甲醇营养型毕赤酵母表达系统介绍

毕赤酵母表达知识归纳1a.配制500×BIOTIN stock solution（0.02％）有这么3种方案：1、懒人是将Biotin直接溶在去离子水中，放过夜，基本就能溶；2、急性子是将溶液配成0.02N的NaOH，就很容易溶解了；3、水浴加热，温度不能高于50度。

D－生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。

在毕赤酵母代谢过程中，作为多种酶的辅基起作用。

天然培养基中一般可以不单独添加，因为YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素，但是做高密度发酵还是必须要添加的。

b.有几个比较迷惑的问题请教大家：(很典型的小问题）1、制感受态细胞，OD多少比较好？pyrimidine 战友的方法：取1mlGS115过夜培养物(OD约6-10) 分装到1.5ml EP管中。

说明书还有一些文献是说在1.3左右效率高，再高了效率会很低2、关于高效转化法，文献说用(LiAc)，而invitrogen的说明书说转化毕赤酵母用(LiAc)没用，要用LiCl。

Lithium acetate does not work with Pichia pastoris. Use only lithium chloride.3、YNB到底能高温灭么？有的说能有的说不能。

过滤灭菌的怎么操作？我是把滤器装好膜绑到瓶口用纱布盖上，报纸包上，瓶盖放烧杯里单灭。

然后把配好的溶液用注射器一点点推进去。

4、葡萄糖为什么在YPD里一起灭颜色很深，单灭则不会。

该115度还是121度灭？网上搜了下，都有人用！5、电转化参数用400欧还是200欧？有的用400，有的还专门说不是用400。

都是从园里看到的！电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆（不是400）6、电转后，在MD平板上长的应该就是整合了目的基因的重组子了吧？如果不想筛高拷贝的，是否PCR验证一下即可？网友的回答：ynb最好不灭菌，我是0.22um过滤处理的。

invitrogen手册上可以灭菌的。

毕⾚酵母表达实验⼿册毕⾚酵母表达实验⼿册Jnuxz丁⾹园虚拟社区蛋⽩质技术讨论版⼤肠杆菌表达系统最突出的优点是⼯艺简单、产量⾼、周期短、⽣产成本低。

然⽽，许多蛋⽩质在翻译后，需经过翻译后的修饰加⼯，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋⽩酶⽔解等过程才能转化成活性形式。

⼤肠杆菌缺少上述加⼯机制，不适合⽤于表达结构复杂的蛋⽩质。

另外，蛋⽩质的活性还依赖于形成正确的⼆硫键并折叠成⾼级结构，在⼤肠杆菌中表达的蛋⽩质往往不能进⾏正确的折叠，是以包含体状态存在。

包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋⽩，就需要进⾏变性溶解及复性等操作，这⼀过程⽐较繁琐，同时增加了成本。

⼤肠杆菌是⽤得最多、研究最成熟的基因⼯程表达系统，当前已商业化的基因⼯程产品⼤多是通过⼤肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量⾼、易于操作。

但⼤肠杆菌是原核⽣物，不具有真核⽣物的基因表达调控机制和蛋⽩质的加⼯修饰能⼒，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应⽤。

近年来，以酵母作为⼯程菌表达外源蛋⽩⽇益引起重视，原因是与⼤肠杆菌相⽐，酵母是低等真核⽣物，除了具有细胞⽣长快，易于培养，遗传操作简单等原核⽣物的特点外，⼜具有真核⽣物时表达的蛋⽩质进⾏正确加⼯，修饰，合理的空间折叠等功能，⾮常有利于真核基因的表达，能有效克服⼤肠杆菌系统缺乏蛋⽩翻译后加⼯、修饰的不⾜。

因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利⽤。

［1］。

同时与⼤肠杆菌相⽐，作为单细胞真核⽣物的酵母菌具有⽐较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加⼯修饰能⼒。

酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）在分⼦遗传学⽅⾯被⼈们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。

1981年酿酒酵母表达了第⼀个外源基因----⼲扰素基因［2］，随后⼜有⼀系列外源基因在该系统得到表达［3、4、5、6］。

⼲扰素和胰岛素虽然已经利⽤酿酒酵母⼤量⽣产并被⼴泛应⽤，当利⽤酿酒酵母制备时，实验室的结果很令⼈⿎舞，但由实验室扩展到⼯业规模时，其产量迅速下降。

毕赤酵母表达蛋白步骤一、引言毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种常用的真菌表达系统，被广泛应用于蛋白质的表达和生物技术研究中。

