毕赤酵母表达外源蛋白糖基化研究进展杨婕【摘要】Pichia pastoris as the host for the expression of recombinant proteins, has not only the advantages of prokaryotic expression system such as inexpensive in culture, ease of genetical manipulation, high levelsof protein expression, but also has post-translational protein processing capabilities like other higher eukaryotes such as protein folding, formation of disulfide bond and glycosylation. Gly-cosylation is an important form of posttranslational modification in secreted proteins and affects the structure and function of these pro-teins. In this review, we discuss protein glycosylation and humanized glycosylation engineering in Pichia pastoris.%毕赤酵母作为表达外源蛋白的宿主，不仅具有原核生物表达系统的优点，如培养成本低、遗传操作简单、表达效率高等，还可以对表达的外源蛋白进行翻译后修饰加工，如蛋白质折叠、二硫键形成和糖基化等，因而有其独特的优势。
在分泌蛋白修饰中，糖基化是一种重要修饰方式，影响蛋白的结构与功能。
本文就毕赤酵母对表达的分泌蛋白进行糖基化修饰及糖基人源化改造研究进展进行综述。
【期刊名称】《福建畜牧兽医》【年(卷),期】2014(000)002【总页数】3页(P20-22)【关键词】毕赤酵母;O-糖基化;N-糖基化;糖基人源化【作者】杨婕【作者单位】福建师范大学生命科学学院福州 350108【正文语种】中文由于生物体天然表达的蛋白量都比较低，从中提取蛋白质进行结构、功能研究或临床应用难度很大，因此，越来越多的生物学家选择重组表达进行研究或临床应用。
目前已有许多从不同表达系统中表达的重组蛋白被批准可以用于人的治疗，包括红细胞生成素，凝血因子和单克隆抗体等[1]。
外源基因的表达系统有原核和真核表达系统两大类，原核表达系统以E.coli应用得最多，真核表达系统主要有哺乳动物细胞表达系统、昆虫表达系统、酵母表达系统等。
毕赤酵母中近年发展起来的应用最为广泛的真核表达系统之一，原因在于毕赤酵母表达系统兼具原核表达系统和高等真核生物表达系统如昆虫细胞或CHO细胞特点。
表现为培养成本低，遗传操作简单，表达效率高，对表达的外源蛋白进行翻译后加工和修饰[2]。
自从投入商业化使用之后，毕赤酵母表达系统表达的外源蛋白的表达种类逐年增多，2006年已经有600多种的外源蛋白成功表达[3-5]。
但其对蛋白的糖基化修饰与高等真核生物相比有显著的不同，这可能会影响在其系统中表达的高等真核生物蛋白的结构和功能[6]。
本文就毕赤酵母对表达的分泌蛋白进行糖基化修饰及糖基人源化改造研究进展进行简要综述。
常见的外源基因表达系统有原核生物表达系统和真核生物表达系统。
原核生物表达系统是最早开发利用的表达系统，它的成本低，生活周期短，表达量高，容易培养等特点，但不能对表达的蛋白进行修饰。
真核生物表达系统主要有哺乳动物细胞表达系统，昆虫细胞表达系统，酵母表达系统。
目前开发出的酵母表达系统有两个--酿酒酵母和毕赤酵母表达系统，由于毕赤酵母在以下方面优于酿酒酵母而得到越来越多的应用：在发酵时不产生大量的酒精、有很强的诱导型启动子AOX1和糖基化修饰时添加的糖链比酿酒酵母来得短[7]。
不同的表达系统有其各自优势与局限性，在实际应用中应综合权衡各种因素，最终选择最适的表达系统（见表1）。
很多哺乳动物的天然蛋白质是经过糖基化的，所以为了保证重组蛋白的生物学活性进行正确的糖基化过程是很必要的[8]。
毕赤酵母对分泌的蛋白也会进行糖基化修饰，其生物学过程较为复杂。
根据糖链与蛋白质氨基酸残基上基团连接类型的不同，可以分为O-连接糖链与N-连接糖链。
O-糖链指的是寡糖与赖氨酸或脯氨酸的羟基相连，N-糖链指的是糖基与多肽链结构上的天冬酰胺-X-丝氨酸/苏氨酸（X为除脯氨酸以外的任何一种氨基酸）基序上的天冬酰胺相连。
2.1 O-糖基化和其他的酵母和真菌一样，毕赤酵母能将糖链连接到蛋白质苏氨酸或者丝氨酸上的羟基上。
毕赤酵母添加的寡糖只有甘露糖残基，更加高等的真核生物，例如哺乳动物，这些寡糖组成就有更加多变的糖结构包括N-乙酰氨基半乳糖，半乳糖和唾液酸。
