第六章基因克隆操作过程

基因工程的基本操作程序教案第一章：基因工程概述1.1 基因工程的定义介绍基因工程的定义和基本概念解释基因工程的目的是什么1.2 基因工程的历史回顾基因工程的发展历程介绍基因工程的重要里程碑和发现1.3 基因工程的应用领域列举基因工程在不同领域的应用实例讨论基因工程在医学、农业和工业等领域的潜力第二章：基因克隆与DNA重组技术2.1 基因克隆的概念与方法解释基因克隆的含义和目的介绍基因克隆的基本方法和步骤2.2 DNA重组技术介绍DNA重组技术的原理和过程解释DNA重组技术在基因工程中的应用2.3 克隆载体的选择与构建介绍克隆载体的概念和作用解释如何选择合适的克隆载体并进行构建第三章：基因表达与调控3.1 基因表达的概述解释基因表达的含义和过程介绍基因表达的调控机制3.2 基因表达载体的构建介绍基因表达载体的概念和作用解释如何构建基因表达载体3.3 基因表达与调控的应用举例说明基因表达与调控在基因工程中的应用实例讨论基因表达与调控在医学和农业等领域的重要性第四章：基因编辑技术4.1 基因编辑技术的概述介绍基因编辑技术的概念和原理解释基因编辑技术的重要性和应用领域4.2 CRISPR/Cas9技术详细介绍CRISPR/Cas9技术的原理和操作步骤举例说明CRISPR/Cas9技术在基因编辑中的应用实例4.3 基因编辑技术的应用与挑战讨论基因编辑技术在医学、农业等领域的应用前景探讨基因编辑技术所面临的伦理和安全性挑战第五章：基因工程的应用案例5.1 医学领域的应用案例介绍基因工程在医学领域的应用案例，如基因治疗、药物研发等5.2 农业领域的应用案例介绍基因工程在农业领域的应用案例，如转基因作物的开发等5.3 工业领域的应用案例介绍基因工程在工业领域的应用案例，如生物制药、生物燃料的生产等第六章：基因工程实验操作流程6.1 基因工程的实验室工具介绍基因工程实验中常用的工具和技术，如PCR、电泳、分子克隆等6.2 基因克隆的实验操作流程详细讲解基因克隆的实验步骤，包括DNA提取、扩增、克隆和序列分析等6.3 基因表达与调控的实验操作流程讲解基因表达与调控的实验步骤，包括载体构建、转化、表达和蛋白分析等第七章：基因编辑技术的实验操作7.1 CRISPR/Cas9系统的构建与验证详细讲解CRISPR/Cas9系统的构建步骤，包括sgRNA设计、载体构建和细胞转染等7.2 基因编辑的实验操作流程讲解基因编辑的实验步骤，包括细胞培养、基因编辑和编辑效果验证等7.3 基因编辑实验中的问题与解决方法分析基因编辑实验中可能遇到的问题，如脱靶效应、编辑效率低等，并提供解决方法第八章：基因工程的应用案例分析8.1 医学领域的应用案例分析分析基因工程在医学领域的应用案例，如基因治疗、药物研发等，探讨其优势和挑战8.2 农业领域的应用案例分析分析基因工程在农业领域的应用案例，如转基因作物的开发等，探讨其对农业生产的影响和争议8.3 工业领域的应用案例分析分析基因工程在工业领域的应用案例，如生物制药、生物燃料的生产等，探讨其产业化前景和挑战第九章：基因工程的伦理与法规9.1 基因工程的伦理问题探讨基因工程在伦理方面的问题，如基因隐私、基因歧视等，并提出相应的伦理原则和建议9.2 基因工程的法规管理介绍基因工程相关的法律法规，如生物安全、转基因生物管理等，并分析其对基因工程的影响和意义9.3 基因工程的国际合作与交流介绍基因工程在国际合作与交流方面的现状和发展趋势，如国际组织、合作协议等第十章：基因工程的未来展望10.1 基因工程的技术发展趋势分析基因工程技术的未来发展趋势，如CRISPR/Cas9系统的改进、基因编辑技术的应用拓展等10.2 基因工程在生物科学领域的应用前景探讨基因工程在生物科学领域的应用前景，如合成生物学、基因治疗等10.3 基因工程对社会发展的影响与挑战分析基因工程对社会发展的影响和挑战，如生物技术产业的发展、生物安全等问题，并提出应对策略和建议重点和难点解析一、基因工程的定义和目的：重点关注基因工程的定义和目的，理解基因工程的基本概念和应用领域。

