稻曲病菌田间接种方法研究

稻曲病的综合防治1.病状诊断该病只在水稻穗部发生，为害谷粒不能结实。

早期外观不明显，菌丝在谷粒内逐渐增大，使内外颖稍张开露出淡绿色块状物即孢子座，后呈黑绿色龟裂，散出粉末厚垣孢子。

一般病穗在水稻齐穗后4～5天始见，8～10天后为发病高峰。

高峰期病穗数占总病穗的75%以上，齐穗后15天病穗出齐持续10天左右。

2.发生规律病原菌以菌核在地面越冬，也可以厚垣孢子在种子上越冬。

病菌在24℃～32℃时发育良好，26℃～28℃最适宜。

低于12℃或高于35℃时菌丝生长速度减缓或被抑制。

一般7～8月开始抽生子座，上生子囊壳，子囊孢子逐渐成熟。

病菌孢子随气流传播，散落于稻叶上，在水稻破口期侵入花器及幼颖，造成籽粒发病。

病粒主要在穗的中下部，上部次之。

抽穗开花时遇多雨低温，特别连阴雨天发病重。

品种间抗病差异显著，抽穗晚的品种有大发生的趋势，杂交稻发病高于常规稻；偏施氮肥及穗肥用量过多均会加重病害发生。

当年发病重的田块由于种子带菌量大，有可能翌年发病重；淹水串灌也可导致稻曲病传染发生。

3.防治方法①农业防治，选用抗病早熟品种，建立无病留种田；改进施肥技术，施足底肥，增施农肥少施氮肥，配施磷钾，慎重用穗肥；浅水勤灌，后期采取浅干湿交替灌溉，适时落田。

②化学防治，浸种催芽前用硫酸铜200倍液或福尔马林50倍液或3%～5%生石灰水浸种3～5小时。

也可用50%多菌灵500倍液浸种24小时。

在大田防治中波尔多液和硫酸铜液防效高于井冈霉素和多菌灵，但抽穗后使用硫酸铜液容易发生药害。

大田第一次防治在破口前8天，到破口抽穗20%时施药效果最好。

通常选在下午3时以后用药。

每亩用1∶1∶500的石灰倍量式波尔多液或晶体硫酸铜50克或14%络安铜100克或50%DT粉剂100～150克加水50公斤喷雾。

第二次防治每亩用井冈霉素150克加水50公斤喷雾，兼治纹枯病。

如要兼治穗茎瘟，可同加适量三环唑或多菌灵等药剂。

运转工作业安全技术规程运转工作业安全技术规程一、总则为了保障员工在运转工作中的安全，减少事故发生，按照国家有关法律法规和有关规定，制定本规程。

二、适用范围适用于所有从事运转工作的职工。

三、安全管理1.运转工作前，应全面检查设备和工具的安全性能，确认合格后方可投入使用。

2.严禁未经授权操作他人设备。

3.在运转工作过程中，应保持专注，不得走神，注意周围环境和其他人员的安全情况。

4.不得擅自更改设备参数或进行设备维护保养，如需更改或维修，应按照程序申请并经过审核。

5.在运转过程中发现异常情况或设备故障时应及时汇报，避免引发事故。

6.遇紧急情况时要保持冷静，根据应急预案执行。

四、安全防护1.穿着安全防护用品，如安全头盔、安全鞋、防护眼镜、手套等。

2.防止磨损、腐蚀、过载等因素引起的事故，采取措施确保设备的安全性能。

3.明确标示设备、工具和管道的运转方向和速度、负载等信息。

4.设备和管道周围应设置防护栏杆，禁止未经授权的人员靠近。

五、急救措施1.在发生事故时，应立即停止设备运转，采取现场救援措施，并及时报警。

2.熟悉心肺复苏、急救技能，及时施救。

3.培训员工如何处理各种危险品泄漏事故，保持应急处置能力。

六、违规处分1.对于未按规定进行安全管理的违规行为将视情况给予批评教育、记过、记大过等行政处罚。

2.对于严重违规行为或造成事故的责任人员将依法追究法律责任。

七、附则本规程进一步完善了公司的安全制度，提高了运转工作中员工的安全意识和技能，有助于预防事故的发生，促进了企业的发展。

一、 发病症状水稻稻曲病仅在穗部发生，只危 害谷粒。

病菌侵人谷粒后，在颖壳内形 成菌丝块，破坏病粒内部组织，最初见 颖谷合缝处露出淡黄绿色块状物（稻曲 球），然后逐渐膨大，最后包裹全颖壳，体积比健壮粒大3 ~ 4倍。

稻曲球墨 绿色或橄榄色，表面平滑，后开裂，散 出墨绿色粉末（厚垣孢子）。

发病后期，湿度大时在稻曲球两侧着生2 ~4粒黑色、稍扁平、硬质的菌核。

菌核成熟 后脱落在稻田内越冬。

二、 发生规律病菌以厚垣孢子和菌核的形态在土壤中越冬，也可以厚垣孢子的形态附着在种子表面越冬。

翌年，菌核萌发产生 的子囊孢子或附着在种子上的厚垣孢子是病害的初侵染源。

水稻生长季节，子 囊孢子或由厚垣孢子萌发产生的分生孢子借助气流传播，在水稻孕穗末期至破口期，菌丝从水稻的柱头和子房侵人，并深入胚乳中迅速向花药及整个颖花内腔蔓延，最后形成稻曲病菌厚垣孢子球4〇农村腦即稻曲球。

条件适宜时，可形成菌核。

一般抽穗晚的品种发病重，且粳稻发病重于籼稻，杂交稻发病重于常规稻。

散 穗型、早熟品种发病较轻，而密穗型、晚熟品种发病较重。

抽穗速率慢、抽穗 期长的品种发病时间长、发病重。

水稻 抽穗扬花时如遇低温，特别是连阴雨天，水稻生育期延长，就易诱发稻曲病。

连作地块，高肥贪青，密植田以及 深灌、串灌、漫灌和后期落水过晚的稻田，病害发生重。

山区雾大、露重、日照少、气温偏低，发病程度较重。

三、防治措施1.预防与控制。

加强制种单位管理，严格按照植物检疫操作规程繁育水稻种子，同时加强对调运种子的检疫，防止病菌附着在种子上进行远距离传播。

选用抗病品种，控制病害发生，如 选用临稻6号、威优29、双糯4号、辽粳 10号、中优448、特优158、隆科10号、金优601、天优998等品种。

播种前，可 使用泥水或盐水选种，消除病粒。

泡田 时，捞出田间菌核及杂物，以减少菌鯧物医院/2021.051. 危害特点枸杞被害叶片细胞受到刺激后形成黄绿色近圆形隆起的小疱斑，严重时呈紫色或黑痣状虫瘿。

水稻稻曲病的综合防治技术
水稻稻曲病是一种常见的水稻病害，为了控制这种病害的发生，必须采取综合的防治措施，以下为具体的技术措施和方法：
1. 良种选择：选择适应本地环境的高抗优良品种。

2. 播种前处理：使用生长调节剂和有机物质浸种。

3. 合理田间管理：留有足够的空间，保持透气性，定期修剪和拉杂草。

4. 防治虫害：及时喷洒绿色无公害虫害药剂。

5. 解决水分问题：合理灌溉，保持土壤微湿，不过湿。

6. 合理施肥：用合适的肥料，不使用过多的氮肥。

7. 提高光合作用效率：施用能增加叶面光合作用效率的肥料。

8. 加强病害监测：定期巡查和监测，如有发现及时采取防治措施。

9. 友好防治：使用环保无公害药剂和生物防治，保护生态环境。

10. 改良栽培方式：尝试“中秋插秧、早熟收获”的栽培方式，减少水稻生长期，以降低病害发生率。

通过以上措施，可以有效地控制水稻稻曲病的发生和传播，保障水稻生长和丰收。

杂交稻稻曲病的发生与防治杂交稻稻曲病是由水稻白叶枯霉菌引起的一种重要水稻病害，主要危害水稻的叶片和穗部，严重影响水稻的产量和品质。

及时有效地防治杂交稻稻曲病对于提高水稻产量和保障粮食安全至关重要。

本文将分别从杂交稻稻曲病的发生原因和防治措施两个方面进行探讨。

一、发病原因1.病菌：杂交稻稻曲病的病原菌是水稻白叶枯霉菌(Pyricularia oryzae)。

该病菌生活在土壤中或寄主植株上，随着风、水、农具等传播到健康水稻植株上感染。

2.气候条件：气温偏高、湿度大是杂交稻稻曲病发生的主要气候条件。

在高温（25-30℃）潮湿的环境中，病菌易于繁殖和侵染水稻植株，加重病情。

3.水稻品种：目前导入大量国外优良水稻品种，由于其抗病性较差，更易受病害侵袭。

4.土壤条件：酸性土壤、排水不良的田地更容易滋生病菌，加重病害发生。

二、防治措施1.选用抗病优良品种：杂交稻稻曲病虽然病原菌变异对水稻的抗性不断产生影响，但目前培育出了一些抗病性良好的水稻品种。

选用抗病优良品种是预防杂交稻稻曲病的有效手段。

2.合理施肥：施肥要科学合理，适当增施钾肥和磷肥，可以提高植物的抗病能力。

3.改善田间管理：增施基肥，保持土壤充分肥沃，有利于水稻植株营养生长，减轻病菌侵染。

4.及时灭茬杀菌：在稻田收割后及时进行秸秆还田和灭茬，防止病菌在秸秆中越冬，减少病源的传播。

5.化学防治：杂交稻稻曲病发病初期可采用药剂防治，常用药剂有三唑醇、咪鲜胺等。

6.生物防治：可选用一些生物制剂，如枯霉菌、放线菌等，通过它们对病原菌的拮抗作用来防治杂交稻稻曲病。

7.定时定点测报病害情况：在病害易发生区域定时定点开展病害测报，根据病害测报结果，采取相应的防治措施。

对于杂交稻稻曲病的防治，需要从多个方面综合防治，不仅要注意品种选择和施肥管理，还应该采取化学防治和生物防治相结合的方式，及时发现病害情况并及时对其进行防治处理，从而最大限度地减少杂交稻稻曲病的危害，保障水稻的产量和品质。

