毕赤酵母中高效引导外源蛋白分泌的信号肽的研究

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毕赤酵母表达系统是一种高效、灵活的工具，可用于外源蛋白表达研究和应用。

它是一种重要的生物工程技术，可以实现外来基因的大规模表达，分子量可达到200 KD 以上。

目前，毕
赤酵母表达系统已成功地用于各类重要蛋白质的表达，并发挥了重要作用。

毕赤酵母表达系统的优势在于它能够表达复杂的蛋白质，而且不受细胞因子的限制，能够有效提高蛋白表达的效率。

此外，该系统还具有良好的原核性、容易稳定表达、灵活的改造等特点。

因此，毕赤酵母表达系统被广泛应用于外源蛋白表达和重组蛋白的研究中。

例如，已成功利用该系统彻底破解人工合成水稻Hsp70基因编码蛋白的结构，它同时也是人类在蛋白研
究中的有力工具。

毕赤酵母表达系统在医学研究中也得到了很大的发展。

比如，可以用毕赤酵母表达系统来研究和表达病毒血管瘤病毒(HPV)-695E5蛋白，而这种蛋白可能会加速病毒复制和细胞侵入，因
此有助于治疗HPV相关的癌症。

利用毕赤酵母表达系统还可
以大规模表达多肽，如α-肌动蛋白及其相关蛋白，从而探索
肌钙蛋白的生物学功能。

总的来说，毕赤酵母表达系统是一种重要的生物工程技术，它能够实现外来基因的大规模表达，受益于它的灵活性和稳定性，可以成功用于外源蛋白表达及其相关研究与应用中，是一项具有重大意义的研究。

毕赤酵母表达实验手册作者：Jnuxz 来源：丁香园时间：2007-9-5大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。

然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。

大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。

另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。

包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。

大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。

但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。

近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。

因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。

［1］。

同时与大肠杆菌相比，作为单细胞真核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力。

酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。

1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因----干扰素基因［2］，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达［3、4、5、6］。

干扰素和胰岛素虽然已经利用酿酒酵母大量生产并被广泛应用，当利用酿酒酵母制备时，实验室的结果很令人鼓舞，但由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降。

利用强效可调控启动子AOX，已高效表达了HBsAg、TNF、EGF、破伤风毒素C片段、基因1工程抗体等多种外源基因［11、12、13］，证实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常适宜扩大为工业规模［14］11. 彭毅，杨希才，康良仪。

影响甲醇酵母外源蛋白表达的因素。

生物技术通报2000，4：33-3612. 11 3 Cregg JM . Tschopp JF Stillman C, et al .High-level expression and efficient assembly of hepatitis B surface antigen in the methylotrophic yeast pichia.pastoris Bio/Technology,1987,5:479-48513. Sreekrishma K , Nelles L ，Potenz R，et al .High-level expression ,purification ,and characterization of recombinant human tumor necrosis factor synthesized and characterization in the methylotrophic yeast pichia .pastoris ,Biochemistry ,1989,28:4117-412514. Siegel RS , Buckholz RG, Thill GP , et al .Production of epider growth factor in methylotrophic yeast cells, International Patent Application ,1990 ,Publication No:WO90/10697毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。

毕赤酵母表达系统研究进展马银鹏;王玉文;党阿丽;孔祥辉;张介驰【摘要】毕赤酵母是外源蛋白表达的一种重要宿主.毕赤酵母表达系统既具有原核表达系统操作简单、价格低廉、生产率高的优点,又具有真核表达系统能对表达后的蛋白折叠、糖基化和形成二硫键等翻译后进行加工和修饰的功能,因此毕赤酵母表达系统具有广泛的应用前景和重要的研究价值.本研究对毕赤酵母表达系统的特点、组成、影响外源基因高效表达的影响因素等进行总结.【期刊名称】《黑龙江科学》【年(卷),期】2013(004)009【总页数】5页(P27-31)【关键词】毕赤酵母;表达系统;外源蛋白;甲醇【作者】马银鹏;王玉文;党阿丽;孔祥辉;张介驰【作者单位】黑龙江省科学院微生物研究所,哈尔滨150010;黑龙江省科学院微生物研究所,哈尔滨150010;黑龙江省科学院微生物研究所,哈尔滨150010;黑龙江省科学院微生物研究所,哈尔滨150010;黑龙江省科学院高技术研究院,哈尔滨150020;黑龙江省科学院微生物研究所,哈尔滨150010;黑龙江省科学院高技术研究院,哈尔滨150020【正文语种】中文【中图分类】Q815大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统由于其具有遗传背景和生化特性清楚、成本低廉、操作简便、生产效率高等优点最早被采用作为外源基因表达系统。

