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原代星形胶质细胞细胞培养方法
原代星形胶质细胞（primary astrocytes）是从胶质细胞含量较高的组织（如大脑皮层）中分离得到的。
其细胞培养方法如下：
1. 将新鲜脑组织剖出，用积聚素/液体软膜法（trypsin/liquid membrane method）进行酶解，使得细胞可以分离开来。
2. 使用无菌生理盐水或DMEM/F12将细胞悬液进行洗涤，然后放置在含有足够营养物质的培养基中，如DMEM。
3. 放置的培养皿需放置在37摄氏度、5% CO2和95%空气的恒温箱内，以提供最适宜的环境和养分。
4. 在培养初期，需要添加适当比例的血清（如胎牛血清），以提供必要的生长因子以及细胞所需的其它营养物质。
但在细胞数目增长到一定规模后，可将血清浓度逐步降低，以避免胎牛血清对实验结果的影响。
5. 定期更换培养基，以保证细胞在最佳的生长状态。
6. 如需进行实验或操作，需要将细胞从培养皿中移入滴定皿或其它相应容器中，并按照操作所需加入相应的药物或物质。
注意事项：
1. 在操作过程中需要尽可能避免对细胞的机械损伤，比如抽吸和强烈摇动。
2. 在移入滴定皿或其它操作容器时，需要注意细胞的密度，以避免过于稀疏或过于密集。
3. 在更换培养基、加药等操作时，需要十分温和，以避免对细胞造成伤害或死亡。
《大鼠毛囊神经嵴干细胞向星形胶质细胞的诱导分化》一、引言近年来，干细胞的研究已成为生物学和医学领域的重要课题。
其中，大鼠毛囊神经嵴干细胞（RMCNSCs）因其多能性和自我更新的特性，在神经科学、神经退行性疾病以及神经修复等领域具有巨大的应用潜力。
而星形胶质细胞作为中枢神经系统的重要组成成分，其在神经信号传递、突触可塑性等方面起着关键作用。
因此，研究大鼠毛囊神经嵴干细胞向星形胶质细胞的诱导分化，对于理解神经系统的发育和功能，以及为神经疾病的治疗提供新的思路和方法具有重要意义。
二、大鼠毛囊神经嵴干细胞大鼠毛囊神经嵴干细胞（RMCNSCs）是一类具有多向分化潜能的干细胞，其具有自我更新和分化的特性。
在适当的条件下，RMCNSCs可以分化为多种类型的细胞，包括神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等。
因此，RMCNSCs在神经系统疾病的治疗和修复中具有广泛的应用前景。
三、诱导分化的方法目前，诱导大鼠毛囊神经嵴干细胞向星形胶质细胞分化的方法主要包括体外诱导和体内诱导两种方式。
（一）体外诱导体外诱导通常是通过在培养基中添加特定的生长因子和细胞因子来实现的。
例如，通过添加成纤维细胞生长因子（FGF）和表皮生长因子（EGF）等，可以促进RMCNSCs的增殖和神经元的分化；而通过添加其他生长因子和抑制剂，可以诱导RMCNSCs向星形胶质细胞分化。
（二）体内诱导体内诱导主要是通过将RMCNSCs植入到受损的神经组织中，通过组织的微环境来诱导其向星形胶质细胞分化。
这种方法的优点是可以更好地模拟体内的环境，但需要更复杂的操作和技术。
四、诱导分化的机制大鼠毛囊神经嵴干细胞向星形胶质细胞的诱导分化是一个复杂的生物学过程，涉及到多种信号通路和基因的表达。
目前的研究表明，这个过程中涉及到的主要信号通路包括Wnt/β-catenin信号通路、Notch信号通路等。
这些信号通路的激活和抑制，可以影响RMCNSCs的增殖和分化方向。
此外，许多基因的表达也在这个过程中起着关键作用，如Sox2、Nestin等。
原代大鼠脑微血管内皮细胞的培养及鉴定马华根;唐元瑜;纪立金【摘要】目的:建立一种纯度较高的原代大鼠脑微血管内皮细胞的分离培养方法.方法:取7～10日龄SD大鼠脑组织,经匀浆,牛血清白蛋白密度梯度离心,Ⅱ型胶原酶消化获得脑微血管段后,置于CO2培养箱中进行原代培养.通过细胞形态学观察、第Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学染色鉴定所培养的细胞.结果:在倒置显微镜下,体外培养24～48 h后,细胞从贴壁的脑微血管段周围爬出,单个细胞为短梭形或多角形,呈团簇状单层贴壁生长,待细胞密集融合后,则成典型的“铺路石样”涡旋状排列;Ⅷ因子免疫细胞化学染色检测,相关抗原表达为阳性,细胞胞质显棕黄色,阳性细胞率达99％以上.结论:该方法能够成功分离培养出原代大鼠脑微血管内皮细胞.