水稻稻曲病菌的侵入期及其致病因子初探摘要利用稻曲在PDA上离体培养能形成菌丝体及分生孢子，温度在27℃左右；接菌试验表明，稻曲病菌在水稻全生育期中的主要侵入期为大肚期至破口期，而不是在浸种催芽时期；在接菌后遮荫的条件下利于病菌的侵入，增加接菌次数能促进病害的严重发生；在太湖地区自然条件下，8月下旬水稻大肚期，阴雨多湿利于该病菌的入侵，而在9月上中旬的水稻灌浆时的稻曲形成期则需要日温差8℃以上的条件，平均日温度超过27℃则不利于稻曲的形成。

两者必须兼备。

这种利于发病的气候相与水稻丰产所需抽穗灌浆期的气候条件相符；大穗型品种，特别是杂交粳稻有利于稻曲病的流行。

关键词稻曲病菌；水稻；侵入期；遮荫；温差稻曲病是由稻曲病菌（Ustilanoideavirens）引起的水稻穗期病害。

此病发生历史很久，本草纲目第22卷中即有记载，‘粳谷奴，谷穗煤者’，群众中有以此病是丰收象征的传说[1]。

20世纪80年代中期，此病发生较为普遍，1984年，我们在原吴县越溪乡一大队调查，杂交籼稻“干化二号”未防治田块，穗发病14.3%，百穗稻曲107.7粒，每病穗病粒7.5粒，后期稻曲破裂，田间黑粉随处可见，这不仅降低了水稻的产量与品质，还造成环境污染。

80年代后期至90年代初，由于注重水稻穗期病害的防治，单季晚稻替代了杂交籼稻，病原积累相对减少，病害有所下降，但仍有零星发生。

90年代末，由于杂交粳稻和超高产大穗型品种的推广，加上气候条件的变化，本地区此病有回升加重的趋势。

为此，苏州市科技局和江苏省科技厅先后下达了稻曲病发生规律及控制技术的项目，本文就多年来对此病原的侵入期、致病因子观察结果初报如下。

1材料与方法1.1试验材料供接菌用的稻曲在太湖地区农科所育种田中收集；供测水稻品种是本地大面积种植的高产大穗型单季晚粳品种武运粳七号、9522及杂交粳稻泗优422；室内培养病菌的基质是PDA；气象资料由苏州市气象局提供。

1.2试验设计与方法1.2.1病菌的室内培养。

水稻稻曲病的影响因素及综合防控技术水稻稻曲病是由稻曲病毒引起的水稻病害，广泛分布于全球各地的水稻种植区域。

该病害严重危害了水稻的生长和产量，因此对于水稻稻曲病的影响因素及综合防控技术进行深入研究和探讨，对于提高水稻产量和质量具有重要意义。

一、水稻稻曲病的影响因素1. 气候因素：气温、湿度是影响水稻稻曲病的重要因素。

在高温潮湿的环境中，稻曲病毒容易传播和扩散，加重病害的发生程度。

2. 病毒来源：水稻稻曲病毒可通过种子、土壤、虫媒传播等多种途径传播，因此良好的种子消毒、清洁的种植土壤管理对于减少病毒来源至关重要。

3. 主要宿主：除了水稻，稻曲病毒还可感染多种禾本科作物，包括小麦、玉米等，因此在农田间的轮作和农田周围生长的杂草也是潜在的病毒来源。

4. 病毒传播媒介：昆虫是稻曲病毒的重要传播媒介，包括蚜虫、蝗虫等。

它们在吸食植物汁液的过程中，可能会将病毒传播给水稻植株，因此昆虫的防治对于控制稻曲病有着重要的意义。

二、水稻稻曲病的综合防控技术1. 选用健康种子：种子消毒是预防水稻稻曲病的基础性措施。

选择生长良好、无病害的种子，经过适当的消毒处理后再进行播种，可以有效减少病毒来源，降低病毒的传播风险。

2. 土壤管理：保持田间通风透光，控制水稻田间草丛和杂草的生长，及时清除田间秧苗残体，保持稻田清洁卫生，减少病毒的传播机会。

3. 合理施肥：合理施用有机肥和化肥，增强水稻植株的免疫力，提高植株的抗病能力。

4. 生物防治：引入天敌昆虫对抗传播病毒的害虫，如利用蚜小蜂等昆虫进行生物防治，减少昆虫传播病毒的机会。

5. 化学防治：在病毒传播期和易发期，可以采用化学农药进行喷施，如使用病毒抑制剂、昆虫药剂等，及时控制病毒传播途径，降低病害发生。

6. 遗传育种：通过选育具有抗病性的水稻品种，提高水稻的抗病能力，减少病毒传播和发病。

水稻稻曲病的影响因素包括气候、病毒来源、宿主植物和传播媒介等多方面因素，对于综合防控水稻稻曲病，需要采取多种手段和策略，包括选用健康种子、合理施肥、土壤管理、生物防治、化学防治和遗传育种等措施，综合利用各种手段来控制和预防水稻稻曲病，在实际种植生产中需要根据具体情况制定相应的防治技术，以保证水稻的产量和质量。

