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2 HPLC-MS-MS同时检测大鼠血浆中荭草素、牡荆素和槲皮苷(中国实验方剂学杂志)

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［收稿日期］20110604（001）［基金项目］国家科技重大专项课题（2008ZX09101-021）；国家自然科学基金（30860366）；贵州省科技计划重大专项项目（黔科合重大专

项字［2007］6010号）［第一作者］黄勇，硕士生，副教授，从事中药活性物质基础及药动学研究，Tel：0851-6908899，E-mail：mailofhy@126．com［通讯作者］*王永林，教授，从事中药活性物质基础研究，Tel：0851-6908899，E-mail：gywyl@gmc．edu．cn

HPLC-MS-MS同时检测大鼠血浆中

荭草素、牡荆素和槲皮苷

黄勇，何峰，张治蓉，郑林，兰燕宇，王永林*（贵阳医学院药学院，贵阳550004）

［摘要］目的：建立一种用于同时检测大鼠血浆中荭草素、牡荆素和槲皮苷3种黄酮成分的准确、灵敏的超高液相色谱-串联质谱分析方法，并研究其在大鼠体内的药代动力学。方法：大鼠静脉注射注射用复方荭草后，采用甲醇沉淀血浆蛋白，通过BEHC18柱分离，乙腈-0.1%甲酸水梯度洗脱，采用电喷雾离子化三重四极杆串联质谱，以多反应监测（MRM）方式进行正离子检测。用于定量分析的二级碎片离子分别为449.2～329.2（荭草素）、433.2～313.0（牡荆素）和449.2～303.4（槲皮苷）。结果：3种黄酮成分在大鼠血浆中线性关系良好，日内、日间精密度（RSD）均＜15.71%，准确度在86.25%～112.44%之间。3种黄酮成分在大鼠体内的平均滞留时间均较短在21min以内。结论：本方法快速、专属性强、灵敏度高，适用于注射用复方荭草临床前药代动力学研究。［关键词］血浆；大鼠；荭草素；牡荆素；槲皮苷；药动学；超高液相色谱-串联质谱

［中图分类号］R284.1［文献标识码］A［文章编号］1005-9903（2012）01-0080-05

SimultaneousDeterminationofOrientin，VitexinandQuercitrininRatPlasmabyUPLC-MS-MS

HUANGYong，HEFeng，ZHANGZhi-rong，ZHENGLin，LANYan-yu，WANGYong-lin*（SchoolofPharmacy，GuiyangMedicalCollage，Guiyang550004，China）

［Abstract］Objective：Todevelopasensitiveandreliableultraperformanceliquidchromat-ographytandemmasssepctrometry（UPLC-MS-MS）methodforsimultaneousdeterminationandpharmacokineticsoforientin，vitexinandquercitrininratplasma．Method：FollowingaproteinprecipitationwithmethanolforplasmasamplesafterivCompoundHongcaoinjectiontorat．TheanalysiswasachievedbyBEHC18columnandthemobilephasewasconsistedofacetonitrileandwater（0.1%formicacidincluded）followstepgradientelution．ATQDtandemmassspectrometryequippedwithelectrosprayionizationsourcewasusedasdetectorandoperatedbymultiplereactionmonitoring（MRM）positiveionmodeofthetransitions449.2-329.2，433.2-313.0，449.2-303.4fororientin，vitexinandquercitrin，respectively．Result：Goodlinearitywasachievedforthethreeflavonoids，theintra-andinter-dayprecisionswerelowerthan15.71%，andtheaccuracywerefrom86.25%to112.44%．TheMRTofthethreeflavonoidswereallblow21mininrats．Conclusion：ThemethodwasprovedtobesuitableforthepharmacokineticsofCompoundHongcaoinjection，whichoffersadvantagesofrapid，highsensitivityandselectivity．［Keywords］plasma；rats；orientin；vitexin；quercitrin；pharmacokinetics；UPLC-MS-MS

荭草素（orentin）属天然碳苷类黄酮，具有抗氧化作用，此外荭草素还具有保护心肌细胞、抑制NO

·08·

第18卷第1期2012年1月中国实验方剂学杂志ChineseJournalofExperimentalTraditionalMedicalFormulaeVol．18，No．1Jan．，2012