但大肠杆菌表达系统缺少真核生物的蛋白翻译后进行加工和修饰的功能，表达的蛋白大部分以包含体形式存在，且需要经过复杂的复性才能恢复构象和活性以及背景杂蛋白较多[1］，为克服这些缺点，人们于1979年开发了酵母表达系统。

酵母是单细胞低等真核生物，既具有原核生物细胞生长速度快、容易培养、操作简单等优点，又具有真核生物表达时对蛋白质的加工和修饰等功能。

因此相对于原核表达系统表达出的不具有活性的蛋白，酵母表达出的蛋白是具有生物学活性的，而且酵母表达系统比其他真核表达系统如昆虫、哺乳动物组织等表达系统快速、简便、成本低[2］。

ISSN 058229879生物化学与生物物理学报ACT A BIOCHIMICA et BIOPHY SICA SINICA 2003,35(2):154-160CN 3121300/Q收稿日期:2002208221 接受日期:2002210216上海市科委重大项目(N o.993913002)和上海永业农科生物工程公司资助3联系人:T el ,021*********;Fax ,021*********;e 2mail ,yaoquanhong @信号肽序列对毕赤酵母表达外源蛋白质的影响熊爱生　彭日荷　李　贤　范惠琴　姚泉洪3　郭美锦1　张嗣良1(上海市农业科学院生物技术研究中心、上海市农业遗传育种重点实验室,上海201106;1华东理工大学生物工程学院,上海200237)摘要 乙醇氧化酶启动子被分离、克隆,并建立了转化方法后,毕赤酵母已被发展成为一种高效的外源蛋白表达宿主。

为了进一步提高外源蛋白质的分泌表达,对信号肽序列进行了研究。

首先按毕赤酵母的偏爱密码合成了酿酒酵母的α因子信号肽序列MF4I ,随后在MF4I 信号肽序列的N 端分别引入1～10个毕赤酵母Aox 1蛋白质的N 端氨基酸,构成10种不同的分泌信号肽序列,10种不同的分泌信号肽序列被用于植酸酶基因的毕赤酵母分泌表达。

以上新的信号肽序列都可使植酸酶的分泌表达量增加,而以N 端增加A 、I 、P 三个氨基酸的信号肽序列引起的提高最大;和野生型的酿酒酵母α因子信号肽序列相比,使植酸酶分泌表达量增加5倍,摇瓶中植酸酶的分泌表达量为90mg/L 。

此外在MF4I 信号肽的引导序列和内切蛋白酶间增加了E E A E A E A E P 和K 共10个氨基酸,进一步提高信号肽的分泌效率,使表达又提高约35%,使得摇瓶中酸性植酸酶的表达量达到120mg/L ,是pPCI9K 表达量的8倍。

关键词 毕赤酵母;信号肽序列;表达载体;高效表达 毕赤酵母(Pichia pastoris )系统是近年来发展很快的一个真核表达系统,许多有活性的蛋白质已经在毕赤酵母系统中大量表达。

毕赤酵母表达系统使用心得PichiaPichiaPichiaPichia酵母表达系统使用心得甲醇酵母表达系统有不少优点其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知并广泛应用于外源蛋白的表达。