江苏农业学报(ＪｉａｎｇｓｕＪ.ｏｆＡｇｒ.Ｓｃｉ.)ꎬ２０２１ꎬ３７(６):１４００￣１４０８ｈｔｔｐ://ｊｓｎｙｘｂ.ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎ俞咪娜ꎬ于俊杰ꎬ曹慧娟ꎬ等.稻曲病病菌Ｚｎ２(Ⅱ)Ｃｙｓ６型转录因子ＵｖＺＣ１基因的克隆及功能分析[Ｊ].江苏农业学报ꎬ２０２１ꎬ３７(６):１４００￣１４０８.ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１０００￣４４４０.２０２１.０６.００６稻曲病病菌Ｚｎ２(Ⅱ)Ｃｙｓ６型转录因子ＵｖＺＣ１基因的克隆及功能分析俞咪娜ꎬ㊀于俊杰ꎬ㊀曹慧娟ꎬ㊀潘夏艳ꎬ㊀宋天巧ꎬ㊀刘永锋(江苏省农业科学院植物保护研究所ꎬ江苏南京２１００１４)收稿日期:２０２１￣０２￣１８基金项目:江苏省自然科学基金项目(ＢＫ２０１８０２９６)ꎻ国家自然科学基金项目(３１４０１７００)作者简介:俞咪娜(１９８５－)ꎬ女ꎬ浙江杭州人ꎬ硕士ꎬ副研究员ꎬ主要研究方向为水稻真菌病害致病机制等ꎮ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｚｊｐｓｙｕ＠１６３.ｃｏｍ通讯作者:刘永锋ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｌｉｕｙｆ＠ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎ㊀㊀摘要:㊀为明确Ｚｎ２(Ⅱ)Ｃｙｓ６型转录因子ＵｖＺＣ１在稻曲病病菌中的功能ꎬ利用ＣＲＩＳＰＲ￣Ｃａｓ９结合同源片段双交换的方法ꎬ诱导野生型菌株Ｊｔ２０９发生ＵｖＺＣ１基因缺失突变ꎮ结果显示ꎬ与Ｊｔ２０９相比ꎬＵｖＺＣ１基因缺失突变体的生长速率和分生孢子量均显著下降ꎬ且突变体中部分与稻曲病病菌其他产分生孢子相关基因表达量发生变化ꎻ此外ꎬ该基因的缺失导致突变体对十二烷基硫酸钠(ＳＤＳ)更敏感ꎬ而对氧化胁迫的耐受性增强ꎻ在稻曲病病菌接种水稻后２４ｈ㊁４８ｈ的侵染早期ꎬＵｖＺＣ１基因的表达量明显上升ꎬ但基因缺失突变体接种水稻后形成的稻曲球数量与野生型之间没有差异ꎮ综上所述ꎬＵｖＺＣ１基因参与稻曲病病菌营养生长㊁分生孢子产生和侵染水稻过程ꎬ还与稻曲病病菌细胞壁的完整性和响应氧化胁迫相关ꎮ关键词:㊀稻曲病病菌ꎻＺｎ２(Ⅱ)Ｃｙｓ６转录因子ＵｖＺＣ１ꎻ基因敲除ꎻ基因功能ꎻ致病性中图分类号:㊀Ｓ５１１.０１㊀㊀㊀文献标识码:㊀Ａ㊀㊀㊀文章编号:㊀１０００￣４４４０(２０２１)０６￣１４００￣０９ＣｌｏｎｅａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｒｅｓｅａｒｃｈｏｆＺｎ２(Ⅱ)Ｃｙｓ６ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＵｖＺＣ１ｇｅｎｅｉｎＵｓｔｉｌａｇｉｎｏｉｄｅａｖｉｒｅｎｓＹＵＭｉ￣ｎａꎬ㊀ＹＵＪｕｎ￣ｊｉｅꎬ㊀ＣＡＯＨｕｉ￣ｊｕａｎꎬ㊀ＰＡＮＸｉａ￣ｙａｎꎬ㊀ＳＯＮＧＴｉａｎ￣ｑｉａｏꎬ㊀ＬＩＵＹｏｎｇ￣ｆｅｎｇ(ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＰｌａｎｔＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬＪｉａｎｇｓｕＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＮａｎｊｉｎｇ２１００１４ꎬＣｈｉｎａ)㊀㊀Ａｂｓｔｒａｃｔ:㊀ＩｎｏｒｄｅｒｔｏｃｌａｒｉｆｙｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆＺｎ２(Ⅱ)Ｃｙｓ６ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＵｖＺＣ１ｉｎＵｓｔｉｌａｇｉｎｏｉｄｅａｖｉｒｅｎｓꎬｇｅｎｅｄｅｌｅｔｉｏｎｍｕｔａｔｉｏｎｗａｓｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｂｙｔｈｅＣＲＩＳＰＲ￣Ｃａｓ９￣ｂａｓｅｄｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ.Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｗｉｌｄ￣ｔｙｐｅｓｔｒａｉｎＪｔ２０９ꎬｔｈｅｇｒｏｗｔｈｒａｔｅａｎｄｃｏｎｉｄｉａｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆәＵｖＺＣ１ｍｕｔａｎｔｓｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄꎬａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓ￣ｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆｇｅｎｅｓｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎｏｆＵ.ｖｉｒｅｎｓｗｅｒｅａｌｓｏｃｈａｎｇｅｄ.ＩｎａｄｄｉｔｉｏｎꎬｔｈｅＵｖＺＣ１ｄｅｌｅｔｉｏｎｍｕｔａｎｔｓｓｈｏｗｅｄｍｏｒｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｔｏｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ(ＳＤＳ)ꎬａｎｄｔｈｅｔｏｌｅｒａｎｃｅｔｏｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓｗａｓｅｎｈａｎｃｅｄ.Ａｔｔｈｅｅａｒｌｙｓｔａｇｅｏｆｉｎｆｅｃｔｉｏｎ(２４ｈａｎｄ４８ｈａｆｔｅｒｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ)ꎬｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＵｖＺＣ１ｇｅｎｅｉｎｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ.ＨｏｗｅｖｅｒꎬｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｉｎｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｒｉｃｅｆａｌｓｅｓｍｕｔｂａｌｌｓｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｗｉｌｄｔｙｐｅａｎｄｔｈｅәＵｖＺＣ１ｍｕｔａｎｔｓｗａｓｆｏｕｎｄ.Ｏ￣ｖｅｒａｌｌꎬＵｖＺＣ１ｇｅｎｅｈａｓｒｏｌｅｓｉｎｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｈｙｐｈａｌｇｒｏｗｔｈꎬｃｏｎｉｄｉａｔｉｏｎꎬｃｅｌｌｗａｌｌｉｎｔｅｇｒｉｔｙａｎｄｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｅｉｎＵ.ｖｉｒｅｎｓ.ＦｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅꎬＵｖＺＣ１ｇｅｎｅｉｓａｌｓｏｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｏｆＵ.ｖｉｒｅｎｓ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:㊀ＵｓｔｉｌａｇｉｎｏｉｄｅａｖｉｒｅｎｓꎻＺｎ２(Ⅱ)Ｃｙｓ６ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＵｖＺＣ１ꎻｇｅｎｅｋｎｏｃｋｉｎｇ￣ｏｕｔꎻｇｅｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎꎻｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ㊀㊀稻曲病(Ｒｉｃｅｆａｌｓｅｓｍｕｔ)是由稻曲病病菌[Ｕｓｔｉ￣ｌａｇｉｎｏｉｄｅａｖｉｒｅｎｓ(Ｃｏｏｋｅ)Ｔａｋ.]侵染引起的一种世界性水稻穗部病害ꎬ在世界各水稻主产区均有发生ꎮ近年来ꎬ稻曲病在中国逐渐成为水稻的主要病害之００４１一ꎬ年平均发病面积达３.０６ˑ１０６ｈｍ２ꎬ造成水稻年减产１.５８６ˑ１０８ｋｇꎬ尤其在长江中下游地区ꎬ稻曲病重发的水稻种植面积占水稻总种植面积的１９％~４０％[１]ꎮ稻曲病的发生会影响谷粒的营养运输和正常发育ꎬ造成空秕率升高㊁千粒质量下降[２￣３]ꎻ而稻曲球中含有的稻曲菌素更能抑制微管蛋白的组装ꎬ并干扰细胞骨架形成ꎬ引起人畜病变[４￣５]ꎮ深入研究稻曲病病菌致病相关基因功能ꎬ对解析稻曲病病菌致病机制㊁选择防治策略具有重要意义ꎮ转录因子是一类调控基因转录起始的重要蛋白质ꎬ稻曲病病菌转录因子ＵｖＨＯＸ２的基因敲除突变体菌株不产生厚垣孢子ꎬ且分生孢子产量下降ꎬ致病力减弱[６]ꎮ转录因子ＵｖＣｍｏ１㊁ＵｖＨｏｇ１参与稻曲病病菌响应非生物胁迫㊁致病等多个重要生物学过程[７￣８]ꎮＺｎ２(Ⅱ)Ｃｙｓ６型转录因子是子囊菌中最大的一类转录因子ꎬ其结构中包含１个ＣＸ２ＣＸ６ＣＸ５￣１２￣ＣＸ２ＣＸ６￣８Ｃ基序ꎬ可以与２个锌离子结合ꎬ该类蛋白质只存在于真菌界[９]ꎮＺｈａｎｇ等[１０]用稻曲病病菌接种水稻孕穗期的穗部ꎬ在转录组水平分析接种的水稻穗部发现ꎬ编码Ｚｎ２(Ⅱ)Ｃｙｓ６型转录因子１(ＵｓｔｉｌａｇｉｎｏｉｄｅａｖｉｒｅｎｓＺｎ２Ｃｙｓ６ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓ１ꎬＫＤＢ１８６６４)的ＵｖＺＣ基因在侵染早期的表达量显著升高ꎬ据此推测ꎬ该基因与稻曲病病菌侵染相关ꎮ目前ＵｖＺＣ１基因在稻曲病病菌中的生物学功能尚不明确ꎬ本研究通过分析该基因敲除突变体菌株的表型ꎬ对稻曲病病菌中ＵｖＺＣ１基因的功能进行解析ꎬ以期为稻曲病病菌致病机制研究提供理论基础ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀供试材料Ｊｔ２０９菌株分离自２０１８年从江苏金坛田间采集的稻曲病病株标样ꎬ经单孢纯化和测序鉴定为稻曲病病菌后保存[１１]ꎮ供试水稻品种为稻曲病感病品种两优培九ꎮ在田间用Ｊｔ２０９菌株接种两优培九后表现出强致病力ꎮ敲除载体ｐＣａｓ９￣ｇＲＮＡ由南京农业大学张海峰教授惠赠ꎬ回补载体ｐＫＯ１￣Ｎｅｏ由笔者所在实验室保存ꎮ稻曲病病菌用马铃薯蔗糖琼脂(ＰＳＡ)培养基活化和培养ꎬＹＴ培养基用于稻曲病病菌生物学特性的观察分析[８ꎬ１２]ꎮ稻曲病病菌的培养条件为２８ħ㊁避光ꎮ１.