DOI:10.13422/j.cnki.syfjx.2012.01.033合酶、抗菌等多种药理活性［1］。牡荆素（vitexin）为异黄酮类化合物，在山楂、地耳草和荭草等多种植物中都有发现，其对缺血性心肌损伤具有良好的保护作用［2］。槲皮苷（quercitrin）为黄酮类化合物，具有很好的抗病毒、抗炎、降压和利尿等作用［3］。注射用复方荭草是由黔产荭草为主药研制而成的冻干粉针剂，其内主要含有荭草素、牡荆素和槲皮苷等黄酮类成分，临床上拟用于治疗冠心病、心绞痛和心血瘀阻证。前期药效学实验结果显示该药可明显改善急性心肌缺血、心肌梗死和降低心肌耗氧量［4-5］。本文建立了利用超高液相色谱-串联质谱同时检测大鼠血浆中荭草素、牡荆素和槲皮苷等3种黄酮成分的分析方法，并应用于大鼠静脉注射不同剂量的注射用复方荭草药代动力学研究，为研究该药体内作用规律和临床研究提供了科学依据。1材料1.1仪器超高液相色谱色谱-三重四级杆质谱联用仪（美国Waters公司），Allegra64R高速离心机（美国BeckmanCoulter公司），MTN-2800D氮吹仪（天津奥特塞恩斯公司），ZH-2涡旋混合器（天津药典标准仪器厂）。1.2试剂与试药荭草素对照品（批号111777-200801）、葛根素对照品（批号0752-9605）购自中国药品生物制品检定所，牡荆素、槲皮苷对照品为贵阳医学院药物研究开发中心自制（HPLC检测纯度≥98%），注射用复方荭草（贵州益佰股份有限公司提供，100mg/支，批号20091223），色谱乙腈（德国Merck公司），其余溶剂均为分析纯。1.3动物健康Wistar大鼠18只，雌雄兼用，体重为（210±10）g，由贵阳医学院动物中心提供，动物许可证号SCXK（黔）2002-0001。1.4数据处理实验所有数据均用珋x±s表示，采用DAS2.0软件（中国数学药理专业委员会）计算各物质药动学参数。2方法2.1标准溶液的配制分别精密称取各对照品适量，用甲醇溶解并定容，得1.006g·L－1荭草素，0.996g·L－1牡荆素，1.01g·L－1槲皮苷的对照品储备液。同法配制9mg·L－1的葛根素内标溶液。2.2色谱条件WatersAcquityBEHC18（2.1mm×50mm，1.7μm）色谱柱，乙腈-0.1%甲酸水梯度洗脱（0～0.5min，10%A），2.0～2.5min，30%～90%A，3.5min10%A，流速为0.35mL·min－1；柱温45℃；进样器温度15℃。2.3质谱条件WatersAcquityTQD质谱仪，

MassLynxV4.1工作站，电喷雾电离源；毛细管电压3kV；离子源温度120℃；去溶剂气温度350℃；喷雾

气为N2（650L·h－1）；碰撞气为Ar2（0.16mL·min－1）；扫描方式为多反应离子监测模式（MRM），

用于定量的正离子对等质谱信息见表1。表1荭草素等物质的定量离子对和锥孔电压等质谱信息

检测物离子对/（m/z）驻留时间/ms锥孔电压/V碰撞能量/eV荭草素499.2～329.2503530

牡荆素433.2～313.0503530槲皮苷449.2～303.4503530葛根素（内标）417.0～267.0503015

2.4血浆样品处理方法

［6-7］

取大鼠血浆100μL，

依次加入20μL葛根素内标溶液（9mg·L－1），30μL甲酸溶液（3mol·L－1），400μL甲醇，涡混1min，于4℃15000r·min－1离心10min，取上清液置离心管

中，40℃氮吹仪下吹干，残留物用200μL初始流动相溶解，1μL进样。2.5方法学验证

2.5.1专属性分别取6份空白血浆100μL，除

不加内标外，其余按2.4项下操作，得典型空白样品色谱图；将3种物质的混合标液和内标溶液加入空白血浆，依法操作，得相应色谱图；取大鼠给药后血浆，依法操作，得相应色谱图，见图1。可以看出大鼠血浆中内源性物质均不干扰3种物质的测定。2.5.2线性范围和最低检测限（LLOD）取大鼠