%Objective:To establish a method that can successfully separate and cultivate microvascular endothelial cells of rat brains in vitro.Methods:The microvascular segments of the rat brain were obtained from 7 to 10 d SD rats by homogenation,bovine serum albumin gradient centrifugation and digestion with collagenase type Ⅱ and then they were cultured in carbon dioxide incubator.The cultured cells were identified by cell morphology observation and immunohistochemical detection of Ⅷ factor-related antigen.Results:Under the inverted microscope,the cells in vitro cultured for 24 h to 48 h,emerged from the microvascular section of the wall.The cells were fusiform-shaped or polygonal-shaped,and proliferated in a clustered monolayer.The typical "paving pebbles" sample was observed after the cells became dense.The correlation antigen of Ⅷ factor was positive,the cytoplasm was brown,and the positive cells accounted formore than 99％.Conclusion:The method can successfully separate and cultivate microvascular endothelial cells of rat brains in vitro.【期刊名称】《解剖学杂志》【年(卷),期】2018(041)003【总页数】4页(P276-279)【关键词】脑;微血管内皮细胞;原代培养;Ⅷ因子相关抗原;大鼠【作者】马华根;唐元瑜;纪立金【作者单位】福建中医药大学中医学院,福州350122;福建中医药大学中医学院中医基础理论教研室,福州350122;福建中医药大学中医学院中医基础理论教研室,福州350122【正文语种】中文脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells, BMECs)是构成血脑屏障的主要成分之一,它能通过选择性双向跨细胞膜转运系统及细胞间的紧密连接将脑组织与体循环分隔开,限制蛋白质和大多数极性分子进入脑组织,只有少部分蛋白质和多肽能以转胞吞方式通过血脑屏障进入血液[1];并且BMECs在脑的物质代谢、纤溶与止血、免疫应答等方面也发挥着重要作用,与脑水肿、脑血管疾病的发生发展、脑肿瘤的浸润和扩散,尤其是脑肿瘤的血管生成等病理过程密切相关[2-3]。
·技术方法·一种改进的大鼠皮层神经元原代培养方法及其性质鉴定姜 茜,姜玉武■,王静敏,秦 炯,吴希如(北京大学第一医院儿科,北京 100034)[摘 要]目的:对原有大鼠皮层神经元原代培养方法进行改进,以获得数量更多、纯度更高、体外生长时间更长的神经细胞进行相关实验研究。
方法:使用3种不同成分的液体对培养器皿进行序贯预处理,分离16～17d 胎龄的Wi s t a r 大鼠胎鼠皮层,采用木瓜蛋白酶化学消化与机械吹打相结合的方法制备单细胞悬液,经细胞计数后按照不同实验目的进行梯度密度接种。
细胞接种当日4～6h 将含有血清的接种培养液换为添加B 27的N e u r o b a s a l 无血清培养基,培养第3天(D I V 3)用终浓度10μm o l /L 的阿糖胞苷(c y t o s i n e a r a b i n o s i d e ,A r a -C )处理24h 抑制胶质细胞增殖,以后每周半量换液1次。
用倒置相差显微镜观察细胞形态,利用神经元特异性标志物微管相关蛋白2(m i c r o t u b u l e -a s s o c i a t e dp r o t e i n 2,M A P 2)与细胞核双标记法鉴定培养神经细胞的纯度,并以免疫荧光法检测突触前、后标记物以评估突触形成情况。
结果:与单纯多聚赖氨酸预处理培养器皿,胰蛋白酶化学消化法分离细胞及含血清培养基培养的原方法相比,方法改进以后收获的细胞产量明显增加,且消化过程对细胞损伤小,接种后细胞分散均匀,杂质少,纯度高,树突、突触发育正常,可长期存活。
结论:该方法简便可行,结果稳定,用该方法培养的大鼠皮层神经元可作为神经元体外培养的良好实验模型。