其优势包括高表达水平、易于培养和操作、能够正确折叠复杂蛋白等。

本文将介绍毕赤酵母表达蛋白的步骤。

二、构建表达载体毕赤酵母表达系统的关键是表达载体的构建。

首先，需要选择适合的表达载体，常用的有pPIC6、pPICZα等。

然后，在载体上选择合适的启动子和信号序列，以确保蛋白质能够被正确表达和分泌。

同时，还需要在表达载体上加入选择标记，如His标签、FLAG标签等，以便后续的蛋白质纯化和检测。

三、转化毕赤酵母将构建好的表达载体转化入毕赤酵母中，使其成为表达宿主。

转化方法包括电击转化、化学转化等。

其中，电击转化是常用的方法，通过电击脉冲使毕赤酵母细胞膜发生破裂，使表达载体进入细胞内。

转化后，将细胞培养在选择性培养基上，筛选出带有表达载体的毕赤酵母克隆。

四、表达蛋白经过转化筛选后，得到含有目标蛋白表达载体的毕赤酵母克隆。

接下来，需要将克隆进行培养，在适当的条件下诱导蛋白的表达。

常用的诱导剂包括甲醇、巯基乙醇等，通过加入适量的诱导剂，可以使目标蛋白得到高效表达。

五、蛋白纯化在蛋白表达后，需要进行蛋白纯化，以获得纯度较高的目标蛋白。

常用的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。

在选择纯化方法时，需要根据目标蛋白的性质和需求进行合理选择。

同时，可以利用加入的选择标记，如His标签，通过亲和层析纯化进行快速高效的纯化。

六、蛋白鉴定和功能分析蛋白纯化后，需要进行蛋白的鉴定和功能分析。

常用的鉴定方法包括SDS-PAGE、Western blot等，可以确定蛋白的分子量和纯度。

功能分析则可以通过生物学实验来进行，如酶活测定、结合实验等，以验证目标蛋白的功能。

七、应用和展望毕赤酵母表达系统在生物技术和蛋白质研究领域有着广泛的应用。

通过该系统，可以高效表达各种蛋白，包括抗体、酶和重组蛋白等。

毕赤酵母表达系统研究进展马银鹏;王玉文;党阿丽;孔祥辉;张介驰【摘要】毕赤酵母是外源蛋白表达的一种重要宿主.毕赤酵母表达系统既具有原核表达系统操作简单、价格低廉、生产率高的优点,又具有真核表达系统能对表达后的蛋白折叠、糖基化和形成二硫键等翻译后进行加工和修饰的功能,因此毕赤酵母表达系统具有广泛的应用前景和重要的研究价值.本研究对毕赤酵母表达系统的特点、组成、影响外源基因高效表达的影响因素等进行总结.【期刊名称】《黑龙江科学》【年(卷),期】2013(004)009【总页数】5页(P27-31)【关键词】毕赤酵母;表达系统;外源蛋白;甲醇【作者】马银鹏;王玉文;党阿丽;孔祥辉;张介驰【作者单位】黑龙江省科学院微生物研究所,哈尔滨150010;黑龙江省科学院微生物研究所,哈尔滨150010;黑龙江省科学院微生物研究所,哈尔滨150010;黑龙江省科学院微生物研究所,哈尔滨150010;黑龙江省科学院高技术研究院,哈尔滨150020;黑龙江省科学院微生物研究所,哈尔滨150010;黑龙江省科学院高技术研究院,哈尔滨150020【正文语种】中文【中图分类】Q815大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统由于其具有遗传背景和生化特性清楚、成本低廉、操作简便、生产效率高等优点最早被采用作为外源基因表达系统。

但大肠杆菌表达系统缺少真核生物的蛋白翻译后进行加工和修饰的功能，表达的蛋白大部分以包含体形式存在，且需要经过复杂的复性才能恢复构象和活性以及背景杂蛋白较多[1］，为克服这些缺点，人们于1979年开发了酵母表达系统。

