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CMV启动子与艾美耳球虫基因侧翼序列对黄色荧光蛋白表达调控作用的研究

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第31卷第6期江西农业大学学报Vol.31,No.6

2009年12月ActaAgriculturaeUniversitatisJiangxiensisDec.,2009

文章编号:

1000-2286(2009)06-1113-03

CMV启动子与艾美耳球虫基因侧翼序列对黄色荧光蛋白表达调控作用的研究

李继东1,丁林军2,何生虎1(1.宁夏大学农学院,宁夏银川750021;2.吴忠市金银滩镇畜牧兽医站,宁夏吴忠751100)摘要:探索CMV启动子与艾美耳球虫基因侧翼序列对串联型黄色荧光蛋白(YFP)表达的调控作用,将含有串联型YFP、CMV启动子、柔嫩艾美耳球虫组蛋白4(Histone4)上游启动序列和肌动蛋白(Actin)下游调控序列的重组载体pCMV-YFP-YFP、pH4-YFP-YFP-ACT电转染Vero细胞和柔嫩艾美耳球虫子孢子,观察荧光情况。结果证明,CMV启动子不能驱动YFP在柔嫩艾美耳球虫中正常表达,而其自身基因的侧翼序列能够启动和调控串联型YFP在柔嫩艾美耳球虫中的正常表达。

关键词:黄色荧光蛋白;柔嫩艾美耳球虫;电转染中图分类号:Q786 文献标识码:A

RegulationofYellowFluorescentProteinExpressionbyCMVPromoterandGeneticFlankingSequencesofEimeria

LIJi-dong1,DINGLin-jun2,HESheng-hu1 (1.AgriculturalCollege,NingxiaUniversity,Yinchuan750021,China;2.JinyintanTownAnimalHus2bandryandVeterinaryStation,Wuzhong751100,China)

Abstract:Toexploretheregulationoftandemrepeatedyellowfluoresentprotein(YFP)expressioninVe2rocellsandsporozoitesofEimeria,therecombinantvectorspCMV-YFP-YFPwhichcontainstandemrepeat2edYFPandCMVpromoter,andpH4-YFP-YFP-ACTwhichcontainstandemrepeatedYFPtoo,upstreamflankingsequenceofHistone4(H4)anddownstreamregulatorysequenceofActinbothderivedfromE.tenel

2

lagenomicDNA,weretransfectedintoVerocellsandsporozoitesofE.tenellabyelectroporation.Yellowflu2orescencewithincellsandparasiteswereobservedbyvirtueoffluorescencemicroscope,WhichindicatedthatgeneticflankingsequencesofE.tenellacouldpromotefunctionalexpressionoftandemYFPgeneinE.tenel

2

la,onthecontrary,CMVpromotercouldnot.Keywords:yellowfluorescentprotein;Eimeriatenella;electroporationtransfection

广泛应用于真核细胞表达载体的启动子CMV、SV40多聚腺苷酸化信号都是有利于外源基因在哺乳动物细胞中表达的。有研究表明,在球虫等低等真核生物中pCMV、SV40polyA信号基本没有功能[1～3],因此为了研究外源基因在球虫中的表达,就需要在表达载体中插入球虫自己的转录起始和调控

序列以及翻译起始区,包括启动子、增强子、polyA信号等。本试验旨在探索CMV启动子与柔嫩艾美耳球虫基因启动与调控序列对串联型黄色荧光蛋白在Vero细胞和柔嫩艾美耳球虫子孢子中表达的调控。

收稿日期:2009-10-13 修回日期:2009-11-06

基金项目:宁夏自然科学基金资助项目(NZ0708)作者简介:李继东(1976-),男,讲师,硕士,主要从事动物疾病诊断和寄生虫学研究,E-mail:lijidong@gmail.com。

江西农业大学学报第31卷

图1　重组载体pCMV-YFP-YFP和pH4-YFP-YFP-ACT结构Fig.1　StructuralschematicofrecombinantvectorpCMV-YFP-YFPandpH4-YFP-YFP-ACT

图2　pCMV-YFP-YFP转染Vero细胞后表达黄色荧光蛋白的观察Fig.2　ObservationofYFPexpressedinVerocellsaftertransfectionwithplasmidpCMV-YFP-YFP 左:荧光激发条件下;右:明场下的对照。