虽然说酵母表达操作简单表达量高但是在实际操作中并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。

不少人在操作中会遇到这样那样的问题收集了部分用户在使用EasySelectPichiaExpressionSystem这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。

其中XiangYang是来自美国乔治城大学GeorgetownUniversityLombardi癌症中心LombardiCancerCenter部分用户来自国内。

甲基酵母部分优点与其他真核表达系统比较与原核表达系统比较1.属于真核表达系统具有一定的蛋白质翻译后加工有利于真核蛋白的表达优点-2.AOX强效启动子外源基因产物表达量高可以达到每升数克表达产物的水平3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物远较真核系统简单非常适合大规模工业化生产。

4.可以诱导表达也可以分泌表达便于产物纯化。

5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物部分甲醇酵母更可以甲醇等工业产物替代葡萄糖作为碳源生产成本低表示优胜于-表示不如表示差不多EasySelectPichiaExpressionSystem产品性能优点——使用简单表达量高His-tag便于纯化缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题全面产品报告及心得体会巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种一方面由于其是属于真核生物因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰另一方面毕赤酵母生长速度快可以将表达的蛋白分泌到培养基中方便蛋白纯化。

毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点MCR3端带有his-tag和c-mycepitopes这些tag有利于常规检测和纯化而且在MCR5端引入了alphafactorα-factor用以增加表达并且在表达后α-factor可以自动被切除。

摘要巴斯德毕赤酵母表达系统是分子学领域内被广泛应用于重组蛋白生产的主要系统之一，既具有操作简单，生长快等特点，又具有真核细胞的翻译后修饰加工系统。

在外源蛋白表达系统中，影响蛋白表达的一个主要因素是启动子活性。

启动子作为基因表达的重要调控元件，通过与转录因子相互作用控制基因转录的起始和表达水平，在转录水平上起重要作用，因而启动子活性的高低在很大程度上影响着蛋白的表达水平。

在毕赤酵母表达系统中，醇氧化酶基因的启动子P AOX1是最常用的启动子，已实现了各种外源蛋白的高效表达尤其是人源蛋白的表达。

但P AOX1是甲醇诱导型启动子，在食品、医药上的应用受到限制，且甲醇的储存和运输等存在火灾隐患，因此毕赤酵母非甲醇诱导的启动子在不断被开发。

根据本实验室对毕赤酵母转录组的研究数据，在以甘油为碳源的培养基中，转录水平最高的是被命名为GCW14(NCBI编号：XM_002490678) 的细胞壁蛋白基因，该基因为组成型表达，推断GCW14具有潜在的高活性启动子。

此外，根据已有的实验数据证明：敲除毕赤酵母基因组上的GCW14基因会降低以Gcw14p为锚定蛋白的CALB的表面展示酶活力，说明壁蛋白Gcw14p与外源蛋白表面展示的效果有关。

本研究将壁蛋白Gcw14p的启动子P GCW14应用于南极假丝酵母脂肪酶B（CALB）的毕赤酵母表达中，并与启动子P AOX1、P GAP、P TEF1的活性进行比较；对P GCW14启动子进行突变，初步探索该启动子的作用元件；将活性提高的突变启动子应用于CALB的表达中，提高CALB的酶活力，也为提高毕赤酵母外源蛋白的表达奠定基础。

主要研究内容如下：(1)为了比较P GCW14和其他3种启动子P AOX1、P GAP、P TEF1表达CALB的能力，构建了4种不同启动子的CALB表面展示重组菌：X33/ pPG14-CALB、X33/pZαA-CALB、X33/pPGAP-CALB和X33/pPTEF1-CALB。

巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展作者：方园园来源：《绿色大世界》2009年第12期摘要:经过近20年的不断开发和完善,巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)已经成为目前最成功的真核表达系统之一,被广泛用于医药生产、饲料添加剂开发和科学研究。