酵母是单细胞低等真核生物，既具有原核生物细胞生长速度快、容易培养、操作简单等优点，又具有真核生物表达时对蛋白质的加工和修饰等功能。

因此相对于原核表达系统表达出的不具有活性的蛋白，酵母表达出的蛋白是具有生物学活性的，而且酵母表达系统比其他真核表达系统如昆虫、哺乳动物组织等表达系统快速、简便、成本低[2］。

毕⾚酵母表达系统使⽤⼼得Pichia酵母表达系统使⽤⼼得甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为⼈熟知，并⼴泛应⽤于外源蛋⽩的表达。

虽然说酵母表达操作简单表达量⾼，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到⾼表达的。

不少⼈在操作中会遇到这样那样的问题，收集了部分⽤户在使⽤EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕⾚酵母表达的经典试剂盒过程中的⼼得体会。

其中Xiang Yang是来⾃美国乔治城⼤学（Georgetown University）Lombardi癌症中⼼（Lombardi Cancer Center），部分⽤户来⾃国内。

+ 表⽰优胜于；- 表⽰不如；= 表⽰差不多EasySelect Pichia Expression System产品性能：优点——使⽤简单，表达量⾼，His-tag便于纯化缺点——酵母表达蛋⽩有时会出现蛋⽩切割问题全⾯产品报告及⼼得体会：巴斯德毕⾚酵母（Pichia pastoris ）是⼀种能⾼效表达重组蛋⽩的酵母品种，⼀⽅⾯由于其是属于真核⽣物，因此表达出来的蛋⽩可以进⾏糖基化修饰，另⼀⽅⾯毕⾚酵母⽣长速度快，可以将表达的蛋⽩分泌到培养基中，⽅便蛋⽩纯化。

毕⾚酵母表达载体pPICZ 在多克隆位点（MCR ）3'端带有his-tag 和c-myc epitopes ，这些tag 有利于常规检测和纯化，⽽且在MCR5'端引⼊了alpha factor （α-factor ）⽤以增加表达，并且在表达后α-factor 可以⾃动被切除。

在进⾏克隆的时候，如果你选择的是EcoRI ，那么只需在⽬标蛋⽩中增加两个氨基酸序列即可完成。

另外pPICZ 系列选⽤的是Zeocin 抗⽣素作为筛选标记，⽽诱导表达的载体需要甲醇——甲醇⽐⼀般⽤于⼤肠杆菌表达诱导使⽤的IPTG 便宜。

螺旋讲堂2010年第1期 总第20期w w w .h e l i x n e t .c n 生物人的网上家园毕赤酵母表达从入门到提高爱因思念螺旋网HelixNet本文所涉及的技术要点主要来源于相关文献、网络和书籍，此外，一些操作中的技巧及经验等来自于本人及同学、朋友的总结，仅供大家参考，同时也请下载者不要传播尤其是以商业为目的的复制、传播等等；如有转载、传播请注明来源于“螺旋网”。

若本文侵犯了您的版权或有任何不妥，请Email ：kaosy@ 告知。

此外，由于学识、经验有限，本文难免会存在一些错误或缺陷，敬请不吝赐教，联系方式：kaosy@ 同时因存在环境、试剂、仪器以及人为等原因，不能保证实验100%的成功，仅供参考。

写在前面，因为酵母里用到了很多遗传学的命名方法，所以建议大家首先看一下这个资料，可以让大家理解一些不常见的符号及意义。

下载地址如下： /bbs/thread-19215-1-1.htmL一、 甲醇营养型毕赤酵母表达系统介绍巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是近几年发展起来的较为完善的、被广泛用来表达外源蛋白的甲醇营养型酵母表达系统。

目前通过毕赤酵母表达了很多种性质不同的蛋白，越来越多的实验室及公司开始搭建毕赤酵母表达系统的平台，相信随着对毕赤酵母表达系统的研究越来越深入，会有更多成功表达并进行商业化应用的案例出现。