不仅在糖链的组成上，在对糖基化蛋白选择上，毕赤酵母与高等真核生物也有很多不同，如有些蛋白在天然宿主中并不会被糖基化，但是毕赤酵母却能糖基化这些异源蛋白。
而有些蛋白在天然宿主中被糖基化，但在毕赤酵母中或许没有在丝氨酸和苏氨酸上糖基化它[9]。
毕赤酵母O-糖基化的程度已经在Aspergillus awamori葡糖糖化酶催化结构域上进行了研究[10]。
在毕赤酵母中分泌的葡糖糖化酶催化结构域的分子量比天然蛋白大20 kDa左右，分析表明大约有10 kDa由于N-糖基化，剩余的10 kDa由于O-糖基化，可能由20～30个甘露糖残基组成。
Mochizuki等在毕赤酵母表达人抗凝血酶Ⅲ，和天然的抗凝血酶Ⅲ相比，O-糖基化导致重组蛋白活性被抑制一半[11]。
这些研究结果表明由于毕赤酵母O-糖基化修饰与哺乳动物存在较大的差异，可能会对分泌蛋白活性产生严重的影响。
目前毕赤酵母对分泌蛋白进行O-糖基化修饰还不是很清楚。
2.2 N-糖基化N-连接糖基化有一个信号序列，其序列为Asn-Xaa-Ser/Thr。
研究发现这个信号序列对于N-连接的糖基化是必要的，但不总是充分的[12]。
毕赤酵母表达的外源蛋白蛋白质N-糖基化修饰起始于内质网。
葡萄糖、甘露糖、半乳糖、N-乙酰氨基葡萄糖与磷酸多萜醇形成一个共同的脂多糖前体Glc3Man9GlcNAc2，然后该前体被转运至新生肽链Asn-Xaa-Ser/Thr保守序列的天冬酰胺残基上。
随后在葡萄糖苷酶Ⅰ和Ⅱ的作用下切除三个葡萄糖残基，接着被内质网甘露糖苷酶Ⅰ切除一个甘露糖，形成Man8GlcNAc2结构[13]。
然后携带Man8GlcNAc2糖基的蛋白被转运到高尔基体，在ɑ-1,6-甘露糖基转移酶的作用下，ɑ-1,3-甘露糖分支末端添加一个甘露糖[14-15]，其他的甘露糖转移酶和磷酸甘露糖转移酶特异的识别此糖链结构，继续向上添加甘露糖和磷酸甘露糖，形成高甘露糖结构[16]。
甘露糖残基在毕赤酵母中一般为8～14个。
酿酒酵母则会增加更多的甘露糖，可高至40～150个，并且还会有α-1，3-甘露糖糖苷键，这大大增加了蛋白的免疫原性。
而在人类中则修去多余的甘露糖，加上半乳糖和唾液酸等其他的单糖形成复合多糖(complex glycan)。
在形成核心寡聚糖Man8GlcNA2后，哺乳动物和毕赤酵母中N-Man8GlcNA2聚糖的生物合成路径开始不同。
人开始卸载甘露糖残基，酵母和其他的真菌则添加甘露糖残基。
毕赤酵母的N-糖基化和哺乳动物与人的糖基化过程差异明显，容易形成以高甘露糖链为主的过度糖基化修饰，会引起免疫反应，限制了它作为药物蛋白使用。
因此对毕赤酵母糖基化过程进行改造是非常必要。
研究如何使毕赤酵母表达的蛋白具有与人相同或相似的糖基化是一项目非常有意义的工作。
做这项工作时研究人员的思路是利用基因工程手段往毕赤酵母中导入人类糖链加工基因，使得毕赤酵母能对其产生的糖链进行类似于人类细胞中的加工，产生的糖链与高等哺乳动物产生的糖链相同或相似，这项工程也被称之为糖基人源化工程（humanized glycosylation engineering）[1,17-21]。
第一：通过敲除或是使ɑ-1，6-甘露糖基转移酶基因（OCH1基因）失活：ɑ-1，6-甘露糖基转移酶可以将甘露糖添加到Man8GlcNA2寡糖链的ɑ-1，3连接的寡糖臂上从而形成Man9GlcNA2，然后甘露糖基转移酶继续添加甘露糖，导致有另外30多个甘露糖残基的多聚体的形成[16]。
因此为了避免酵母的高甘露糖现象，可以通过敲除或是使OCH 1基因失活来阻止ɑ-1，6-甘露糖的延伸。
第二：引入ɑ-1，2-甘露糖苷酶Ⅰ，进行降解甘露糖。
Davidson等发现敲除ALG3基因，可以达到引入ɑ-1，2-甘露糖苷酶Ⅰ同样的效果[22]。
酵母糖基人源化最后一步将唾液酸转移到复合的糖蛋白的末端β-1，4-半乳糖。
这一步是酵母糖基人源化最重要的一步。
最早开始在毕赤酵母中开展这项研究的是Callewaert等，他们共表达了Trichoderma reesei 1，2-alpha-D-mannosidase和二个糖蛋白influenza virus hemagglutinin及trypanasoma cruzi trans-sialidase基因。
结果表明，分泌的外源蛋白高甘露糖链明显减少，而类似人类中的甘露糖链Man5GlcNac2是糖蛋白中的主要糖链。
Callewaert等研究工作表明糖基化改造在毕赤酵母中是一条可行的方案，并开创了毕赤酵母糖基人源化的先河。
Hamilton S R等在糖基人源化方面进行了大量的卓有成效的研究。
2006年Hamilton S R等又通过敲除4个酵母特异性糖化基因，导入14个外源基因，使得改造后的工程菌90%以上的复合糖蛋白末端都被唾液酸化（sialylation），并且在用糖基化改造过的工程菌表达人源化的IgGs时得到证明[23]。