介绍了毕赤酵母的生物学特性、常用菌株和表达载体的特点及其研究进展,并阐述了其在外源蛋白的表达方面具有的独特优势。

关键词:毕赤酵母;表达载体;外源蛋白中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:1005-569X(2009)12-0037-031 引言巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)是一类在缺乏葡萄糖或甘油时,能利用甲醇做为唯一碳源和能源的酵母菌,具有旺盛的生命力,可以在廉价的非选择性培养基中生长,有较宽的生长pH适应范围(3.0～8.0),有较好的发酵基础,非常有利于实现高密度发酵培养,菌体密度可高达100g干细胞/L,它们生长的适宜温度一般为28～30℃,是常用的外源蛋白表达系统。

2 巴斯德毕赤酵母宿主菌株根据对甲醇利用的情况,P.pastoris可划分为三种表型:第一型,即Mut+型,此型毕赤酵母具有完整的AOX1和AOX2基因,在含甲醇的培养基中生长速率与野生型类似,称为甲醇利用正表型。

绝大多数毕赤酵母为Mut+表型,如GS115和SMD1168;第二型,即MutS型,此型毕赤酵母的AOX1基因部分敲除,被酿酒酵母ARG4基因所取代,AOX2虽然与AOX1有97 %的同源性,但在含甲醇的培养基内该型毕赤酵母生长缓慢,称为甲醇利用慢表型,如KM71(his4 arg4 aox1::ARG4);第三型,即Mut-型,此型毕赤酵母AOX1及AOX2基因均被敲除,细胞不能进行甲醇代谢,无法在甲醇中生长,为甲醇利用负表型,如MC100-3(his4 arg4 aox1::ARG4 aox2::Phis4)。

后两者表达外源蛋白有时优于野生株,且需甲醇较少,有时其表达量甚至高于Mut+型。

重组人β淀粉样蛋白1-42小规模发酵及小量纯化工艺的摸索申茉函;王全才;杨丽【摘要】目的研究重组人β淀粉样蛋白1-42(rhAβ1-42)在5L摇瓶中的高密度发酵实验,以及小量纯化工艺的方法.方法分别从甲醇浓度、pH、诱导时间等方面对毕赤酵母重组菌株产生rhAβ1-42的发酵过程进行了优化;通过硫酸铵沉淀目的蛋白、透析、脱盐和阴离子交换层析,对rhAβ1-42小量精确的纯化方法进行了研究.结果确定rhAβ1-42在毕赤酵母中分泌表达的最佳条件为:在pH6.0的条件下,以0.5％甲醇诱导72 h,经过硫酸铵沉淀目的蛋白、透析、脱盐和阴离子交换层析,rhAβ1-42纯度可达94％以上.结论确定了rhAβ1-42在毕赤酵母中分泌表达的最佳条件,建立了小量纯化rhAβ1-42的新方法.【期刊名称】《实用药物与临床》【年(卷),期】2015(018)003【总页数】4页(P256-259)【关键词】β淀粉样蛋白;发酵;小量纯化【作者】申茉函;王全才;杨丽【作者单位】中国医科大学附属盛京医院,沈阳 110004;辽宁省人民医院,沈阳110016;吉林大学人兽共患研究教育部重点实验室,长春130021【正文语种】中文阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)的病理特征以脑神经细胞外出现β-淀粉样蛋白(Aβ)聚集形成的神经斑或称老年斑、脑神经细胞内tau蛋白异常聚集形成的神经纤维缠结(NFT)、脑皮层神经细胞减少以及累及皮层动脉和小动脉的血管淀粉样变性为主[1]。

对β淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42)进行细胞学与动物实验学的研究需要一定的蛋白作为物质基础。

鉴于此，本研究在常规方法的基础上，进一步探讨了甲醇诱导浓度、pH值和诱导时间对毕赤酵母重组工程菌表达rhAβ1-42的影响，对该表达系统进行了小量纯化方法的探索，提高了重组工程菌中rhAβ1-42的表达量。

通过纯化获得高纯度的rhAβ1-42，更好地满足了研究老年性痴呆疾病细胞学和动物实验学的需要，从而为临床治疗提供指导。