２㊀稻曲病病菌ＵｖＺＣ１基因的克隆与分析将新活化的Ｊｔ２０９菌株在ＹＴ培养液中摇动培养５ｄꎬ过滤并收集菌丝ꎮ用十六烷基三甲基溴化铵(ＣＴＡＢ)法提取Ｊｔ２０９总基因组ꎻ用ＲＮＡ提取试剂盒(ＢｉｏｔｅｋｅꎬＰＲ１２０２)提取Ｊｔ２０９总ＲＮＡꎬ用反转录试剂盒(ＴａＫａＲａꎬＲＲ０４７)将ＲＮＡ反转录成ｃＤＮＡꎮ参考稻曲病病菌Ｕｖ８ｂ菌株的全基因组序列ꎬ设计ＵｖＺＣ１基因的全长扩增引物ＵｖＺＣ１Ｆ㊁ＵｖＺＣ１Ｒꎬ以Ｊｔ２０９基因组和ｃＤＮＡ为模板ꎬ通过ＰＣＲ扩增分别获得ＵｖＺＣ１基因及ｃＤＮＡ全长序列并测序ꎮ将序列在美国国家生物技术信息中心(ＮＣＢＩ)网站上进行ＢＬＡＳＴ同源比对ꎬ用ＣＤＡＲＴ进行基因编码蛋白的结构域分析ꎬ用ＭＥＧＡ７构建系统进化树ꎮ１.３㊀稻曲病病菌ＵｖＺＣ１基因敲除和回补突变体的获得㊀㊀通过１Ｆ/１Ｒ引物对㊁２Ｆ/２Ｒ引物对对Ｊｔ２０９基因组进行扩增ꎬ分别获得９６４ｂｐＵｖＺＣ１基因上游片段和９９８ｂｐ下游片段ꎻ用引物对ｈｙｇ１.４Ｆ/ｈｙｇ１.４Ｒ从质粒ｐＳＫ０４４中扩增获得潮霉素抗性基因(ＨＰＨ)片段ꎬ通过多片段重组酶(Ｃ１１３￣０２)连接获得基因敲除载体ｐＭＤ１９Ｔ￣ＨＰＨ￣ＵｖＺＣ１ꎮＣＲＩＳＰＲ载体构建和稻曲病病菌原生质体转化参考Ｌｉａｎｇ等[１３]的方法ꎮ经潮霉素抗性初筛获得转化子ꎬ通过ＲＴ￣ＵｖＺＣ１Ｆ/ＲＴ￣ＵｖＺＣ１Ｒ㊁ｈｙｇ１.４Ｆ/ｙｚＲ和ｈｙｇ１.４Ｒ/ｙｚＦ特异性引物对扩增转化子基因组进行再次扩增ꎬ并对扩增片段进行测序和序列比对ꎮ利用地高辛标记的Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交方法对ＵｖＺＣ１基因敲除突变体菌株的基因组ＤＮＡ进行分析ꎬＪｔ２０９和突变体基因组ＤＮＡ的提取参照方法１.２进行ꎻ探针的制备采用ｈｙｇ１.４Ｆ/ｈｙｇ１.４Ｒ引物对经ＰＣＲ扩增获得的ＨＰＨ基因片段ꎻ利用ＸｈｏＩ单酶切基因组ＤＮＡꎬ按照ＲｏｃｈｅＤＩＧ￣ＨｉｇｈＰｒｉｍｅＤＮＡＬａｂｅｌｉｎｇａｎｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｔａｒｔｅｒＫｉｔＩ试剂盒的说明书进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交ꎬ明确ＵｖＺＣ１基因敲除突变体菌株中ＨＰＨ基因的插入拷贝数ꎮ为了获得基因回补突变体ꎬ用引物对ＣＦ/ＣＲ扩增Ｊｔ２０９基因组ꎬ获得包含基因上游１.９ｋｂ的片段㊁基因全长和基因下游０.５ｋｂ的片段ꎬ连接获得回补载体ｐＫＯ１￣Ｎｅｏ￣ＵｖＺＣ１ꎬ测序正确后ꎬ用农杆菌介导的稻曲病病菌转化方法将目的基因转化至ＵｖＺＣ１基因敲除突变体菌株上[１１]ꎬ用遗传霉素Ｇ４１８筛选转化子ꎬ再用ＲＴ￣ＵｖＺＣ１Ｆ/ＲＴ￣ＵｖＺＣ１Ｒ引物对进行转化子中ＵｖＺＣ１基因表达量的测定ꎬ筛选回补菌株ꎮ所用引物序列见表１ꎮ１０４１俞咪娜等:稻曲病病菌Ｚｎ２(Ⅱ)Ｃｙｓ６型转录因子ＵｖＺＣ１基因的克隆及功能分析１.４㊀稻曲病病菌生物学表型的测定将稻曲病病菌菌株在ＰＳＡ培养基上培养１５ｄ后ꎬ在菌落生长边缘处取菌碟(直径为５ｍｍ)ꎬ用于生物学表型的测定ꎮ每个菌设３个重复ꎬ每个试验重复３次ꎮ表１㊀ＵｖＺＣ１基因克隆和获取突变体所用的引物Ｔａｂｌｅ１㊀ＰｒｉｍｅｒｓａｐｐｌｉｅｄｆｏｒＵｖＺＣ１ｇｅｎｅｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｍｕｔａｎｔｓｏｂ￣ｔａｉｎｉｎｇ引物㊀㊀㊀引物序列(５ᶄң３ᶄ)㊀㊀㊀㊀㊀㊀ｈｙｇ１.４ＦＡＣＡＧＡＡＧＡＴＧＡＴＡＴＴＧＡＡＧＧＡＧＣｈｙｇ１.４ＲＴＡＣＴＣＴＡＴＴＣＣＴＴＴＧＣＣＣＴＣＧｙｚＦＡＣＣＡＧＴＣＴＡＣＣＣＧＡＣＣＧＴＡｙｚＲＧＡＡＣＣＡＧＣＣＡＣＴＣＧＴＣＴＣＧＧ１ＦＧＣＡＡＣＧＧＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣ１ＲＡＣＡＧＡＡＧＡＴＧＡＴＡＴＴＧＡＡＧＧＡＧＣＣＧＧＧＡＴＡＧＣＧＡＴＡＴＣ￣ＴＧＧＧＣ２ＦＣＧＧＧＡＴＡＧＣＧＡＴＡＴＣＴＧＧＧＣ２ＲＴＡＣＴＣＴＡＴＴＣＣＴＴＴＧＣＣＣＴＣＧＣＧＣ￣ＣＴＣＧＴＣＣＧＴＧＡＡＡＡＧＴＧＵｖＺＣ１ＦＡＴＧＧＣＧＣＣＡＣＣＧＧＴＣＧＡＧＧＴＧＵｖＺＣ１ＲＣＴＡＧＣＣＡＧＣＣＡＧＧＣＣＣＣＴＴＧＲＴ￣ＵｖＺＣ１ＦＣＡＣＣＴＣＧＡＣＣＧＧＴＧＧＣＧＣＣＡＴＲＴ￣ＵｖＺＣ１ＲＣＧＧＣＴＴＣＴＡＴＧＧＡＣＡＧＧＴＡＧＣＦＴＴＣＴＧＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＧＡＡＧＧＡＣＡＴＣＡＡＣＡＣＣＧＡＡＣＣＲＧＧＣＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＡＡＴＴＡＣＣＧＡＧＧＣＡＧＡＴＴＧＡＧＣＵｖＺＣ１ＣｒＦＡＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＡＧＣＴＣＧＡＡＧＣＴＧＴＵｖＺＣ１ＣｒＲＡＡＡＣＡＣＡＧＣＴＴＣＧＡＧＣＴＧＴＴＣＡＧＣ引物ＵｖＺＣ１ＣｒＦ和ＵｖＺＣ１ＣｒＲ用于获得ＵｖＺＣ１基因敲除突变体菌株的ｇｕｉｄｅＲＮＡꎮ１.４.１㊀菌丝生长速率的测定㊀将菌碟接种至ＹＴＡ培养基上ꎬ于２８ħ避光培养１２ｄ后观察菌落形态ꎬ测量菌落直径ꎮ１.４.２㊀菌丝对非生物胁迫的响应试验㊀分别将菌碟接种至含０ ３ｍｏｌ/ＬＮａＣｌ㊁０ ３ｍｏｌ/ＬＫＣｌ㊁０ ８ｍｏｌ/ＬＤ￣山梨醇(Ｓｏｒｂｉｔｏｌ)㊁７０μｇ/ｍｌ刚果红(ＣｏｎｇｏＲｅｄ)㊁０ ００５％十二烷基硫酸钠(ＳＤＳ)和３ｍｍｏｌ/ＬＨ２Ｏ２的ＹＴＡ培养基上ꎬ２８ħ避光培养１２ｄ后测量菌落直径ꎮ１.４.３㊀分生孢子产生量的测定㊀取菌碟后将其接至含有５０ｍｌＹＴＳ培养液的１００ｍｌ三角瓶中ꎬ每瓶接种５粒菌碟ꎬ于２８ħ㊁１６０ｒ/ｍｉｎ摇动培养７ｄꎬ用血球计数板统计分生孢子数量ꎮ１.５㊀致病力的测定稻曲病病菌致病力的检测参考张君成等[１３]的方法ꎬ将摇动培养７ｄ的培养液作为接种体(分生孢子含量为１ｍｌ１ˑ１０６个)ꎮ在两优培九孕穗期(破口前５~７ｄ)ꎬ用注射器将菌液注入穗苞ꎬ每个菌株接种１２穗ꎬ每穗接种１ｍｌ接种体ꎮ接种２８ｄ后调查每穗稻曲球数ꎬ重复３次ꎮ１.６㊀ＵｖＺＣ１基因表达的测定１.６.１㊀分生孢子不同萌发阶段ＵｖＺＣ１基因的表达㊀用单层Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ(ＣａｌｂｉｏｃｈｅｍꎬＬａＪｏｌｌａＣＡꎬＵＳＡ)过滤摇动培养５ｄ的稻曲病病菌ＹＴ培养液ꎬ收集分生孢子ꎮ分生孢子用无菌水洗涤后ꎬ稀释至终含量为１ｍｌ１ˑ１０６个ꎬ取４０μｌ孢子液并将其涂布于铺在ＹＴＡ培养基上的玻璃纸上ꎬ于２８ħ避光培养ꎬ分别于涂布培养后１２ｈ㊁１８ｈ㊁２４ｈ㊁４８ｈ和７２ｈ取样ꎬ以收集的未涂布的分生孢子作为对照ꎮ提取样品ＲＮＡꎬ用于测定ＵｖＺＣ１基因在孢子不同萌发阶段的表达量ꎬ基因的相对表达量通过荧光定量反应(ｑＰＣＲ)分析获得(ＴａＫａＲａꎬＲＲ８２０)ꎮｑＰＣＲ反应在ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３荧光定量ＰＣＲ仪(ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ)中完成ꎮ以α￣ｔｕｂｕｌｉｎ￣１作为内参基因ꎬ基因表达量的计算参照２－әәＣｔ方法ꎮ３次重复ꎮ１.６.２㊀Ｈ２Ｏ２胁迫下ＵｖＺＣ１基因的表达㊀收集分生孢子ꎬ按照终含量为１ｍｌ１ˑ１０６个接种至ＹＴ培养液中ꎬ避光摇动培养２ｄ后ꎬ加入终浓度为３ｍｍｏｌ/Ｌ的Ｈ２Ｏ２继续摇动培养ꎬ分别于处理后０.５ｈ㊁１.０ｈ收集菌丝ꎬ以处理前收集的菌丝为对照ꎮ按照方法１.６.１的基因表达量检测方法分析菌丝用Ｈ２Ｏ２处理后的ＵｖＺＣ１基因表达情况ꎮ１.６.３㊀接种水稻后侵染初期ＵｖＺＣ１基因的表达㊀参照方法１.５用Ｊｔ２０９菌株接种两优培九ꎬ分别于接种后２４ｈ㊁４８ｈ取接种的稻穗ꎬ以接种前收集的菌丝为对照ꎮ参照方法１.６.１提取接种稻穗的ＲＮＡꎬ用荧光定量方法分析ＵｖＺＣ１在２个侵染时间点的表达情况ꎮ１.７㊀其他产分生孢子相关基因在ＵｖＺＣ１基因敲除突变体菌株中表达量的测定㊀㊀各取５粒Ｊｔ２０９和ＵｖＺＣ１敲除突变体菌碟ꎬ分别接种至含有５０ｍｌＹＴＳ培养液的１００ｍｌ三角瓶中ꎬ２８ħ㊁１６０ｒ/ｍｉｎ避光摇动培养５ｄ后ꎬ收集菌丝用于ＲＮＡ提取ꎮ按照１.６.１的方法分析其他产分生孢子相关基因在ＵｖＺＣ１基因敲除突变体菌株中的表达情况ꎮ每个反应设３个重复ꎬ同时本试验重复３次ꎮ被检测的其他产分生孢子相关基因及其引物见表２ꎮ２０４１江苏农业学报㊀２０２１年第３７卷第６期表２㊀其他产分生孢子相关基因及其表达量分析所用引物Ｔａｂｌｅ２㊀Ｔｈｅｐｒｉｍｅｒｓｏｆｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎ￣ｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｓａｐｐｌｉｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ基因㊀㊀引物㊀㊀㊀㊀引物序列(５ᶄң３ᶄ)㊀㊀ＵｖＣｏｍ１[７]ｑＵｖＣｏｍ１ＦＧＧＣＧＧＴＣＣＣＴＴＧＧＣＴＡＴｑＵｖＣｏｍ１ＲＣＧＡＴＴＣＧＡＣＡＧＴＡＣＧＡＴＡＡＡＣＵｖＨＯＧ１[８]ｑＵｖＨＯＧ１ＦＧＧＴＡＣＧＧＡＧＣＡＡＧＡＴＡＴＴＣＧｑＵｖＨＯＧ１ＲＴＣＡＴＣＡＡＣＡＣＣＡＴＣＧＣＡＡＧＵｖＳＬＴ２[１３]ｑＵｖＳＬＴ２ＦＧＣＧＴＴＧＣＣＡＴＣＡＡＧＡＡＡＧＴＣＡＣｑＵｖＳＬＴ２ＲＣＧＣＡＡＡＧＡＡＴＣＴＧＧＴＡＡＡＴＡＡＡＣＧ￣ＡＣＴＵｖＡｃ１[１４]ｑＵｖＡｃ１ＦＴＧＣＴＡＴＧＣＡＧＣＡＣＴＣＴＧＧＡＧＴＧＣＧＴｑＵｖＡｃ１ＲＣＧＡＡＡＧＡＧＴＣＡＡＧＡＡＴＣＡＧＡＧＣＣＡＴＵｖＣＤＣ２[１５]ｑＵｖＣＤＣ２ＦＣＧＴＣＡＣＴＴＣＡＴＡＣＣＣＣＧＡＣＴｑＵｖＣＤＣ２ＲＡＧＴＡＧＣＣＡＴＴＣＡＴＧＣＧＧＣＣＡＡＵｖＢＩ￣１[１６]ｑＵｖＢＩ￣１ＦＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＣＣＣＡＡＧＴＡＣｑＵｖＢＩ￣１ＲＡＣＧＣＴＧＣＴＣＣＴＣＧＴＣＴＧＧＴＣα￣ｔｕｂｕｌｉｎ￣１[８]ＵＶ￣α￣ｔｕｂｕｌｉｎ￣１ＦＡＧＧＴＴＧＣＧＴＴＧＡＡＧＧＡＧＧＴＴＵＶ￣α￣ｔｕｂｕｌｉｎ￣１ＲＧＡＧＧＴＧＧＡＧＴＴＧＣＣＧＡＴＡＡＡ２㊀结果与分析２.