空白血浆100μL，分别加入6个逐步稀释的混合标准溶液30μL（n=3），按2.4项下操作，建立标准曲线。以待测物的峰面积与内标峰面积之比（A/Ai）为纵坐标Y，各物质浓度（C）为横坐标X进行线性回归，权重系数为1/X，求得标准曲线。结果3种成分的线性方程分别为Y荭草素=0.137X+0.028（r=

0.995，线性范围0.11～27.66mg·L－1，LLOD为

15.23×10－3mg·L－1）；Y牡荆素=0.162X+0.007（r=0.998，线性范围0.05～12.56mg·L－1，LLOD为

0.55×10－3mg·L－1）；Y槲皮苷=0.115X+0.003（r=0.991，线性范围0.02～5.05mg·L－1，LLOD为

1.90×10－3mg·L－1）。

2.5.3准确度和精密度按2.5.2项下分别配制

低、中、高浓度的质控（QC）样品，同法配制与定量下限浓度相当的QC样品，连续测定3d（n=5）。根据当日随行标准曲线计算QC样品浓度，求得方法·18·

黄勇，等：HPLC-MS/MS同时检测大鼠血浆中荭草素、牡荆素和槲皮苷

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UPLC—MS／MS测定醒脑静口服制剂中3种环烯醚萜在大鼠脑中含量及其脑

UPLC—MS／MS测定醒脑静口服制剂中3种环烯醚萜在大鼠脑中含量及其脑

UPLC—MS／MS测定醒脑静口服制剂中3种环烯醚萜在大鼠脑中含量及其脑药动力学研究为了建立UPLC-MS/MS同时测定大鼠脑中栀子苷、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷酸灵敏可靠的分析方法，并对这3种环烯醚萜苷在脑中风大鼠口服醒脑静后的脑药动力学进行研究。

该实验中脑浆样品沉淀蛋白2次；采用Acquity BEH C18柱，流动相为乙腈-1%甲酸-水梯度洗脱，质谱采用电喷雾电离源（ESI），多反应监测（MRM）进行负离子检测，样品分析时间为3.5 min。

结果表明3种环烯醚萜苷成分在大鼠脑中的线性关系良好，提取回收率在99.6%～114.3%，日内、日间精密度和准确度良好，稳定性等均符合要求。

各物质在中风大鼠脑中的t1/2和MRT相似，栀子苷与京尼平龙胆双糖苷有双峰现象，而栀子苷酸为单峰。

表明该方法特异灵敏、准确可靠，可用于醒脑静口服制剂的脑药动力学研究。

标签：UPLC-MS/MS；栀子苷；京尼平龙胆双糖苷；栀子苷酸；醒脑静；脑药动力学；脑中风醒脑静由经典名方安宫牛黄处方精简而来（栀子、艾片、麝香和郁金），药理研究表明[1-2]，它有显著的抗脑缺血再灌注损伤、抗氧化损伤、兴奋中枢、解热、抗炎、神经保护等作用，已作为注射剂被广泛应用于脑中风的防治中。

但由于注射剂使用不便及安全性问题[3]，近年来对醒脑静口服制剂的开发研究得到重视[4-5]。

栀子作为醒脑静方中的主要药味，其主要活性成分是以栀子苷为代表的环烯醚萜类物质[6-7]。

对于它们口服后的血药动力学研究较为广泛[8-9]，但考虑到在脑中风的病灶部位在脑部，而且这些水溶性的药效成分不易入脑去发挥药效，因此对其脑部的药动学进行研究很有必要的。

本文采用UPLC-MS-MS对大鼠脑中的3种环烯醚萜类成分栀子苷、京尼平龙胆双糖苷和栀子苷酸的含量进行检测，并研究了三者在脑中风大鼠灌胃醒脑静后的脑药动力学特征，为醒脑静口服制剂的研发和临床应用奠定基础。

1 材料1.1 药品与试剂栀子苷对照品（批号110749-201115）及内标芍药苷（批号110736-201337）购自中国食品药品检定研究院；京尼平龙胆双糖苷对照品（批号121120）与栀子苷酸对照品（批号MUST-12121502）购自成都曼斯特生物科技有限公司；乙腈、甲醇（质谱级，Fisher公司）；甲酸（色谱级，ROE公司）；超纯水自制；其他试剂均为分析纯；醒脑静口服制剂为实验室自制（栀子提取物-冰片-麝香酮-郁金挥发油38∶18∶3∶1）。