[关键词]大脑皮质;神经元;细胞,培养的;木瓜蛋白酶;免疫组织化学[中图分类号]R 329.2 [文献标识码]A [文章编号]1671-167X (2009)02-0212-05d o i :10.3969/j .i s s n .1671-167X .2009.02.019A ni m p r o v e dm e t h o df o r p r i m a r y c u l t u r e o f r a t c o r t i c a l n e u r o n a n d c e l l i d e n t i f i c a t i o nJ I A N GQ i a n ,J I A N GY u -w u ■,WA N GJ i n g -m i n ,Q I NJ i o n g ,WUX i -r u (D e p a r t m e n t o f P e d i a t r i c s ,P e k i n g U n i v e r s i t y F i r s t H o s p i t a l ,B e i j i n g 100034,C h i n a )A B S T R A C T O b j e c t i v e :T o i m p r o v e p r e v i o u s m e t h o d o f p r i m a r y r a t c o r t i c a l n e u r o nc u l t u r e t o g e t p u r e ra n d m o r e l o n g -l a s t i n g c e l l s f o r s t u d y .Me t h o d s :T i m e d -p r e g n a n t W i s t a r r a t s a t a g e s t a t i o n a l a g e o f 16o r 17d a y s (16-17d )w e r e u s e d .F e t a lb r a i n s w e r e r e m o v e d a n d t h ec e r e b r a l c o r t i c e s w e r ed i s se c t e d o u t .P a p a i n d i g e s t i o na n dm e c h a n i c a l d i s s o c i a t i o nw e r ec o m b i n e dt oc o n d u c t m o n o -c e l l s u s p e n d i n g m e d i a .F o u r t o s i x h o u r s (4-6h )p o s t -p l a t i n g ,a l l p l a t i n g m e d i a w e r e r e m o v e df r o mc u l t u r e s a n d r e p l a c e d w i t h N e u r o b a s a l m e d i u ms u p p l e m e n t e d w i t h B 27.O n t h e t h i r d d a y ,10μm o l /L c y t o s i n e a r a b i n o s i d e (A r a -C )w a s a d d e d t o t h e c u l t u r e f o r 24h t o i n h i b i t t h e o u tg r o w t ho f g l i a l c e l l s .H a l f o f th e c u l t u r e m e di u mw a s c h a n g e d e v e r yw e e k .T h e m o r p h o l o g i c a l c h a n g e s o f n e u r o nc e l l s w e r eo b s e r v e db yl i g h t m i c r o s c o p e .D o u b l e i m m u n o -s t a i n i n g o f m i c r o t u b u l e -a s s o c i a t e d p r o t e i n 2(M A P 2)a n d k a r y o n w e r e a p p l i e d t o a s s e s s t h e c u l t u r e p u r i t y .E v a l u a t i o n o f s y n a p s e f o r m a t i o n w a s p r o c e s s e d b y i m m u n o c y t o c h e m i c a l a n a l y s i s u s i n g a n t i b o d i e s a g a i n s t b o t h p r e -a n d p o s t s y n a p t i c p r o t e i n m a r k e r s .R e s u l t s :T h e i m p r o v e d m