根据基因转移方法的特性，重组DNA导入受体细胞的 方法有以下几种： •转化：将重组质粒导入受体细菌细胞，使受体细菌遗传 性状发生改变的方法； •转染：将携带外源基因的病毒感染受体细胞的方法（磷 酸钙沉淀法与体外包装法）； •微注射技术：将外源基因直接注射到真核细胞内的方法； •电转化法 •基因枪技术：又称微弹技术或高速离子轰击法； •脂质体介导法 •其他方法：快速冷冻法、碳化硅纤维介导法。
CaCl2使细菌发生休克后，立即进行转化（E.coli X1776
可长期冷藏，并保持其摄取DNA的能力）。 也可以采用Rb+、Mn2+、K+、二甲基亚砜、二流苏糖
醇（DTT）等制备感受态细胞。
CaCl2制备感受态细胞的一般过程：
•E.coli 接种于LB agar培养基，37℃培养一晚；
•挑选3-5个大菌落，接种于50ml LB培养基，37 ℃振摇培 养一晚后，在A550测定，要求细菌繁殖一定量（一般为对 数生长期）；
以病毒（噬菌体）为载体，转染宿主细胞的方法主 要有磷酸钙沉淀法和体外包装转染法。 一、磷酸钙沉淀法
磷酸钙沉淀法（磷酸钙-DNA共沉淀法），它能把外 源基因与λ噬菌体DNA的重组子导入大肠杆菌和哺乳动物 细胞，但转染效率仍不如体外包装法。
细胞具有摄取磷酸钙沉淀的双链DNA（吞噬DNA-磷酸 钙复合颗粒）的能力，几乎所有的双链DNA都可以通过这 种方法导入细胞。
第六章重组dna导入受体细胞????????????外源基因与载体在体外连接成重组体dna分子后需要将其导入受体细胞进行扩增和筛选得到大量单一的重组体分子这就是外源基因的无性繁殖即
第六章 重组DNA导入受体细胞
内容提要
•克隆与导入方法 •转化 •转染 •共转化 •电转化 •基因枪法 •微注射技术 •脂质体导入法 •转化酵母菌 •植物细胞的基因转移方法 •哺乳动物细胞基因导入法 •反转录病毒载体的转染

基因克隆
生物学名词
01 基本介绍
03 克隆过程
目录
02 相关技术
基因工程的上游工程主要是目的基因的制取和无性繁殖。具体地说是从生物体的组织、器官或细胞制取目的 基因或者人工合成目的基因，将目的基因与载体的DNA拼接，使重组体分子导入受体细胞，筛选和进行无性繁殖。 这个过程可以称为基因克隆(gene cloning)。
基因克隆是70年代发展起来的一项具有革命性的研究技术，可概括为∶分、切、连、转、选。最终目的在于 通过相应技术手段，将目的基因导入寄主细胞，在宿主细胞内目的基因被大量的复制。
基本介绍
基因是细胞内DNA分子上具有遗传效应的特定核苷酸序列的总称，是具有遗传效应的DNA分子片段。基因控制 蛋白质合成，是不同物种以及同一物种的不同个体表现出不同的性状的根本原因，即所谓"种瓜得瓜，种豆得豆"， "一母生九子，九子各不同"。基因通过DNA复制及细胞分裂把遗传信息传递给下一代，并通过控制蛋白质的合成 使遗传信息得到表达。
基因克隆技术的想法第一次出现在1972年11月在檀香山的一个有关质粒的科学会议上。（质粒是在细菌中发 现的DNA环。质粒携带某些对抗生素的耐药性的基因。）一直在研究质粒的史坦利·科恩，对赫伯特·博耶站上 的关于细菌酶切割DNA分子中的特定部分的介绍很感兴趣。在一个深夜游览威基基的一间熟食店两位科学家相遇 并谈到将合作领域的科学知识相结合，构思出了一个开创现代生物技术产业的实验。到1973年初，他们推出了一 系列的实验，得到方法来选择特定的外源基因在细菌中复制。
目的DNA片段的获得
DNA克隆的第一步是获得包含目的基因在内的一群DNA分子，这些DNA分子或来自于目的生物基因组DNA或来自 目的细胞mRNA逆转录合成的双链 cDNA分子。由于基因组DNA较大，不利于克隆，因此有必要将其处理成适合克隆 的DNA小片段，常用的方法有机械切割和核酸限制性内切酶消化。若是基因序列已知而且比较小就可用人工化学 直接合成。如果基因的两端部分序列已知，根据已知序列设计引物，从基因组DNA或cDNA中通过PCR技术可以获得 目的基因。

1总RNA提取(1) 液氮研磨或冰上匀浆实验资料；先将1mlTrizol加到离心管中待用(2) 将研磨好的样品加到离心管中混匀，室温放置5 min；掀开离心机预冷(3) 加200 µL氯仿，振荡15 sec，室温放置3 min，分层；(4) 4oC，12,000g，离心15 min；(5) 取上清，加500 μL异丙醇，混匀，室温放置10 min；(6) 4oC，12,000g，离心10 min；(7) 弃上清，加1 mL75%乙醇，漂浮洗涤沉淀，振荡充分；再用100%乙醇清洗(8) 4oC，7,500g，离心5 min；(9) 弃上清，离心，用枪吸取过剩液体，放在超净台里干燥后，加50 μL DEPC水，－80oC保管。

此操纵中所用到的器皿均需经过DEPC灭活RNA酶处理。

提取的总RNA需经RNA电泳检测质量，并用紫外分光光度计测定浓度。

OD260值为核酸的吸收值，OD280值为卵白的吸收值，OD260/280值在1.82.0间一般说明该核酸卵白含量在允许的规模内，可正常使用；另外还有OD230值为多糖和酚类的吸收值，比较干净的核酸OD260/230值能达到2.2左右。

RNA浓度计算公式：总RNA 浓度（µg/mL）=A260×稀释倍数×40。

2反转录/cDNA第一链的合成纯化RNA以去除基因组DNA，操纵按TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent with gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书进行。

其体系为：Total RNA 1μg5× gDNA Eraser Buffer 2μLgDNA Eraser 1μLRNase Free dH2O 补齐至10μL 条件为：42oC，2min；RNA纯化后，即可进行反转录。

其体系为：5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time）4μLPrimeScript RT enzyme mix Ⅰ1μLRT Primer Mix 1μL上一步的反响液10μLRNase Free dH2O 补齐至20μL 操纵条件为：(1) 37oC放置15 min；(2) 85oC，5 sec；(3) 4oC 保管。