1　材料与方法1.1　试验材料1.1.1　重组载体　pCMV-YFP-YFP、pH4-YFP-YFP-ACT以真核表达载体pd2EYFP-N1(购自

BD公司)为母体构建,其中pH4-YFP-YFP-ACT启动子元件为柔嫩艾美耳球虫Histone4基因启动序列,并将SV40polyA信号序列替换为柔嫩艾美耳球虫Actin基因下游调控序列。结构如图1所示。

1.1.2　Vero细胞、MDBK细胞　柔嫩艾美耳球虫卵囊的传代与孢子化、子孢子的提取与纯化方法见文献[4]。1.2　Vero细胞的电转染将生长到对数中期或晚期的Vero细胞,用培养基(如DMEM)或磷酸盐缓冲液重悬至2.5×106～2.5×107个/mL。将400μL细胞悬液、10～30μg(体积最大可至40μL)的质粒DNA加入4mm的电

转化池,并混匀。以电容量为1100μF、电压220～230V、内部阻抗∞的电转化参数进行电击。将电转后的细胞转移至培养皿中,用等体积的培养基洗涤电转化池,洗液加入培养皿。培养皿置于含50mL/L

～70mL/LCO2的37℃孵箱培养至24～72h,分别在不同时间观察转染结果。在荧光显微镜下用激发波长最大513nm的条件进行观察。1.3　柔嫩艾美耳球虫子孢子的电转染电转染前1d将MDBK细胞传代,

37℃、50mL/LCO2条件下培养18～

24h,使80%左右的MDBK细胞汇集至单层。电击样品小室总容积800μL,电击杯直径0.4cm。每个电击杯中加入40μg质粒、1.0×107个子孢子,最后用

电击缓冲液cytomix定容至800μL,充分混合之后,在预置电压2.0kV、电容25μF、电阻∞的条件下进行电穿孔转染。转染后的子孢子室温放置20min,

然后将电击后的子孢子接种到MDBK

细胞(接种之前,细胞用0.1mol/L、pH7.2的PBS洗2次)上,在含有10%(v/v)胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺和200U/mL青霉素、20mg/mL链霉素的DMEM培养基中置于41℃、50mL/LCO2培养箱中培养[1]。

2　结果与分析2.1　重组载体在Vero细胞中的电转染结果重组载体pCMV-YFP-YFP、pH4-YFP-YFP-ACT通过电穿孔转染Vero细胞,在转染后24～72

h观察结果。结果表明,pCMV-YFP-YFP在转染后24h即有荧光蛋白开始表达(图2),而pH4-YFP

・4111・第6期李继东等:CMV启动子与艾美耳球虫基因侧翼序列对黄色荧光蛋白表达调控作用的研究图3　pH4-YFP-YFP-ACT转染柔嫩艾美耳球虫子孢子后表达黄色荧光蛋白的观察Fig.3　ObservationofYFPexpressedinE.tenellasporozoitesaftertransfectionwithplasmidpH4-YFP-YFP-ACT 左:荧光激发条件下;右:明场下的对照。

-YFP-ACT则没有观测到荧光。2.2　重组载体在柔嫩艾美耳球虫子孢子中的电转染结果重组载体pCMV-YFP-YFP、pH4-YFP-YFP-ACT电转染柔嫩艾美耳球虫子孢子,其中pH4-

YFP-YFP-ACT在转染后19h子孢子中即有YFP表达,在513nm

激发条件下可见明亮黄绿色荧光(图3)。而pCMV-YFP-YFP转

染子孢子则没有观测到荧光。

3　讨　论外源基因在受体细胞中的表达必须符合分子生物学的基本原理,

因此携带外源基因的表达载体的构建就必需包含一些基本的元件,主要有转录起始区(调控序列+启动子)、翻译起始区(核糖体结合序列和起始密码子)、转录终止区(终止子和polyA信号),这些元件使得基因的转录和翻译能够正常进行[1,5]。CMV启动子是广泛应用于真核细胞转染的强启动子,在弓形虫和疟原虫的转基因研究中,CMV启动子几乎未被采用,主要是由于现有的研究表明CMV无法启动这类基因的表达[1,6～8]。本实验中CMV