１㊀ＵｖＺＣ１基因在稻曲病病菌侵染早期的表达模式㊀㊀由图１可以看出ꎬＵｖＺＣ１基因在Ｊｔ２０９接种两优培九２４ｈ和４８ｈ后均有表达ꎬ且基因表达量在接种后随着接种时间的延长显著上升ꎬ接种２４ｈ㊁４８ｈ时分别为接种起始阶段的９ １倍㊁１６ ２倍ꎬ表明该基因参与稻曲病病菌早期侵染水稻的过程ꎮ∗表示接种后基因表达量与接种起始阶段存在显著差异(Ｐ<０ ０５)ꎮ图１㊀ＵｖＺＣ１基因在侵染早期的表达模式Ｆｉｇ.１㊀ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｏｆＵｖＺＣ１ｇｅｎｅｉｎｅａｒｌｙｓｔａｇｅｏｆｉｎ￣ｆｅｃｔｉｏｎ２.２㊀稻曲病病菌ＵｖＺＣ１基因的克隆与序列分析序列分析结果显示ꎬＵｖＺＣ１基因全长１４５８ｂｐꎬ不含内含子ꎬ编码４８５个氨基酸ꎮＵｖＺＣ１的预测编码蛋白质含有１个ＧＡＬ４(ｓｍａｒｔ０００６６)基序和１个Ｆｕｎｇａｌ＿ＴＦ＿ＭＨＲ(ｃｌ２３７６６)基序ꎬ与其他Ｚｎ(Ⅱ)２Ｃｙｓ６型转录因子相似ꎮ蛋白质同源性比较结果显示ꎬＵｖＺＣ１与金龟子绿僵菌(Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍａｎｉ￣ｓｏｐｌｉａｅ)㊁大孢绿僵菌(Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍｍａｊｕｓ)等子囊菌的Ｚｎ(Ⅱ)２Ｃｙｓ６型转录因子的相似度超过６５％ꎬ与其他丝状真菌Ｚｎ(Ⅱ)２Ｃｙｓ６蛋白的相似度也为５０％左右(图２)ꎮ因此确定ＵｖＺＣ１基因编码的蛋白质属于Ｚｎ(Ⅱ)２Ｃｙｓ６型转录因子ꎮＡ:ＵｖＺＣ１与其他真菌中Ｚｎ(Ⅱ)２Ｃｙｓ６转录因子(括号内数值表示ＵｖＺＣ１与其他蛋白质同源比较的ｉｄｅｎｔｉｔｙ值)的系统发育树分析ꎻＢ:ＵｖＺＣ１与其他真菌中Ｚｎ(Ⅱ)２Ｃｙｓ６转录因子的蛋白质结构分析ꎮ图２㊀ＵｖＺＣ１蛋白与其他真菌中同源蛋白的系统发育树和结构比较Ｆｉｇ.２㊀ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓꎬｐｒｏｔｅｉｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓａｎｄｍｏｔｉｆｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆＵｖＺＣ１ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｉｔｓｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｏｔｈｅｒｆｕｎｇｉ３０４１俞咪娜等:稻曲病病菌Ｚｎ２(Ⅱ)Ｃｙｓ６型转录因子ＵｖＺＣ１基因的克隆及功能分析２.３㊀ＵｖＺＣ１基因敲除和回补突变体的获得以野生型菌株Ｊｔ２０９为对照ꎬ经抗性筛选㊁特异性引物ＰＣＲ鉴定和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析ꎬ共获得２个基因敲除突变体菌株(әＵｖＺＣ１￣１９和әＵｖＺＣ１￣２０)ꎮ再以敲除突变体菌株әＵｖＺＣ１￣１９为初始菌株ꎬ回补ＵｖＺＣ１基因ꎬ获得２个基因回补菌株(ＵｖＺＣ１ｃ￣１和ＵｖＺＣ１ｃ￣２)ꎮ用ＲＴ￣ＵｖＺＣ１Ｆ/ＲＴ￣ＵｖＺＣ１Ｒ扩增Ｊｔ２０９㊁敲除突变体和回补菌株的ｃＤＮＡꎬ发现ＵｖＺＣ１在Ｊｔ２０９和回补菌株中表达ꎬ而在敲除突变体菌株中不表达ꎮ用ＨＰＨ基因特异性引物ｈｙｇ１.４Ｒ/ｈｙｇ１.４Ｆ只能从敲除突变体和回补菌株的基因组中扩增到目的片段ꎬ而在Ｊｔ２０９基因组中不能扩增到目的片段(图３)ꎮ上述结果表明ꎬ敲除突变体菌株中的ＵｖＺＣ１基因已经被潮霉素抗性基因成功替换ꎬ回补菌株中的ＵｖＺＣ１基因得到了回补ꎮＡ:ＵｖＺＣ１基因敲除载体构建ꎻＢ:Ｊｔ２０９菌株㊁ＵｖＺＣ１基因敲除突变体和回补菌株中ＵｖＺＣ１和ＨＰＨ基因ＰＣＲ检测ꎻＣ:Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交检测基因敲除突变体菌株中ＨＰＨ基因拷贝数ꎮａ:Ｊｔ２０９ꎻｂ:әＵｖＺＣ１ꎻｃ:әＵｖＺＣ１ｃꎻｄ:әＵｖＺＣ１￣１９ꎻｅ:әＵｖＺＣ１￣２０ꎻｆ:әＵｖＺＣ１￣６６ꎻＭ:Ｍａｒｋｅｒꎮ图３㊀稻曲病病菌Ｊｔ２０９菌株的ＵｖＺＣ１基因敲除Ｆｉｇ.３㊀ＫｎｏｃｋｏｕｔｏｆＵｖＺＣ１ｉｎＵｓｔｉｌａｇｉｎｏｉｄｅａｖｉｒｅｎｓＪｔ２０９ｓｔｒａｉｎ２.４㊀ＵｖＺＣ１基因对稻曲病病菌生长的影响由图４Ａ㊁图４Ｂ可以看出ꎬ在ＹＴＡ培养基上ꎬәＵｖＺＣ１￣１９㊁әＵｖＺＣ１￣２０的菌落直径分别为(３３.４４ʃ０ ２５)ｍｍ㊁(３３.７５ʃ０ ２７)ｍｍꎬ与Ｊｔ２０９的(３５.５５ʃ０ ４６)ｍｍ和回补菌株的(３５.７７ʃ０ ３２)ｍｍ相比显著下降ꎬ但各菌落间的形态没有明显差异ꎬ表明ＵｖＺＣ１基因敲除会影响稻曲病病菌的生长速率ꎬ但不影响菌落形态ꎮ由图４Ｃ可以看出ꎬ在０ ３ｍｏｌ/ＬＮａＣｌ㊁０ ３ｍｏｌ/ＬＫＣｌ㊁０ ８ｍｏｌ/ＬＤ￣山梨醇和７０μｇ/ｍｌ刚果红等非生物胁迫下ꎬＪｔ２０９㊁ＵｖＺＣ１基因敲除突变体菌株和回补菌株在生长抑制效果上没有显著差异ꎬ然而０ ００５％ＳＤＳ对ＵｖＺＣ１基因敲除突变体菌株的抑制率明显高于Ｊｔ２０９菌株和回补菌株ꎬ表明ＵｖＺＣ１基因参与调节稻曲病病菌细胞壁的完整性ꎮ２.５㊀ＵｖＺＣ１基因对稻曲病病菌响应氧化胁迫的影响㊀㊀分析Ｊｔ２０９㊁ＵｖＺＣ１基因敲除突变体菌株和回补菌株在含３ｍｍｏｌ/ＬＨ２Ｏ２培养基上的生长抑制率发现ꎬＵｖＺＣ１基因敲除突变体对氧化胁迫的耐受性高于Ｊｔ２０９菌株和回补菌株(图４Ａ㊁图４Ｃ)ꎻ而Ｊｔ２０９菌株中ＵｖＺＣ１基因的表达量在３ｍｍｏｌ/ＬＨ２Ｏ２处理１.０ｈ时显著上升(图５)ꎬ表明ＵｖＺＣ１可能参与调控稻曲病病菌响应氧化胁迫的过程ꎮ２.６㊀ＵｖＺＣ１基因对稻曲病病菌产分生孢子的影响由图６Ａ可以看出ꎬＪｔ２０９㊁ＵｖＺＣ１基因敲除突变体菌株和回补菌株摇动培养产生的分生孢子在形态㊁大小㊁萌发率等方面没有显著差异ꎬ但ＵｖＺＣ１基因敲除突变体菌株әＵｖＺＣ１￣１９和әＵｖＺＣ１￣２０产分生孢子数量较Ｊｔ２０９分别减少９１ １％和８９ ４％ꎮ由图６Ｂ可以看出ꎬ进一步分析ＵｖＺＣ１在稻曲病病菌分生孢子萌发和菌丝生长㊁分生孢子产生等不同阶段的基因表达情况发现ꎬＵｖＺＣ１在孢子萌发产生芽管及芽管伸长(萌发时间１８ｈ)㊁菌丝伸长(萌发时间２４ｈ)阶段的表达量与分生孢子时期没有显著差异ꎻ随着萌发的菌丝顶端新分生孢子的产生(萌发时间４８ｈ㊁７２ｈ)ꎬＵｖＺＣ１相对表达量与分生孢子时期相比逐渐上升ꎬ表明ＵｖＺＣ１参与了稻曲病病菌产分生孢子的过程ꎮ此外ꎬ检测已报道的稻曲病病菌产分生孢子其他相关基因的表达量发现ꎬ与Ｊｔ２０９相比ꎬＵｖＺＣ１基因敲除突变体菌株中ＵｖＡＣ１㊁ＵｖＳＬＴ２基因的相对表达量显著上升ꎬＵｖＣＤＣ２㊁ＵｖＣｏｍ１和ＵｖＨｏｇ１基因的相对表达量显著下降ꎬＵｖＢＩ￣１基因的相对表达量变化不显著(图６Ｃ)ꎮ上述结果表明ꎬＵｖＺＣ１可能通过调节稻曲病病菌多个产分子孢子相关基因ꎬ从而参与调控稻曲病病菌分生孢子的产生ꎮ４０４１江苏农业学报㊀２０２１年第３７卷第６期Ａ:Ｊｔ２０９菌株㊁ＵｖＺＣ１上不同非生物胁迫对菌株生长的抑制率ꎮ∗表示突变体菌株与其野生型菌株间存在显著差异(Ｐ<０ ０５)ꎮ图４㊀ＵｖＺＣ１基因敲除突变体菌株的生长表型Ｆｉｇ.４㊀ＧｒｏｗｔｈｐｈｅｎｏｔｙｐｅｏｆＵｖＺＣ１ｇｅｎｅｋｎｏｃｋｏｕｔｍｕｔａｎｔｓｔｒａｉｎ２.７㊀ＵｖＺＣ１基因对稻曲病病菌致病性的影响田间接种试验结果显示ꎬＪｔ２０９㊁ＵｖＺＣ１基因敲除突变体菌株和回补菌株在接种稻穗上产生的稻曲球数量无显著差异ꎬ稻曲球形态也无明显差异(图７)ꎬ表明ＵｖＺＣ１基因不影响稻曲球的产生ꎮ３㊀讨论本研究从稻曲病病菌中克隆到ＵｖＺＣ１基因ꎬ其编码蛋白质与其他真菌中的Ｚｎ(Ⅱ)２Ｃｙｓ６型转录因子在序列和结构域上有很高的相似性ꎬ均具有包含６个半胱氨酸的ＧＡＬ４基序ꎬ可以结合２个锌离子ꎬ表明ＵｖＺＣ１蛋白是典型的Ｚｎ(Ⅱ)２Ｃｙｓ６型转录因子[９]ꎮＺｎ(Ⅱ)２Ｃｙｓ６转录因子为仅存于真菌中的锌簇蛋白ꎬ在酿酒酵母(Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ)中ꎬ含Ｚｎ(Ⅱ)２Ｃｙｓ６基序的Ｍｏｃ３蛋白可以与其他蛋白质互作ꎬ参与调控酵母有性生殖和ＤＮＡ完整性[１７￣１８]ꎮ在丝状真菌中ꎬ这类蛋白质参与真菌菌丝生长㊁产分生孢子㊁致病力及对不良环境的响应等过程ꎬ具有多种调节功能ꎬ但在不同真菌中的功能存在差异[１９￣２４]ꎮ∗表示３ｍｍｏｌ/ＬＨ２Ｏ２处理Ｊｔ２０９菌株后ＵｖＺＣ１基因表达量与处理前存在显著差异(Ｐ<０ ０５)ꎮ图５㊀稻曲病病菌在３ｍｍｏｌ/ＬＨ２Ｏ２胁迫下ＵｖＺＣ１基因的表达Ｆｉｇ.５㊀ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＵｖＺＣ１ｇｅｎｅｕｎｄｅｒ３ｍｍｏｌ/ＬＨ２Ｏ２ｓｔｒｅｓｓｉｎＵ.ｖｉｒｅｎｓ㊀㊀稻曲病病菌ＵｖＺＣ１基因敲除突变体菌株与野生型菌株相比ꎬ菌丝生长速度减慢ꎬ产分生孢子量减少ꎬ表明ＵｖＺＣ１基因参与了稻曲病病菌生长和产分５０４１俞咪娜等:稻曲病病菌Ｚｎ２(Ⅱ)Ｃｙｓ６型转录因子ＵｖＺＣ１基因的克隆及功能分析Ａ:不同菌株的产孢量ꎻＢ:ＵｖＺＣ１基因在分生孢子不同萌发阶段的表达量ꎻＣ:ＵｖＺＣ１基因敲除突变体菌株中稻曲病病菌其他产分生孢子相关基因表达量ꎮ∗表示在突变体菌株与野生型菌株间存在显著差异(Ｐ<０ ０５)ꎮ图６㊀ＵｖＺＣ１基因敲除对稻曲病病菌产分生孢子的影响Ｆｉｇ.