为：H HO HO HO HNH H HOHNC NHNOOH 3CH 3C维生素B 2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。

一、引言在医学领域，血液化验是常见的临床检查方法之一。

通过血液化验，可以了解人体内部的生化反应和疾病状态。

而血液中的亚硝酸盐作为一种重要的生化指标，在临床诊断和治疗中具有重要的意义。

对血中亚硝酸盐的测定方法进行研究和优化具有重要意义。

二、亚硝酸盐的生物学意义亚硝酸盐是一种重要的生物化学物质，它在人体内具有多种生物学功能。

其一是与血红蛋白发生结合，形成亚硝基血红蛋白，对维持血液的正常功能具有重要意义。

其二是与氨基化合物反应生成致癌物质亚硝胺，因此在食品安全和环境保护中具有一定的监测价值。

三、传统测定方法的局限性传统测定血中亚硝酸盐的方法主要包括化学法和比色法，这些方法操作简单、成本低廉，但存在检测灵敏度低、特异性差等局限性。

寻求一种更为准确、灵敏、快速的测定方法具有重要的现实意义。

四、荧光分光光度法的优势荧光分光光度法是一种高灵敏度、高特异性的生化检测方法，通过测定样品在吸收特定波长光后自发发射出的荧光强度来定量分析样品中的物质。

在血中亚硝酸盐的测定中，荧光分光光度法具有很大的优势，可以克服传统测定方法的局限性，为临床血液化验提供更为准确的检测数据。

五、荧光分光光度法的原理和步骤荧光分光光度法测定血中亚硝酸盐的原理是利用亚硝酸盐与荧光试剂反应生成荧光产物，再利用荧光分光光度仪测定其荧光强度来定量分析亚硝酸盐的含量。

具体步骤包括：（1）制备样品：取血样进行前处理，获得样品溶液。

（2）反应：将样品溶液加入荧光试剂，反应产生荧光产物。

（3）测定：利用荧光分光光度仪测定样品溶液中荧光产物的强度。

（4）计算：根据荧光强度和标准曲线计算出亚硝酸盐的含量。

六、荧光分光光度法的应用前景荧光分光光度法作为一种高灵敏度、高特异性的生化检测方法，在血中亚硝酸盐的测定中具有广阔的应用前景。

它不仅可以用于疾病诊断和治疗过程中的监测，还可以在食品安全、环境保护等领域发挥重要作用。

随着仪器技术和荧光试剂的不断改进，荧光分光光度法在血液化验领域的应用前景将更加广阔。

荧光分光光度法(Fluorescence Spectrophotometry)前言：•1852年，斯托克斯（Stokes）发现萤石在暗处受到光的照射会发出一种蓝白色的光，他把这种光命名为“荧光”。

•1868年Goppelstroeder发表了利用Al-桑色素绿色荧光来分析微量Al的分析方法，可见荧光分析是一种历史悠久的分析方法。

时至今日，荧光分析在方法上取得了极大的进展。

促进了诸如：时间分辨、相分辨、荧光偏振、荧光免疫、同步荧光等荧光分析新方法的发展，同时促使各种各样新型荧光分析仪器的出现。

在仪器化方面，微机控制的全自动荧光分析仪具有灵敏度高（比紫外-可见分光光度法高2~3个数量级）、选择性好、工作曲线线性范围宽，且能提供激发光谱、发射光谱、发光强度、发光寿命、量子产率、偏振和各向异性诸多信息等优点，已成为一种重要的痕量分析技术。

在生物、医学、医药、环境和石油工业等诸多领域，荧光分析法都有广泛的应用。

不仅能直接和间接地分析众多的有机化合物，而且利用与有机试剂间的反应还能进行许多无机元素的测定。

随着科技的发展进步，荧光这种光致发光（photoluminescence）的本质进一步被揭开：•物质除了受紫外-可见光照射后会发出紫外和可见（UV-Vis）荧光之外，受其它各种不同波长光的照射后，同样也有发光现象。