启动子未能驱动串联型黄色荧光蛋白在柔嫩艾美耳球虫子孢子中的表达,与相关研究结果一致[9～11]。与此同时,柔嫩艾美耳球虫组蛋白4上游启动序列和肌动蛋白下游调控序列可以启动并调控串联型YFP在球虫中的表达,但在Vero细胞中,却没有检测到相应的启动功能,可能是启动功能太低,不能产生有效的表达;或是没有启动功能,还需进一步的试验来验证。此外,本试验中Histone4基因的上游序列还需进一步通过突变和足纹法确定启动子元件。在球虫基因启动与调控序列的选择上,本试验侧重于对持家基因和高表达基因侧翼序列的选择,其中Histone4和Actin为持家基因,是生物正常生命活动不可缺少的,这样选择的意图是为了让报告基因获得高效表达。在构建载体时,选取包含90bpORF的Histone4上游序列约2.0kb,以保证启动序列中重要部件的完整性[1,12]。下游调控序列选取肌动蛋白基因下游约2.0kb,软件预测该序列中包括Poly

A信号、转录终止信号以及对于转录后mRNA稳定性相关的序列元件。因此,上述载体构建策略保证了柔嫩艾美耳球虫子孢子瞬间转染结果的顺利观察,试验结果同样验证了这一点。

参考文献:

[1]KelleherM,TomleyFM.Transientexpressionofbeta-galactosidaseindifferentiatingsporozoitesofEimeriatenella[J].MolBiochemParasitol,1998,97(1-2):21-31.[2]vanDijkMR,WatersAP,JanseCJ.Stabletransfectionofmalariaparasitebloodstages[J].Science,1995,268(5215):1358-1362.[3]KimK,EatonMS,SchubertW,etal.OptimizedexpressionofgreenfluorescentproteininToxoplasmagondiiusingthermo2stablegreenfluorescentproteinmutants[J].MolBiochemParasitol,2001,113(2):309-313.[4]索勋,李国清.鸡球虫病学[M].北京:中国农业大学出版社,1998:116-148.[5]LewinB.GenesIX[M].北京:科学出版社,2007:609-666.[6]WuY,SifriCD,LeiHH,etal.TransfectionofPlasmodiumfalciparumwithinhumanredbloodcells[J].ProcNatlAcadSciUSA,1995,92(4):973-977.[7]StriepenB,HeCY,MatrajtM,etal.Expression,selection,andorganellartargetingofthegreenfluorescentproteininToxo

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芥菜锌指蛋白转录因子基因Bj26的克隆与鉴定

芥菜锌指蛋白转录因子基因Bj26的克隆与鉴定

作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(7): 1174−1181/ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@ DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.01174芥菜锌指蛋白转录因子基因Bj26的克隆与鉴定贾双伟1,∗∗高英1,∗∗赵开军1,∗中国农业科学院作物科学研究所 / 农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程, 北京 100081摘要: 锌指蛋白是一类重要的转录因子家族, 参与植物基因转录调节、发育及胁迫反应等生理过程。

我们前期研究发现芥菜诱导型启动子BjC-P的W-box-like-4为其真菌诱导的核心元件, 本研究通过酵母单杂交技术从芥菜cDNA文库中筛选到与W-box-like-4序列特异互作的转录因子基因Bj26。

生物信息学分析表明, Bj26含735 bp的开放阅读框, 编码一个新的C2H2型锌指蛋白, 包括2个典型的C2H2型锌指结构及2个植物特有的QALGGH氨基酸保守序列, 等电点pI为9.2, 分子量为26.6 kD。