1.主要优点1)具有强有力的乙醇氧化酶(Alochol Oxidase ，AOX1)基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达； 2)作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行翻译后的加工与修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性； 3)营养要求低、生长快、培养基廉价，便于工业化生产； 4)可高密度发酵培养，在发酵罐中细胞干重甚至可达120g/L 以上； 5)表达量高，许多蛋白可达到g/L 以上水平； 6)在P . pastoris 中表达的蛋白既可存在于细胞内，又可分泌到胞外，自身分泌的蛋白非常少，十分有利于纯化； 7) 糖基化程度低，与S. cerevisiae 相比，P . pastoris 不产生过度的糖基化。

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写在前面，因为酵母里用到了很多遗传学的命名方法，所以建议大家首先看一下这个资料，可以让大家理解一些不常见的符号及意义。

下载地址如下： /bbs/thread-19215-1-1.htmL一、 甲醇营养型毕赤酵母表达系统介绍巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是近几年发展起来的较为完善的、被广泛用来表达外源蛋白的甲醇营养型酵母表达系统。

目前通过毕赤酵母表达了很多种性质不同的蛋白，越来越多的实验室及公司开始搭建毕赤酵母表达系统的平台，相信随着对毕赤酵母表达系统的研究越来越深入，会有更多成功表达并进行商业化应用的案例出现。

1.主要优点1)具有强有力的乙醇氧化酶(Alochol Oxidase ，AOX1)基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达； 2)作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行翻译后的加工与修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性； 3)营养要求低、生长快、培养基廉价，便于工业化生产； 4)可高密度发酵培养，在发酵罐中细胞干重甚至可达120g/L 以上； 5)表达量高，许多蛋白可达到g/L 以上水平； 6)在P . pastoris 中表达的蛋白既可存在于细胞内，又可分泌到胞外，自身分泌的蛋白非常少，十分有利于纯化； 7) 糖基化程度低，与S. cerevisiae 相比，P . pastoris 不产生过度的糖基化。

酵母表达系统概述及相关研究进展（小编整理）第一篇：酵母表达系统概述及相关研究进展酵母表达系统的研究进展和前景(XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX学院)摘要：酵母表达系统在表达真核生物蛋白方面已经得到广泛而成功的应用，表达出的重组蛋白表现出较高甚至比原物种体内的蛋白质更高的生物活性。

近年来，利用酿酒酵母和毕赤巴斯德氏酵母表达人源蛋白或肽类活性物以及其它中间体取得了新的进展。

本文主要从上游设计，重组表达，分离纯化和活性验证等方面进行了总结，并且对未来更好的利用酵母生产药物等活性物质作出展望。

关键词：酵母表达系统；蛋白分泌：异源基因；糖基化修饰；人源活性药物引言酵母作为一种表达外源基因的宿主菌, 既具有操作简单, 生长快等特点, 又具有真核细胞的翻译后修饰加工系统。

在表达某些基因工程产品时, 可以大规模生产, 从而有效地降低成本。

常用的酵母表达系统有酿酒酵母表达系统, 甲基营养型酵母表达系统和裂殖酵母表达系统。

酿酒酵母（Saccharomyces.cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。

但由于酿酒酵母的局限，1983 年美国Wegner 等人最先发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系统。

其中毕赤酵母（P.pastoris）是继S.cerevisiae 之后被迅速推广的一种外源基因表达的宿主菌。

酿酒酵母难于高密度培养，分泌效率低，几乎不分泌分子量大于30 kD的外源蛋白质，也不能使所表达的外源蛋白质正确糖基化，而且表达蛋白质的C端往往被截短。

因此，一般不用酿酒酵母做重组蛋白质表达的宿主菌。

但是，可以通过基因敲除或改造用酿酒酵母表达亚单位疫苗(如HBV疫苗、口蹄疫疫苗等)或非蛋白活性物质及其中间体（如青蒿素，色素）。

与原核和其它真核表达系统相比，巴斯德毕赤酵母作为重组蛋白表达系统有以下优点[1]：（1）生长速率快，易于高密度培养（2）在几乎不含蛋白质的培养基中具有高水平产率（3）消除了内源毒性和噬菌体感染（4）易于对具有明确特征的酵母表达载体进行操作（5）对毕赤酵母的噬菌体对人没有病原性（6）具有多种翻译后修饰包括多肽折叠，糖基化，乙酰化，甲基化，蛋白质降解调控以及定位至亚细胞结构（7）能够构建分泌的蛋白，这样只需从生长培养基中提纯而不必收集酵母本身细胞。