同时测定人血浆中柚皮苷、柚皮素质量浓度的HPLC-MS／MS方法学

同时测定人血浆中柚皮苷、柚皮素质量浓度的HPLC-MS／MS方法学

同时测定人血浆中柚皮苷、柚皮素质量浓度的HPLC-MS／MS方法学曾璇;苏薇薇;白杨;彭维;姚宏亮【摘要】采用HPLC-MS／MS建立了同时测定人血浆中柚皮苷、柚皮素质量浓度的方法。

以异槲皮苷为内标，血浆样品经乙酸乙酯萃取后，以 Agilent Poroshell 120 EC-C18（3.0 mm ×30 mm，2.7μm）为色谱柱，甲醇－水（体积比45∶55，均含φ＝0.1％甲酸）为流动相，流速为0.4 mL·min－1；采用电喷雾负离子（ESI －）、多反应离子检测（MRM）模式检测，用于定量分析的离子对分别为柚皮苷m／z 579.1／270.8、柚皮素m／z 270.9／150.7、异槲皮苷（内标） m／z 463.1／299.8。

经方法学验证，柚皮苷、柚皮素分别在0.2510～100.4、0.5030～201.2 ng·mL－1质量浓度范围内线性关系良好，批间、批内精密度均符合要求，提取回收率高。

结果表明，HPLC-MS／MS法灵敏度好、准确性高、重现性好，适用于测定人血浆中柚皮苷、柚皮素质量浓度。

%The aim of the study was to establish an HPLC-MS/MS method for simultaneous determination of naringin and naringenin in human plasma.Naringin and naringenin were extracted from plasma by eth-yl acetate,then determined by HPLC-MS/MS taking isoquercitrin as internal standard (IS).Chromato-graphic separation was carried out on a Agilent Poroshell 1 20 EC-C1 8 column (3.0 mm ×30 mm,2.7μm).The mobile phase was composed of solvent A (0.1% formic acid,V/V)and B (methanol with 0.1%formic acid,V/V).The flow rate was 0.4 mL·min-1 .Electrospray ionization (ESI)source was applied and operated in multiple reaction monitoring (MRM)mode with the transitions of m/z 579.1 /270.8,m/z 270.9/1 50.7,m/z 463.1 /299.8 for naringin,naringenin andIS,respectively.The method was validated over the concentration range of 0.251 0 ~1 00.4 ng·mL-1 for naringin,and 0.503 0 ~201.2 ng·mL-1 for naringenin,respectively.The intra-and inter-run precisions were within the accept-able range,and the extraction recoveries were satisfactory.The established method is highly sensitive,accurate and reproducible,which can be applied for the simultaneous determination of naringin and nar-ingenin in human plasma.【期刊名称】《中山大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2017(056)001【总页数】6页(P125-130)【关键词】人血浆;柚皮苷;柚皮素;HPLC-MS/MS【作者】曾璇;苏薇薇;白杨;彭维;姚宏亮【作者单位】中山大学生命科学学院∥广东省中药上市后质量与药效再评价工程技术研究中心，广东广州510275;中山大学生命科学学院∥广东省中药上市后质量与药效再评价工程技术研究中心，广东广州510275;中山大学生命科学学院∥广东省中药上市后质量与药效再评价工程技术研究中心，广东广州510275;中山大学生命科学学院∥广东省中药上市后质量与药效再评价工程技术研究中心，广东广州510275;中山大学生命科学学院∥广东省中药上市后质量与药效再评价工程技术研究中心，广东广州510275【正文语种】中文【中图分类】R965柚皮苷是本团队研发的原创化学一类新药[1]，具有很好的止咳[2]、化痰[3]及抗炎[4-5]作用，已获得国家食品药品监督管理总局颁发的药物临床试验批件，柚皮素是柚皮苷进入体内的主要代谢产物[6]。