e t h o d c o u l dr e -m a r k a b l y i n c r e a s e t h e c e l l n u m b e r a n d r e d u c e n e u r o n a l d a m n i f i c a t i o n .T h e p r i m a r y c u l t u r e w a s c h a r a c t e -r i z e d b y h i g h u n i f o r m i t y ,p u r i t y ,n o r m a l s y n a p s e f o r m a t i o n a n d l o n g t i m e l i v a b i l i t y .C o n c l u s i o n :T h i s i s a s i m p l e a n d r e l i a b l e t e c h n i q u e f o r t h e i n v i t r o p r i m a r y c u l t u r e o f r a t c o r t i c a l n e u r o n s .K E Y WO R D S C e r e b r a l c o r t e x ;N e u r o n s ;C e l l ,c u l t u r e d ;P a p a i n ;I m m u n o h i s t o c h e m i s t r y 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30270448、30470555、30870865)S u p p o r t e db yN a t i o n a lN a t u r a lS c i e n c eF o u n d a t i o no fC h i n a (30270448,30470555,30870865)■C o r r e s p o n d i n ga u t h o r 's e -m a i l ,j i a n g y w @263.n e t 神经细胞是构成神经系统的基本结构和功能单位。
精心整理
胶质细胞原代培养及纯化
2.1原代胶质细胞培养
1）于细胞培养前1d ，用0.05%PLL(orPLO)包被培养瓶，置5%CO 2培养箱中6h 以上，使用前用HBSS 液冲洗3次，备用；
2）1d 内的新生C57小鼠4只，置入75%乙醇中消毒后断头处死，75%乙醇中漂洗一次，迅速转移至预冷的HBSS （可加入双抗）中，弯镊从鼻部固定住头部，迅速剪开皮肤，换剪刀，从正中线剪
3HBSS 洗337℃4567）2008）91011胶质细胞；底层即是纯度较高的星形胶质细胞，收集小胶质细胞，离心重悬，接种于35mm 圆皿中；星形胶质细胞用0.25%胰酶消化按1：2传代，待长满后用于实验。
一般使用17～30d 内的星形胶质细胞。
#论 著#8-9个月SD 大鼠小胶质细胞的纯化分离培养耿 慧 钟 远=摘要> 目的 建立培养8-9个月SD 大鼠大脑皮层小胶质细胞的方法。
方法以M cCarthy 的方法为基础,并加以改进,采用振摇结合贴壁分离法纯化小胶质细胞;CD11b 免疫细胞化学染色对纯化的小胶质细胞纯度进行鉴定;相差显微镜下进行细胞形态观察和细胞计数;CCK-8比色法检测纯化的小胶质细胞在不同时间点的活力和增殖。
结果 培养的8-9个月SD 大鼠大脑皮层小胶质细胞,纯度达到95%,培养过程中未出现明显的增殖。
结论 8-9个月SD 大鼠大脑皮层的小胶质细胞在体外亦可成功培养,为小胶质细胞在老年疾病中的研究奠定了基础的。
=关键词>小胶质细胞;细胞培养;衰老;阿尔茨海默病中图分类号:R 331 文献标识码:A 文章编号:1006-351X (2010)02-0152-03The pr i m ary cu lture m e thod for isolation of m icrogli a fro m 8-9m on th rats GE N G H u i ,Z H ONG Yuan .D epart m entof G e ronti s m,the S i x t h P eop le s 'H osp ita l o f Shangha i Ji ao t ong U n i ve rs i ty ,Shangha i 200233,Ch i na Correspond i ng au thor : ZHONG Y uan ,Ema i:l zhongyuan60@yahoo =Abstract > O bjective T o se t up an easy and e ffecti ve m ethod for pr i m ary cu lti vate and pur ifi cation of the m i crog lia cells .M eth odsBased on