8第八章基因工程下游技术

为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽 链而特意设计的载体称为表达载体。
一、常用的克隆载体 （一）质粒 (plasmid)——存在于细菌染色体
外的小型环状双链DNA分子
特点
能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传
信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。
第八章 基因工程与体外表达源自13质粒（plasmid）
在细胞内的复制分两种类型
严密控制型 (stringent control)
松弛控制型 (relaxed control)
❖ 只在细胞周期的一
❖ 在整个细胞周期中
定阶段进行复制
随时都可进行复制
❖ 在细胞内只含 1个
❖ 在细胞内一般在20
或几个
个以上, 甚至多达
第八章 基因工程与体外表达数千个
14
克隆载体的的质粒应具备下列特点
Ⅰ型酶具有限制和修饰作用。要求DNA分
子上有特定的识别顺序，并在此识别位点下游
100至1000bp处切割。
Ⅲ型酶与Ⅰ型酶一样，有限制和修饰作用。
但在识别位点附近切割DNA，但切点难以预测。
Ⅱ型酶并不兼有甲基化酶的活性。在DNA
分子内部的识别特异位点并切割双链DNA，切
割为点固定、已知，是基因克隆重常用的工具
的3’-OH上；或进行同聚物加尾。
• Taq DNA聚合酶
第二节 基因克隆的载体
为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达 有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。
克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计
的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector)
野生型λ噬菌体为双链线性DNA分子，两端各带12 个碱基的单链粘性末端。基因组分三个区域：左侧 区（含有包壳的病毒颗粒所需的全部基因）、中间 区（非必需区，但包含与重组有关的基因）、右侧 区（包含所有主要调控组分）。 系替换型载体，外源DNA：9 ～ 23kb 常用：EMBL 系列（置换型，适用基因组克隆）

二、酵母转化系统
酵母宿主系统 酵母载体系统 酵母系统标记基因 酵母转化方法 外源DNA在酵母宿主中的命运
1、酵母宿主系统
用作模式真核生物的酵母宿主菌 用作外源基因表达的酵母宿主菌 提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
用作模式真核生物的酵母宿主菌
GAL10 Promoter
GAL80
GAL4
UAS
GAL1
GAL7 GAL10
A、 将GAL4的启动子换成GAL10的诱导型强启动子 B、半乳糖诱导GAL4高表达，不受GAL80产物抑制，激活GAL1等高效转录
3）pho4TS-PHO5启动子
低温诱导、磷酸盐抑制
A、PHO5启动子在培养基缺磷酸盐时启动转录
酿酒酵母（Saccharomyces cereviasiae）：
*无性繁殖（芽殖或裂殖）、单细胞、真核生物 *繁殖方式与原核类似，易于操作 *基因表达调控机理与高等真核类似
用作外源基因表达的酵母宿主菌
酿酒酵母： 最成熟的真核细胞表达系统，表达水平低，产物过度糖基化
甲醇酵母：可以利用甲醇作唯一碳源，表达水平高，产物糖基化更合理
B、PHO4基因编码产物是PHO5启动子的正调控因子
C、pho4TS 温度敏感，35℃时失活，PHO5关闭
D、pho4TS-PHO5启动子通过降温（23℃）诱导表达
2、酿酒酵母分泌系统
酿酒酵母系统常用分泌信号肽来源： 性结合因子：MF-α 酸性磷酸酯酶：PHO5 蔗糖酶：SUC2 杀手毒素因子：KIL
碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化
细胞：带壁的完整细胞 原理：通过碱金属离子（如Li+等）、PEG和热休克处理诱

ห้องสมุดไป่ตู้
❖ 知识就是财富 ❖ 丰富你的人生
71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。——西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——韩非
基因工程的下游技术重组蛋白的表达,纯 化和分析（精选）
31、园日涉以成趣，门虽设而常关。 32、鼓腹无所思。朝起暮归眠。 33、倾壶绝余沥，窥灶不见烟。
34、春秋满四泽，夏云多奇峰，秋月 扬明辉 ，冬岭 秀孤松 。 35、丈夫志四海，我愿不知老。
谢谢你的阅读

图11-4 用二元载体系统将多聚半乳糖醛酸酶的反义 基因导入蕃茄细胞
第三节 植物外源基因的表达
一、植物表达病毒的外壳蛋白、核酶和反义 ＲＮＡ提高植物的抗病毒的能力。
二、植物表达微生物毒素提高对昆虫的抗性 三、物表达抗除草剂基因提高对除草剂 的
抗性 四、植物表达不同影响花的颜色、形态和生
长特性的基因产生新的花卉品种
复制的质粒克隆位点上。 • ２、将一中间穿梭质粒引入大肠杆菌细胞，通过在pBR322序列上编
码的氨苄青霉素抗性基因选择转化子。
• ３、然后通过大肠杆菌和土壤农癌杆菌的交配特此质粒转移到土壤农 癌杆菌细胞内。
• ４、两种质粒上的T-DNA序列发生同源重组，穿梭质粒（中间载体） 整合入整合质粒（pＧＶ３８５０）。这一过程使穿梭质粒全部融入 T-DNA的左右边界内。没有整合的质粒不会累积，因为它们不含土壤 农癌杆菌的复制起点。
1、培育抗病毒作物
• (1)、 外壳蛋白介导的抗性 • (2)、 反义RNA介导的抗性 • (3)、 利用缺损的复制酶 • (4)、 干扰运动蛋白 • (5)、 卫星RNA介导的抗性
• 烟草花叶病毒(TMV)是一种6．5kb大小的 RNA病毒。通过克隆病毒cDNA，发现该病 毒基因组编码4种多肽：两种复制酶亚单位， 一种外壳蛋白和一种与细胞间运动有关的
下来。
•
（３）、植物可产生大量的后代，稀有突变体和重组体就得以保
留。
•
（ment)，它们可用作
载体或作为插入诱变剂。
•
（５）、可利用植物的再生能力，可由单个细胞再生成一个完整
的植株。
• ２、缺点
• （１）、许多植物是多倍体，因而具有庞 大的基因组。
重要蛋白。转基因植物在土壤农癌杆菌基 因转移介质中将表达TMV的外壳蛋白 (CP)(图10—11)。