亚细胞定位显示该蛋白位于细胞核。

本氏烟瞬时表达分析表明Bj26蛋白通过与BjC-P的真菌诱导核心元件序列特异互作, 激活启动子BjC-P。

实时荧光定量PCR结果显示Bj26在真菌诱导下表达量明显增高。

Bj26的CDS序列与拟南芥和水稻中的C2H2型锌指蛋白序列比对及进化树分析表明, Bj26与拟南芥的C2H2型蛋白同源性高于水稻。

以上结果揭示Bj26蛋白可能介导BjC-P真菌诱导响应并参与植物抗真菌病原菌的调控过程。

关键词:酵母单杂交; C2H2锌指蛋白; Bj26基因; 真菌诱导; 瞬时表达; 实时荧光定量PCRCloning and Characterization of Brassica juncea Zinc Finger Protein Tran-scription Factor Gene Bj26JIA Shuang-Wei1,∗∗, GAO Ying1,∗∗, and ZHAO Kai-Jun1,∗National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement / Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, ChinaAbstract: Zinc-finger proteins, forming an important transcriptional factor family, are involved in gene transcriptional regulation, development and stress-responses in plants. The previous studies revealed that BjC-P is a fungus-inducible promoter from Bras-sica juncea and W-box-like-4 is the core element responsive to fungal infection. Here, we report the molecular cloning and char-acterization of a zinc finger protein-encoding gene (designated Bj26). Bj26 was screened out from the Brassica juncea cDNA library by the Yeast One-Hybrid System. Bioinformatic analysis showed that Bj26 contains open reading frame of 735 bp that encodes a new C2H2-type zinc finger protein with an isoelectric point (pI) of 9.2 and a molecular weight of 26.6 kD. The protein consists of two typical zinc-finger domains and contains two conserved QALGGH amino acid sequences. Subcellular localization showed that Bj26 is located in the nuclear. The histochemical and quantitative GUS assays, through transient gene expression in Nicotiana benthamiana leaf, showed that Bj26 can bind to the core element W-box-like-4 and activate the function of BjC-P. qRT-PCR analysis showed that the gene Bj26 expression obviously increased under the induction of the fungal elicitor (Hexa-N-Acetyl-Chitohexaose). CDS alignments and phylogenetic analysis of Bj26 and other C2H2-type proteins from Arabi-dopsis thaliana (At) and Oryza sativa (Os) (MEGA 6) showed Bj26 shares high similarity with that from Arabidopsis thaliana (At). All of the above results suggested that Bj26 protein mediates the process of plant response to fungal pathogen.Keywords: Yeast One-Hybrid System; C2H2-type zinc finger protein; Bj26; Fungal-induction; Transient gene expression; qRT-PCR在植物中, 锌指蛋白(zinc-finger protein, ZFP)形成一类较大的转录因子家族[1]。

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（）答案：错误解析：2. 在脂双层分子中，因为脂分子的亲水头部朝向两个表面，因此脂分子是对称性分布的。

（）答案：错误解析：膜脂的不对称性分布是指同一种膜脂分子在膜的脂双层中呈不均匀分布。

如人红细胞膜外层含磷脂酰胆碱和鞘磷脂较多，内层则含磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺较多。

3. 辅基与辅酶的区别只在于它们与蛋白质结合的牢固程度不同，并无严格的界限。

（）答案：正确解析：4. 真核生物成熟的mRNA的两端都带有游离的3′OH。

（）[华东师范大学2008研]答案：错误解析：成熟的真核mRNA的3′OH在3′末端，5′端没有。

5. 必需氨基酸是指人体不能合成的氨基酸。

（）答案：正确解析：6. DNA的Tm值随（A＋T）（G＋C）比值的增加而减少。

（）答案：正确解析：DNA分子中GC含量越高，DNA越稳定，Tm值就越高。

7. 生物体内脱氧核苷酸的合成一般通过氧化反应实现。

（）答案：错误解析：8. 在肌肉细胞中磷酸戊糖途径比在脂肪细胞中更活跃。

（）答案：错误解析：磷酸戊糖途径能为脂肪酸合成提供大量的还原当量NADPH，因而在脂肪细胞中该途径远比在肌肉细胞中更为活跃。

9. 内含子的自我剪接说明某些RNA也具有酶活性。

（）[中山大学研]答案：正确解析：10. 提高盐浓度可使DNA分子的熔点Tm升高。

（）[厦门大学2014研]答案：正确解析：11. DNA变性是指互补碱基之间的氢键断裂。

（）[中山大学2018研]答案：正确解析：12. 脂肪的皂化价高表示含低相对分子质量的脂肪酸少。

（）[山东大学2017研]答案：错误解析：皂化值是指皂化1g脂肪所需的KOH的毫克数。

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某大学生物工程学院《普通生物化学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（140分，每题5分）1. 糖基化在蛋白质的转运过程中具有重要的作用，可帮助蛋白运输到细胞的正确位置。