1993年毕赤酵母作为外源蛋白表达系统投入商业化以后，越来越受到欢迎，目前在该系统中已成功表达了众多蛋白。
虽然毕赤酵母表达系统有众多优点，但还有许多需要改进的地方。
除了本文提到的糖基化改进外，在蛋白折叠、分泌通道中的囊泡转运、前体蛋白加工、密码子偏好、信号肽等方面将是重点要考虑的地方。
今后随着各方面的改进，毕赤酵母作为外源蛋白表达系统的优势将变得越来越明显。
【相关文献】[1]Hamilton S R,Gerngross T U.Glycosylation engineering in yeast:the advent of fully humanized yeast[J].Current opinion in biotechnology,2007,18(5):387-392.[2]Cregg J M,Cereghino J L,Shi J,et al.Recombinant protein expression in Pichiapastoris[J].Molecular biotechnology,2000,16(1):23-52.[3]Cos O,Ramón R,Montesinos J L,et al.Operational strategies,monitoring and control of heterologous protein production in the methylotrophic yeast Pichia pastoris under different promoters:a review[J].Microbial Cell Factories,2006,5(1):17.[4]Macauley-Patrick S,Fazenda M L,McNeil B,et al.Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system[J].Yeast,2005,22(4):249-270.[5]Lin-Cereghino J,Hashimoto M D,Moy A,et al.Direct selection of Pichia pastoris expression strains using new G418 resistance vectors[J].Yeast,2008,25(4):293-299.[6]顾园,诸欣平,王少华.毕赤酵母表达蛋白质的糖基化[J].生命的化学,2004,24(4):353-355.[7]Grinna L S,Tschopp J F.Size distribution and general structural features of N-linked oligosaccharides from the methylotrophic yeast,Pichia pastoris[J].Yeast,1989,5(2): 107-115.[8]Bretthauer R K,Castellino F J.Glycosylation of Pichia pastoris-derivedproteins[J].Biotechnology and applied biochemistry,1999,30(3):193-200.[9]Cereghino J L,Cregg J M.Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[J].FEMS microbiology reviews,2000,24(1):45-66.[10]Heimo H,Palmu K,Suominen I.Expression in Pichia pastoris and purification of Aspergillus awamori glucoamylase catalytic domain[J].Protein expression and purification, 1997,10(1):70-79.[11]Mochizuki S,Hamato N,Hirose M,et al.Expression and Characterization of Recombinant Human Antithrombin III in<i>Pichia pastoris</i>[J].Protein expression and purification,2001,23(1):55-65.[12]Charlwood J,Bryant D,Mark Skehel J,et al.Analysis of N-linkedoligosaccharides:progress towards the characterization of glycoprotein-linked carbohydrates[J].Biomolecular engineering,2001,18(5):229-240.