例如：X-荧光、红外荧光等。

•除了吸收光能使分子激发而发光，根据起始激发形成的方式，可以将荧光同其它的发光类型（例如：生物发光、热发光、化学发光和摩擦发光）区别开来。

•通过化学反应使分子受激而发光称为“化学发光”。

利用化学发光进行分析工作叫“化学发光分析”。

•化学发光分析、荧光分析和磷光分析统称为“分子发光分析(molecular luminescence)”。

•荧光和磷光同属光致发光。

通过测定发光的强度可以定量测定许多痕量的无机物和有机物。

•相对于磷光和化学发光而言，目前荧光法的应用较多。

本章主要讨论荧光分析。

荧光分光光度计（分子荧光）Fluores_cence •1楼1、基本原理在室温下分子大都处在基态的最低振动能级，当受到光的照射时，便吸收与它的特征频率相一致的光线，其中某些电子由原来的基态能级跃迁到第一电子激发态或更高电子激发态中的各个不同振动能级，这就是在分光光度法中所述的吸光现象。

跃迁到较高能级的分子，很快通过振动弛豫、内转换等方式释放能量后下降到第一电子激发态的最低振动能级，能量的这种转移形式，称为无辐射跃迁。

再由第一电子激发态的最低振动能级下降到基态的任何振动能级，并以光的形式放出它们所吸收的能量，这种光便称为荧光。

荧光分析法具有灵敏度高、选择性强、需样量少和方法简便等优点，它的测定下限通常比分光光度法低2~4个数量级，在生化分析中的应用较广泛。

荧光分析法是测定物质吸收了一定频率的光以后，物质本身所发射的光的强度。

物质吸收的光，称为激发光；物质受激后所发射的光，称为发射光或荧光。

如果将激发光用单色器分光后，连续测定相应的荧光的强度所得到的曲线，称为该荧光物质的激发光谱（ex citation spectrum）。

实际上荧光物质的激发光谱就是它的吸收光谱。

在激发光谱中最大吸收处的波长处，固定波长和强度，检测物质所发射的荧光的波长和强度，所得到的曲线称为该物质的荧光发射光谱，简称荧光光谱（fluorescence spectrum）。

在建立荧光分析法时，需根据荧光光谱来选择适当的测定波长。

激发光谱和荧光光谱是荧光物质定性的依据。

某些物质的分子能吸收能量而发射出荧光，根据荧光的光谱和荧光强度，对物质进行定性或定量的方法，称为荧光分析法（fluoresc ence analysis）。

对于某一荧光物质的稀溶液，在一定波长和一定强度的入射光照射下，当液层的厚度不变时，所发生的荧光强度和该溶液的浓度成正比，这是荧光定量分析的基础。

2、检测荧光的仪器测定荧光可用荧光计和荧光分光光度计，其二者的结构复杂程度不同，但其基本结构是相似的。

荧光分光光度法测定维生素B6的含量荧光分光光度法测定维生素B6的含量荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光光谱的一种仪器。

其能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数,从各个角度反映了分子的成键和结构情况。

通过对这些参数的测定, 不但可以做一般的定量分析, 而且还可以推断分子在各种环境下的构象变化, 从而阐明分子结构与功能之间的关系。

荧光分光光度计的激发波长扫描范围一般是190-650nm，发射波长扫描范围是200-800nm。

可用于液体、固体样品（如凝胶条）的光谱扫描。

荧光分光光度计的工作原理：物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子吸收激发光后变为激发态, 这些处于激发态的分子是不稳定的,在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出，从而产生荧光． 不同物质由于分子结构的不同,其激发态能级的分布具有各自不同的特征，这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱；，因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。

在溶液中，当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系,即IF=KC,利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析,与紫外-可见分光光度法类似，荧光分析通常也采用标准曲线法进行。

荧光分光光度计基本结构：①光源：为高压汞蒸气灯或氙弧灯，后者能发射出强度较大的连续光谱，且在300nm～400nm 范围内强度几乎相等，故较常用。

②激发单色器：置于光源和样品室之间的为激发单色器或第一单色器，筛选出特定的激发光谱。

③发射单色器：置于样品室和检测器之间的为发射单色器或第二单色器，常采用光栅为单色器。

筛选出特定的发射光谱。

④样品室：通常由石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样品)组成。

测量液体时，光源与检测器成直角安排；测量固体时，光源与检测器成锐角安排。

⑤检测器：一般用光电管或光电倍增管作检测器。