６㊀ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＵｖＺＣ１ｇｅｎｅｋｎｏｃｋｏｕｔｏｎｃｏｎｉｄｉａｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＵ.ｖｉｒｅｎｓＡ:接种后稻穗产稻曲球症状ꎻＢ:每穗平均稻曲球数ꎮ图７㊀ＵｖＺＣ１基因敲除对稻曲病病菌致病力的影响Ｆｉｇ.７㊀ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＵｖＺＣ１ｇｅｎｅｋｎｏｃｋｏｕｔｏｎｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙｏｆＵ.ｖｉｒｅｎｓ生孢子过程ꎮ真菌产分生孢子是多基因参与的过程ꎬ在稻曲病病菌中ꎬ已有报道显示ꎬ编码腺苷酸环化酶(ＵｖＡｃ１)㊁蛋白激酶(ＵｖＳＬＴ２和ＵｖＣＤＣ２)㊁转录因子(ＵｖＣＯＭ１和ＵｖＨＯＧ１)㊁效应因子(ＵｖＢＩ￣１)等蛋白质的基因敲除均导致稻曲病病菌的产分生孢子量下降[７￣８ꎬ１３￣１４ꎬ１６]ꎮ本研究发现ꎬＵｖＺＣ１基因正调控基因ＵｖＡｃ１和ＵｖＳＬＴ２的表达ꎬ负调控基因ＵｖＣＤＣ２㊁ＵｖＣｏｍ１和ＵｖＨｏｇ１的表达ꎬ可见稻曲病病菌产分生孢子也是多基因参与的过程ꎬＵｖＺＣ１作为转录因子参与调节多个稻曲病病菌产分生孢子相关基因的表达ꎮ此外ꎬＵｖＺＣ１基因敲除突变体菌株对由ＮａＣｌ㊁ＫＣｌ和Ｓｏｒｂｉｔｏｌ等引起的盐胁迫和渗透压胁迫的响应与野生型没有显著差异ꎬ表明ＵｖＺＣ１不参与调节稻曲病病菌对盐胁迫和渗透压胁迫的响应[１１]ꎮ刚果红通过阻止细胞壁葡聚糖链之间的横向作用来影响细胞壁的完整性ꎬ而ＳＤＳ能使细胞壁变脆弱ꎬ从而裂解细胞ꎮＵｖＺＣ１基因敲除突变体菌株对ＳＤＳ的耐受性降低ꎬ表明ＵｖＺＣ１参与调控稻曲病病菌细胞壁的完整性ꎬ但不影响稻曲病病菌细胞壁葡聚糖链之间的互作ꎮ病原菌侵染寄主植物时会诱导其产生一系列防卫反应来抵御病原菌的侵染[２５￣２６]ꎬ活性氧是侵染早期寄主的重要防卫反应物质之一[２７]ꎮ本研究中ꎬＨ２Ｏ２可以诱导稻曲病病菌ＵｖＺＣ１基因的表达ꎬ同时６０４１江苏农业学报㊀２０２１年第３７卷第６期ＵｖＺＣ１敲除突变体菌株对Ｈ２Ｏ２的耐受性较野生型增强ꎬ表明ＵｖＺＣ１蛋白参与稻曲病病菌响应氧化胁迫的过程ꎮ通过检测侵染阶段ＵｖＺＣ１基因的表达量发现ꎬＵｖＺＣ１基因表达量在接种后２４ｈ和４８ｈ即侵染早期显著上升ꎮ然而Ｊｔ２０９㊁ＵｖＺＣ１敲除突变体菌株和回补菌株在水稻上产生的稻曲球数量和形态没有明显差异ꎬ说明该基因不影响稻曲病病菌稻曲球的产生ꎮ可能由于从稻曲病病菌基因组中已经预测到９０多个Ｃ６转录因子[１]ꎬ它们之间存在功能冗余现象ꎬ即在ＵｖＺＣ１缺失时ꎬ稻曲病病菌的其他Ｃ６转录因子基因能够部分替代ＵｖＺＣ１行使功能ꎬ导致最终表现为致病力无明显改变[２８￣２９]ꎮ综上所述ꎬＵｖＺＣ１参与了稻曲病病菌生长㊁分生孢子产生㊁响应氧化胁迫和细胞壁完整性建成㊁侵染水稻等过程ꎬ这对认识稻曲病病菌Ｚｎ(Ⅱ)２Ｃｙｓ６型转录因子功能具有重要意义ꎮ参考文献:[１]㊀ＳＵＮＷＸꎬＦＡＮＪꎬＦＡＮＧＡＦꎬｅｔａｌ.Ｕｓｔｉｌａｇｉｎｏｉｄｅａｖｉｒｅｎｓ:ｉｎ￣ｓｉｇｈｔｓｉｎｔｏａｎｅｍｅｒｇｉｎｇｒｉｃｅｐａｔｈｏｇｅｎ[Ｊ].ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＰｈｙｔｏ￣ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ２０２０ꎬ５８:３６３￣３８５.[２]㊀ＦＡＮＪꎬＹＡＮＧＪꎬＷＡＮＧＹＱꎬｅｔａｌ.ＣｕｒｒｅｎｔｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇｏｎＶｉｌｌｏｓｉｃｌａｖａｖｉｒｅｎｓꎬａｕｎｉｑｕｅｆｌｏｗｅｒ￣ｉｎｆｅｃｔｉｎｇｆｕｎｇｕｓｃａｕｓｉｎｇｒｉｃｅｆａｌｓｅｓｍｕｔｄｉｓｅａｓｅ[Ｊ].ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌｏｇｙꎬ２０１６ꎬ１７(９):１３２１￣１３３０.[３]㊀李小娟ꎬ刘二明ꎬ肖启明ꎬ等.水稻对稻曲病抗性的分级及相应级别的产量损失[Ｊ].湖南农业大学学报(自然科学版)ꎬ２０１１ꎬ３７(３):２７５￣２７９.[４]㊀ＭＥＮＧＪＪꎬＧＵＧꎬＤＡＮＧＰＱꎬｅｔａｌ.Ｓｏｒｂｉｃｉｌｌｉｎｏｉｄｓｆｒｏｍｔｈｅｆｕｎ￣ｇｕｓＵｓｔｉｌａｇｉｎｏｉｄｅａｖｉｒｅｎｓａｎｄｔｈｅｉｒｐｈｙｔｏｔｏｘｉｃꎬｃｙｔｏｔｏｘｉｃꎬａｎｄａｎｔｉ￣ｍｉｃｒｏｂｉａｌａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ２０１９ꎬ７:４３５. [５]㊀ＬＩＹＪꎬＷＡＮＧＭꎬＬＩＵＺＨꎬｅｔａｌ.Ｔｏｗａｒｄｓｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇｔｈｅｂｉ￣ｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｐａｔｈｗａｙｆｏｒｕｓｔｉｌａｇｉｎｏｉｄｉｎｍｙｃｏｔｏｘｉｎｓｉｎＵｓｔｉｌａｇｉｎｏｉｄｅａｖｉｒｅｎｓ[Ｊ].ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ２０１９ꎬ２１(８):２６２９￣２６４３.[６]㊀ＹＵＪＪꎬＹＵＭＮꎬＳＯＮＧＴＱꎬｅｔａｌ.ＡｈｏｍｅｏｂｏｘｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＵｖＨＯＸ２ｒｅｇｕｌａｔｅｓｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒｅｆｏｒｍａｔｉｏｎꎬｃｏｎｉｄｉｏｇｅｎｅｓｉｓꎬａｎｄｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙｉｎＵｓｔｉｌａｇｉｎｏｉｄｅａｖｉｒｅｎｓ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＭｉｃｒｏ￣ｂｉｏｌｏｇｙꎬ２０１９ꎬ１０:１０７１.[７]㊀ＣＨＥＮＸꎬＨＡＩＤꎬＴＡＮＧＪꎬｅｔａｌ.ＵｖＣｏｍ１ｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｅｇｕｌａ￣ｔｏｒｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎｔｈｅｒｉｃｅｆａｌｓｅｓｍｕｔｆｕｎｇｕｓＵｓｔｉｌａｇｉｎｏｉｄｅａｖｉｒｅｎｓ[Ｊ].Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ２０２０ꎬ１１０(２):４８３￣４９３.[８]㊀ＺＨＥＮＧＤＷꎬＷＡＮＧＹꎬＨＡＮＹꎬｅｔａｌ.ＵｖＨＯＧ１ｉｓｉｍｐｏｒｔａｎｔｆｏｒｈｙｐｈａｌｇｒｏｗｔｈａｎｄｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｅｓｉｎｔｈｅｒｉｃｅｆａｌｓｅｓｍｕｔｆｕｎｇｕｓＵｓｔｉｌａｇｉｎｏｉｄｅａｖｉｒｅｎｓ[Ｊ].ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｐｏｒｔｓꎬ２０１６ꎬ６:２４８２４.[９]㊀ＭＡＣＰＨＥＲＳＯＮＳꎬＬＡＲＯＣＨＥＬＬＥＭꎬＴＵＲＣＯＴＴＥＢ.Ａｆｕｎｇａｌｆａｍｉｌｙｏｆｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ:ｔｈｅｚｉｎｃｃｌｕｓｔｅｒｐｒｏｔｅｉｎｓ[Ｊ].ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＲｅｖｉｅｗｓꎬ２００６ꎬ７０(３):５８３￣６０４.[１０]ＺＨＡＮＧＹꎬＺＨＡＮＧＫꎬＦＡＮＧＡꎬｅｔａｌ.ＳｐｅｃｉｆｉｃａｄａｐｔａｔｉｏｎｏｆＵｓｔｉｌａｇｉｎｏｉｄｅａｖｉｒｅｎｓｉｎｏｃｃｕｐｙｉｎｇｈｏｓｔｆｌｏｒｅｔｓｒｅｖｅａｌｅｄｂｙｃｏｍｐａｒａ￣ｔｉｖｅａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｅｎｏｍｉｃｓ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓꎬ２０１４ꎬ５:３８４９.[１１]ＹＵＭＮꎬＹＵＪＪꎬＨＵＪＫꎬｅｔａｌ.Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ￣ｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｓｉｎｔｈｅｒｉｃｅｐａｔｈｏｇｅｎＵｓｔｉｌａｇｉｎｏｉｄｅａｖｉｒｅｎｓｔｈｒｏｕｇｈｒａｎｄｏｍｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ[Ｊ].ＦｕｎｇａｌＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０１５ꎬ７６:１０￣１９.[１２]张君成ꎬ陈志谊ꎬ张炳欣ꎬ等.稻曲病的接种技术研究[Ｊ].植物病理学报ꎬ２００４ꎬ３４(５):４６３￣４６７.[１３]ＬＩＡＮＧＹＦꎬＨＡＮＹꎬＷＡＮＧＣＦꎬｅｔａｌ.ＴａｒｇｅｔｅｄｄｅｌｅｔｉｏｎｏｆｔｈｅＵＳＴＡａｎｄＵｖＳＬＴ２ｇｅｎｅｓｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙｉｎＵｓｔｉｌａｇｉｎｏｉｄｅａｖｉｒｅｎｓｗｉｔｈｔｈｅＣＲＩＳＰＲ￣Ｃａｓ９ｓｙｓｔｅｍ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０１８ꎬ９:６９９.[１４]ＧＵＯＷＷꎬＧＡＯＹＸꎬＹＵＺＭꎬｅｔａｌ.ＴｈｅａｄｅｎｙｌａｔｅｃｙｃｌａｓｅＵｖＡｃ１ａｎｄｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅＵｖＰｄｅＨｃｏｎｔｒｏｌｔｈｅｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｃＡＭＰｌｅｖｅｌꎬｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔꎬａｎｄｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙｏｆｔｈｅｒｉｃｅｆａｌｓｅｓｍｕｔｆｕｎｇｕｓＵｓｔｉｌａｇｉｎｏｉｄｅａｖｉｒｅｎｓ[Ｊ].ＦｕｎｇａｌＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０１９ꎬ１２９:６５￣７３.[１５]ＴＡＮＧＪＴꎬＢＡＩＪꎬＣＨＥＮＸＹꎬｅｔａｌ.ＴｗｏｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｓＵｖＰｍｋ１ａｎｄＵｖＣＤＣ２ｗｉｔｈｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｆｕｎｃｔｉｏｎｓｉｎｃｏｎｉｄｉａｔｉｏｎꎬｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｅａｎｄｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙｏｆｒｉｃｅｆａｌｓｅｓｍｕｔｆｕｎｇｕｓＵｓｔｉｌａｇｉ￣ｎｏｉｄｅａｖｉｒｅｎｓ[Ｊ].ＣｕｒｒｅｎｔＧｅｎｅｔｉｃｓꎬ２０２０ꎬ６６(１０):４０９￣４２０. [１６]ＸＩＥＳＬꎬＷＡＮＧＹＦꎬＷＥＩＷꎬｅｔａｌ.ＴｈｅＢａｘｉｎｈｉｂｉｔｏｒＵｖＢＩ￣１ꎬａｎｅｇａｔｉｖｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｏｆｍｙｃｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈａｎｄｃｏｎｉｄｉａｔｉｏｎꎬｍｅｄｉａｔｅｓｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｅａｎｄｉｓｃｒｉｔｉｃａｌｆｏｒｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙｏｆｔｈｅｒｉｃｅｆａｌｓｅｓｍｕｔｆｕｎｇｕｓＵｓｔｉｌａｇｉｎｏｉｄｅａｖｉｒｅｎｓ[Ｊ].ＣｕｒｒｅｎｔＧｅｎｅｔｉｃｓꎬ２０１９ꎬ６５(５):１１８５￣１１９７.[１７]ＧＯＬＤＡＲＭＭꎬＪＥＯＮＧＨＴꎬＴＡＮＡＫＡＫꎬｅｔａｌ.Ｍｏｃ３ꎬａｎｏｖｅｌＺｎｆｉｎｇｅｒｔｙｐｅｐｒｏｔｅｉｎｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｓｅｘｕａｌｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔꎬａｓｃｕｓｆｏｒ￣ｍａｔｉｏｎꎬａｎｄｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｅｏｆＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ[Ｊ].ＣｕｒｒｅｎｔＧｅｎｅｔｉｃｓꎬ２００５ꎬ４８(６):３４５￣３５５.[１８]ＣＡＭＰＢＥＬＬＲＮꎬＬＥＶＥＲＮＴＺＭＫꎬＲＹＡＮＬＡꎬｅｔａｌ.Ｍｅｔａｂｏｌｉｃｃｏｎｔｒｏｌｏｆｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ:ｐａｒａｄｉｇｍｓａｎｄｌｅｓｓｏｎｓｆｒｏｍＳｃｈｉｚｏｓａｃ￣ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ[Ｊ].ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌꎬ２００８ꎬ４１４(２):１７７￣１８７.[１９]ＬＵＪＰꎬＣＡＯＨＪꎬＺＨＡＮＧＬＬꎬｅｔａｌ.ＳｙｓｔｅｍａｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆＺｎ２Ｃｙｓ６ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｐａｔｈｏ￣ｇｅｎｉｃｉｔｙｂｙｈｉｇｈ￣ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｇｅｎｅｋｎｏｃｋｏｕｔｉｎｔｈｅｒｉｃｅｂｌａｓｔｆｕｎｇｕｓ[Ｊ].ＰＬｏＳＰａｔｈｏｇｅｎｓꎬ２０１４ꎬ１０(１０):ｅ１００４４３２.[２０]ＨＡＧＩＷＡＲＡＤꎬＭＩＵＲＡＤꎬＳＨＩＭＩＺＵＫꎬｅｔａｌ.ＡｎｏｖｅｌＺｎ２Ｃｙｓ６ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＡｔｒＲｐｌａｙｓａｋｅｙｒｏｌｅｉｎａｎａｚｏｌｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓｂｙｃｏ￣ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｃｙｐ５１Ａａｎｄｃｄｒ１Ｂｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ[Ｊ].ＰＬｏＳＰａｔｈｏｇｅｎｓꎬ２０１６ꎬ１３(１):ｅ１００６０９６.[２１]ＳＯＮＨꎬＳＥＯＹＳꎬＭＩＮＫꎬｅｔａｌ.Ａｐｈｅｎｏｍｅ￣ｂａｓｅｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａ￣７０４１俞咪娜等:稻曲病病菌Ｚｎ２(Ⅱ)Ｃｙｓ６型转录因子ＵｖＺＣ１基因的克隆及功能分析ｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｉｎｔｈｅｃｅｒｅａｌｈｅａｄｂｌｉｇｈｔｆｕｎｇｕｓＦｕ￣ｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ[Ｊ].ＰＬｏＳＰａｔｈｏｇｅｎｓꎬ２０１１ꎬ７(１０):ｅ１００２３１０.[２２]ＬＯＮＧＮＢꎬＯＲＡＳＣＨＴꎬＺＨＡＮＧＳＺꎬｅｔａｌ.ＴｈｅＺｎ２Ｃｙｓ６￣ｔｙｐｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＬｅｕＢｃｒｏｓｓ￣ｌｉｎｋｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｌｅｕｃｉｎｅｂｉｏｓｙｎ￣ｔｈｅｓｉｓａｎｄｉｒｏｎａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎｉｎＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ[Ｊ].ＰＬｏＳＧｅ￣ｎｅｔｉｃｓꎬ２０１８ꎬ１４(１０):ｅ１００７７６２.[２３]ＺＨＡＯＣＺꎬＷＡＡＬＷＩＪＫＣꎬＤＥＷＩＴＰＪＧＭꎬｅｔａｌ.ＥＢＲ１ꎬａｎｏｖｅｌＺｎ２Ｃｙｓ６ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒꎬａｆｆｅｃｔｓｖｉｒｕｌｅｎｃｅａｎｄａｐｉｃａｌｄｏｍｉｎａｎｃｅｏｆｔｈｅｈｙｐｈａｌｔｉｐｉｎＦｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ[Ｊ].Ｍｏｌｅｃ￣ｕｌａｒＰｌａｎｔ￣ＭｉｃｒｏｂｅＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓꎬ２０１１ꎬ２４(１２):１４０７￣１４１８. [２４]ＧＡＲＧＡꎬＧＯＬＤＧＵＲＹꎬＳＣＨＷＥＲＢꎬｅｔａｌ.Ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅｓｔｒｕｃｔｕｒ￣ａｌｂａｓｉｓｆｏｒＤＮＡｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｂｙｔｈｅｆｉｓｓｉｏｎｙｅａｓｔＺｎ２Ｃｙｓ６ｔｒａｎｓｃｒｉｐ￣ｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＰｈｏ７ａｎｄｉｔｓｒｏｌｅｉｎｐｈｏｓｐｈａｔｅｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ[Ｊ].ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈꎬ２０１８ꎬ４６(２１):１１２６２￣１１２７３.[２５]罗丽芬ꎬ江冰冰ꎬ邓琳梅ꎬ等.三七根系分泌物中几种成分对根腐病原菌生长的影响[Ｊ].南方农业学报ꎬ２０２０ꎬ５１(１２):２９５２￣２９６１.[２６]刘一贤ꎬ蔡志英ꎬ施玉萍ꎬ等.辣木果腐病病原菌兰生炭疽菌(Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔｉ)生物学特性及其防治药剂室内毒力测定[Ｊ].江苏农业科学ꎬ２０１９ꎬ４７(２０):１３３￣１３７.[２７]ＲＨＥＥＳＧ.Ｈ２Ｏ２ꎬａｎｅｃｅｓｓａｒｙｅｖｉｌｆｏｒｃｅｌｌｓｉｇｎａｌｉｎｇ[Ｊ].Ｓｃｉ￣ｅｎｃｅꎬ２００６ꎬ３１２(５７８２):１８８２￣１８８３.[２８]ＷＡＧＮＥＲＡ.Ｇｅｎｅｔｉｃｒｅｄｕｎｄａｎｃｙｃａｕｓｅｄｂｙｇｅｎｅｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎｓａｎｄｉｔｓｅｖｏｌｕｔｉｏｎｉｎｎｅｔｗｏｒｋｓｏｆｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ[Ｊ].Ｂｉｏｌｏｇｉ￣ｃａｌＣｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓꎬ１９９６ꎬ７４(６):５５７￣５６７.[２９]ＷＡＧＮＥＲＡ.Ｒｅｄｕｎｄａｎｔｇｅｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎｓａｎｄｎａｔｕｒａｌｓｅｌｅｃｔｉｏｎ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙＢｉｏｌｏｇｙꎬ１９９９ꎬ１２(１):２６４６￣２６５８.(责任编辑:徐㊀艳)８０４１江苏农业学报㊀２０２１年第３７卷第６期。