[13]Helenius A,Aebi M.Intracellular functions of N-linkedglycans[J].Science,2001,291(5512):2364-2369.[14]Nagasu T,Shimma YI,Nakanishi Y,et al.Isolation of new temperature-sensitive mutants of Saccharomyces cerevisiae deficient in mannose outer chain elongation[J].Yeast,1992,8(7):535-547.[15]Nakayama K-i,Nagasu T,Shimma Y,et al.OCH1 encodes a novel membrane bound mannosyltransferase:outer chain elongation of asparagine-linked oligosaccharides[J]. The EMBO Journal,1992,11(7):2511.[16]Gemmill T R,Trimble R B.Overview of N-and O-linked oligosaccharide structures found in various yeast species[J].Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-GeneralSubjects,1999,1426(2):227-237.[17]Hamilton S R,Davidson R C,Sethuraman N,et al.Humanization of yeast to produce complex terminally sialylated glycoproteins[J].Science,2006,313(5792):1441-1443. [18]Bobrowicz P,Davidson R C,Li H,et al.Engineering of anartificialglycosylationpathwayblockedincore oligosaccharide assembly in the yeast Pichia pastoris:production of complex humanized glycoproteins with terminal galactose[J].Glycobiology,2004,14(9):757-766.[19]Hamilton S R,Bobrowicz P,Bobrowicz B,et al.Production of complex human glycoproteins in yeast[J].Science, 2003,301(5637):1244-1246.[20]Vervecken W,Callewaert N,Kaigorodov V,et al.Modification of the N-glycosylation pathway to produce homogeneous,human-like glycans using GlycoSwitchplasmids[J].Methods Mol Biol,2007,389:119-138.[21]Vervecken W,Kaigorodov V,Callewaert N,et al.In vivo synthesis of mammalian-like,hybrid-type N-glycans in Pichia pastoris[J].Applied and environmental microbiology, 2004,70(5):2639-2646.[22]Davidson R C,Nett J H,Renfer E,et al.Functional analysis of the ALG3 gene encoding the Dol-P-Man: Man5GlcNAc2-PP-Dol mannosyltransferase enzyme of P.pastoris[J].Glycobiology,2004,14(5):399-407.[23]Li H,Sethuraman N,Stadheim T A,et al.Optimization of humanized IgGs in glycoengineered Pichia pastoris[J].Nature biotechnology,2006,24(2):210-215.。