超高效液相色谱串联质谱同时检测人血清5种甾体激素方法学及生物参考区间的建立

超高效液相色谱串联质谱同时检测人血清5种甾体激素方法学及生物参考区间的建立

文章编号：1673-8640（2022）02-0165-09 中图分类号：R446.1 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2022.02.015超高效液相色谱串联质谱同时检测人血清5种甾体激素方法学及生物参考区间的建立陆优丽，杨双双，张美微，欧美贤，董春霞，沈薇薇，姜凤丽，李水军（上海药物Ⅰ期临床暨药物一致性评价工程技术研究中心上海市临床质谱研究所上海市徐汇区中心医院复旦大学附属中山医院徐汇医院，上海 200031）摘要：目的建立超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）同时测定人血清中睾酮（T）、双氢睾酮（DHT）、雄烯二酮（AD）、脱氢表雄酮（DHEA）和17α羟孕酮（17OHP）的方法，并确定表观健康人群血清中5种甾体激素的参考区间。

方法血清样品沉淀后经SOLAμ HRP固相萃取柱纯化，采用Poroshell 120 EC-C18色谱柱分离，用含0.05%甲酸的30%乙腈溶液和90%乙腈溶液梯度洗脱。

采用电喷雾正离子多反应监测模式检测，采用同位素内标法定量检测甾体激素的浓度。

对建立的UPLC-MS/MS方法进行全面的性能验证，并建立适用于上海地区人群人血清5种甾体激素的参考区间。

结果 UPLC-MS/MS检测人血清中5种甾体激素的最低定量限为0.01～0.10 ng/mL，标准曲线范围覆盖1 000倍，r2值均>0.999 5，线性良好，样本经稀释后可报告范围覆盖5 000倍。

5种分析物批内与批间的准确度为95.0%～105.6%，精密度均<8%。

8种结构类似物对目标分析物均无干扰，高三酰甘油不影响检测结果，溶血可导致DHEA检测值降低。

各分析物的提取回收率为60.5%～93.3%，内标校正后无明显的基质效应。

血清样品室温放置4 h、-25～-15 ℃放置30 d、-90～-70 ℃放置100 d，甾体激素均可被稳定测量。

T和17OHP项目参加2019年国家卫生健康委临床检验中心全国内分泌正确度验证质谱法调查，UPLC-MS/MS检测结果与靶值的偏差为-5.00%～0.38%。

UPLC-MSMS应用

UPLC-MSMS应用

采用UPLC-MS/MS测定大鼠血浆中的咖啡因、甲糖宁、美托洛尔、氨苯砜以及在P450酶活性研究中的应用摘要：超高效液相色谱（UPLC）串联质谱（MS）的方法可以用来检测大鼠血清中细胞色素P450同工酶CYP1A2、CYP2C9、CYP2D6和CYP3A4的四种探针药物咖啡因、美托洛尔、甲糖宁和氨苯砜。

实验中，采用Waters公司的超高效液相色谱（C18，2.1×50mm，1.7μm），流动相体积比为15:85的乙腈和水（含0.1%的甲酸）；三重四级杆质谱采用电喷雾离子化的操作方式；内标物为非那西丁；采用体积比为10:1的二氯甲烷和丁醇来萃取血浆样品。

回收率变化范围从67.5%到98.5%。

四种药物标准曲线的线性范围和相关系数（r2）分别是：咖啡因：2.5ng/mL—1000ng/mL，0.9936；氨苯砜：2.5ng/mL—1000ng/mL，0.9966；甲糖宁：5ng/mL—5000ng/mL，0.9990；美托洛尔：2.5ng/mL—250ng/mL,0.9998。

实验中，这种方法成功的应用到了对四种探针药物的研究和对灯盏花素与四种P450同工酶作用效应活性的评价。

关键词：UPLC-MS/MS；细胞色素P450；活性评价1、引言细胞色素P450超家族是一个主要的药物代谢酶系，在内源性和外源性物质的代谢或生物转化中起着重要的作用。

为了能够避免可能的药-药相互作用和药物不良反应的风险，确定药物是否对P450酶的活动造成影响是相当重要的。

CYP1A2、CYP2C9、CYP2D6和CYP3A4是CYP450的四个主要亚型，代谢目前90%以上的药物。

咖啡因、甲糖宁、美托洛尔和氨苯砜分别是CYP1A2、CYP2C9、CYP2D6和CYP3A4的探针药物，它们常常用来检测这些同工酶的活性。

如果这四个探针药物在给药和测定时间分别一样，那么这些同工酶的活性就能同时被评价。

跟传统的单探针方法比较，“鸡尾酒”方法在一个实验中能够同时评价超过一个CYP450的同工酶的活性，并且能尽量减少个体的差异；同时，此方法更方便、快捷。