毕赤酵母及级胰岛素——优思灵巴斯德毕赤酵母(P／ch／a pastor／s)表达系统是目前最优秀、应用最广泛的外源基因表达系统之一，它不但克服了大肠杆菌表达系统不能表达结构复杂的蛋白质、表达的蛋白多形成不溶性包涵体、背景蛋白多、表达产量低等缺陷，弥补了哺乳类细胞、昆虫细胞表达系统操作复杂、表达水平低、产业化生产造价昂贵的不足，还具有其他酵母表达系统无法比拟的优越之处。

酵母作为一种最简单的单细胞真核生物, 兼有原核生物和真核生物的某些优点。

毕赤酵母生活史与酿酒酵母十分相似。

这使得毕赤酵母的发酵工程部分可与酿酒酵母相同, 从而节省了重新购臵设备和进行新技术探索的巨额花费, 这是用其他方法进行大规模商品化的外源蛋白生产所不能比拟的优势。

现将毕赤酵母表达系统优点概括如下:①毕赤酵母更接近高等真核细胞, 不含内毒素和其他有害物质, 使用安全;②同酿酒酵母一样, 繁殖速度快, 对培养条件要求低, 培养基价廉, 能进行高密度培养, 且能耐受较高的液体静压, 便于工业化生产;②该系统的载体能与核基因组进行整合, 因此构建的菌株较稳定, 一般不会在传代过程中出现丢失现象;③在毕赤酵母中表达的蛋白既可存在于胞内, 又可在分泌信号作用下将蛋白分泌至胞外;⑤具有强有力的易控制的乙醇氧化酶基因(AOX1)或磷酸甘油酸脱氢酶( GAP) 基因启动子作为外源基因启动子, 可对外源蛋白的表达进行严格调控;⑥作为真核表达系统, 可对表达的外源蛋白进行翻译后的加工和修饰, 即二硫键的形成、脂肪的酰化、蛋白磷酸化、折叠、信号序列加工、N糖基化、O糖基化, 从而使目的蛋白具有所应有的生物学活性;⑦外源蛋白表达量高, 同时自身分泌的背景蛋白少, 表达产物易于纯化;⑧和酿酒酵母相比, 毕赤酵母中加到翻译蛋白上的糖链长度平均每条侧链为8～14个甘露糖残基, 比酿酒酵母每条侧链平均50～150个甘露糖残基短得多。

毕赤酵母极少出现过渡糖基化, 可避免外源蛋白生产过强的免疫原性或因糖链过长干扰外源蛋白正确折叠而影响其功能, 而且糖链中不含具有致敏作用的α21, 32甘露糖, 使其使用更加安全。

巴斯德毕赤酵母生物过程
巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种广泛用于重组蛋白生产的生物表达系统。

巴斯德毕赤酵母的生物过程涉及以下几个关键步骤：
1. 基因插入：通过同源重组将目标基因插入到巴斯德毕赤酵母的基因组中，通常插入到甲醇氧化酶（AOX1）基因的位置，利用其强启动子来实现高效表达。

2. 蛋白质表达：在甲醇的存在下，巴斯德毕赤酵母会被诱导产生大量的重组蛋白。

甲醇氧化酶是巴斯德毕赤酵母代谢甲醇的关键酶，其在细胞中的含量会随着甲醇的加入而显著增加，从而带动目标蛋白的表达。

3. 蛋白质折叠和修饰：巴斯德毕赤酵母具有真核生物的翻译后修饰能力，包括糖基化、二硫键形成等，这对于许多蛋白质的功能至关重要。

4. 蛋白质分泌：巴斯德毕赤酵母能够将重组蛋白分泌到培养基中，这有助于简化后续的纯化过程。

由于其内源分泌蛋白的产生有限，重组蛋白的纯化相对容易。

5. 过程优化：为了实现目标蛋白质的最大产量，需要对培养条件进行优化，包括甲醇和山梨糖醇的浓度、菌株的形式（Mut表型）、温度和孵育时间等因素的调整。

巴斯德毕赤酵母作为一种高效的表达系统，不仅操作简便，而且能够提供适当的蛋白质折叠和翻译后修饰，使其成为生产重组蛋白的理想选择。