水稻稻曲病的综合防治方法及对策尹西鹏（安徽省霍山县落儿岭镇农技综合服务中心邮编 237283）摘要稻曲病主要危害水稻穗部的单个谷粒,对水稻的产量影响很大。

而我地在处暑前后有一段时间的连阴雨，若逢此期间抽穗扬花的水稻田，此病较重发生。

杂交稻由于杂交稻开花时颖壳开张角度大，时间也较长，柱头外露率也高，致使较常规稻发病重。

十几年基层农技推广工作经验积累，今特撰写此文章供当地水稻生产者参考。

关键词稻曲病对策菌核防效1 概述：水稻稻曲病(rice false smut)又称黑穗病、绿黑穗病、谷花病、青粉病,俗称"丰产果"，其拉丁学名:Ustilaginoideavirens(Cooke)Tak，由于感病后的稻曲表面厚垣孢子粉状，因风雨或手动而脱落成粉雾，故我地也称该病为“灰包病”。

近年来,由于高产杂交品种大面积种植及稻田施氮量的增加,稻曲病已成为我地水稻生产上常见的主要病害之一,特别是在里山区稻曲病呈逐年加重的趋势,严重影响水稻的产量及稻米品质。

稻曲病不仅影响产量，且因病菌含有毒色素，对人体的健康有不良影响。

其发病轻重的主要因素与气候、氮肥、品种有关。

2 为害症状水稻抽穗扬花期感病，病菌为害穗上部分谷粒（图一、图二所示）。

初见颖谷合缝处，露出淡黄绿色块状物，逐渐膨大，最后包裹全颖壳，形成“稻曲”，形状比健谷大3-4倍，近似球形，为墨绿色，表面平滑，后开裂，散出墨绿色粉末，即病菌的厚垣孢子。

图一稻曲病的病稻穗图二稻曲病的病稻粒病原菌形态特征:谷粒内长出的球状稻曲，是病菌的孢子座。

剖开孢子座，中心白色，其外围分三层，外层墨绿色，第二层橙黄色，第三层淡黄色。

病菌的厚垣孢子侧生于孢子座内放射状菌丝上，有小柄，墨绿色，球形或椭圆形，表面有瘤状突起。

有的孢子座在其中心常可形成1～4个不等的菌核，为黑色长椭圆形，成熟时落入田间越冬。

3 发病特点病菌以菌核在土壤中及厚垣孢子在病粒上越冬，次年夏秋之间，菌核抽出子座，内生子囊孢子；厚垣孢子萌发产生分生孢子。