（）答案：正确解析：糖基化修饰过后的蛋白是糖蛋白，有信号识别的功用，可以帮助定位。

2. 由于增强子的作用与距离无关，所以某一个增强子可同时提高与它同在一条染色体DNA上所有的基因的转录效率。

（）答案：错误解析：增强子无论处在启动子的上游或者是下游，甚至相隔几千个碱基对，只要存在于同一DNA分子上都能对其起作用。

但如果临近有几个启动子，增强子总是优先作用于最近者。

3. 柠檬酸循环是分解与合成的两种途径。

（）答案：正确解析：4. 生物膜结构的骨架的重要组分是磷脂。

（）答案：正确解析：生物膜结构的骨架为磷脂双分子层，其主要组分为磷脂。

5. 呼吸链上电子流动的方向是从高标准氧化还原电位到低标准氧化还原电位。

（）[华东师范大学研]答案：错误解析：电子从电势较低的电对流向电势较高的电对。

6. 呼吸链中将电子直接传递给氧的是细胞色素aa3。

（）[中山大学2018研]答案：正确解析：7. tRNA的二级结构中的额外环是tRNA分类的重要指标。

（）答案：正确解析：不同tRNA中的额外环大小差异很大，因此可作为tRNA分类的指标。

8. 天冬氨酸转氨甲酰酶是嘧啶核苷酸合成途径的限速酶，该途径的终产物CTP是它的别构抑制剂，ATP为其别构激活剂。

（）答案：正确解析：9. D氨基酸氧化酶在生物体内的分布很广，可以催化氨基酸的氧化脱氨。

（）答案：错误解析：D氨基酸氧化酶存在于有些细菌、霉菌和动物肝、肾细胞中，可广谱性地催化D氨基酸脱氨。

10. 脂质体不是一种细胞器。

（）答案：正确解析：脂质体是根据磷脂分子在水相中形成稳定的脂双层膜的趋势而制备的人工膜，其直径一般在250～300A。

武汉大学分子生物学真题2001-2014汇总.

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一.解释概念(20分,每个4分)卫星DNA 复制体逆转座子反式激活因子衰减子与衰减作用三、问答题(50分)1. 说出双链DNA复制起始有关的五种重要的酶或蛋白并简述它们的功能。

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(10分)3. 简述真核RNA聚合酶II的转录起始复合物装配过程和转录起始(15分)4. DNA限制性内切酶EcoRI是人们熟悉的常用内切酶,它是在大肠杆菌(E.coli)R株中发现的,它被广泛用于分子克隆操作和DNA分析。

pUC质粒是常用克隆载体之一,它的多克隆位点上有EcoRI、BamHI、KpnI、HindIII等酶切点。

假如要你把一段由EcoRI切割产生的外源DN**段克隆到pUC质粒中,并把重组质粒转化大肠杆菌R株来扩增,已知条件是所用的R菌株中只有EcoRI一种限制性内切酶,你设计如何做才能确保成功?为什么?(10分)武汉大学2002分子生物学三.问答:1.简述(或绘图说明)真核细胞RNA聚合酶II转录的起始需要哪些基本转录因子及其装配过程(15分)2.简述(或绘图说明)色氨酸操纵子弱化的机制(15分)3.在讨论基因家庭时经常提到胚胎、胎儿和成体形成的蛋白质,这些述语是指什么现象?可用什么术语来描述这一类基因家族(5分)4. 你正在进行Southern blot分析,并刚刚完成凝胶电泳部分,下一步是将胶浸泡在NaOH溶液中使DNA变性为单链,为了节约时间,你跳过这一步,直接把DNA 从胶上转到硝酸纤维素膜上,你将标记好的探针与膜杂交,却发现放射自显影结果是一片空白,哪里错了呢?(5分)一、下列名词翻译成中文，并简要解释1、Domains and motifs2、Alternative splicing3、Reporter genes4、The PCR cycle5、Restriction mapping6、Multiple cloning sites7、DNA libraries8、Proteomics9、Replicon10、Semi-conservative replication二、简答题(共5题,每题8分,共40分)1、请列举三种以上蛋白质纯化技术,并说明不同纯化技术的简单原理。