class i ca lm i crog li a pri m ary cu lture m e t hod o fM cCa rt hy ,and w e i m proved th i sm ethod .In the l a ter pur ifi cation phase o f ce ll cu lti va tion ,m i crog lias w ere parall y ope ra ted and culti v ated w ith m echan ical separa ti on m ethod .M orpho log i c changes and the nu mber of ce lls were reco rded under the sa m e m agn ifi ed fi e l d o f scope .The acti v ity and t he pro liferati on w ere exam i ned by C ell Counting K it .R es u lts P resen t m od ifi edm ethod stead ily produced m icrog li a from 8-9m ont h SD rat w ith hi gh pur it y.N o sign ificant pro lifera ti on w as found i nnor m a l cu lt ura l cond iti on .Con clusi onThe m i crog lia ce lls i solated from 8-9m ont h SD rat can a lso be cu lti vatedsuccessfull y i n v itro ,prov i ding a basis f o r furt her research o f the m icrog lia i n A l zhe i m er d i sease .=K ey words >M icrog li a ;Ce ll culture ;A g i ng ;A lz he i m er s 'disease作者单位:200233上海,上海交通大学附属第六人民医院老年科通信作者:钟远,Em ai:l z hongyuan60@yahoo .co 小胶质细胞是脑内的免疫效应细胞,大约占中枢神经系统脑实质胶质细胞数量的10%。
星形胶质细胞和小胶质细胞培养文件编码（GHTU-UITID-GGBKT-POIU-WUUI-8968）胶质细胞原代培养及纯化2.1原代胶质细胞培养培养箱中6h以上，使用1）于细胞培养前1d，用0.05%PLL(orPLO)包被培养瓶，置5%CO2前用HBSS液冲洗3次，备用；2）1d内的新生C57小鼠4只，置入75%乙醇中消毒后断头处死，75%乙醇中漂洗一次，迅速转移至预冷的HBSS（可加入双抗）中，弯镊从鼻部固定住头部，迅速剪开皮肤，换剪刀，从正中线剪开颅骨，弯镊向两边剥去颅骨，去小脑，将脑组织置于含预冷的HBSS的60mm培养皿中；3）解剖显微镜下仔细剥离皮层表面脑膜和血管后置于含预冷的HBSS的60mm小皿中，用HBSS洗3次，留少量刚好盖过组织，用眼科弯剪剪碎组织（越碎越好），加入0.25%胰酶2mL，于37℃水浴中消化7min，消化过程中摇晃离心管数次，使消化均匀；4）加入含有血清DMEM/F12完全培养基10mL(1:1)终止消化；5）使用玻璃滴管或1mL枪头吹打（可将其头部略剪一部分，以扩大口径），若一次取的动物只数多，由于液体过多，可使用5mL枪头进行吹打，但因其吹打力度较大，操作时要尽量轻且吹打次数不宜过多；6）吹打过程采用分步吹打法，每吹打15~20下，静置1~2min，吸取上清，以避免已消化出的单细胞被过多吹打，该过程重复3次；7）200目筛网过滤至50mL离心管中，去除残余的组织块；8）1000r/min×5min，弃上清；9）调整细胞数为1～2×106/mL,接种到25cm2培养瓶中,每瓶5mL；10）接种24h后换以新鲜完全培养基，以除去悬浮死亡的细胞及碎片；11）细胞每3d更换培养液，培养10～12d左右细胞基本铺满瓶壁，进行纯化分离。
分离根据胶质细胞间贴附性不同进行，将培养瓶放入恒温振荡器中，37℃180rpm振荡5h，上层疏松贴壁的为小胶质细胞；底层即是纯度较高的星形胶质细胞，收集小胶质细胞，离心重悬，接种于35mm圆皿中；星形胶质细胞用0.25%胰酶消化按1：2传代，待长满后用于实验。
大鼠小胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案经过相关文献阅读，参考了众多对于小胶质细胞培养方案，对比了不同方案的利弊优缺，整合了相对符合本实验室条件和实验要求的方法，如有其他变更方案，以修改后为准。
1.实验材料剪刀、小镊子、小毛刷、DMEM/F12培养液、胎牛血清、0.05% 胰蛋白酶、PBS液、恒温细胞培养箱、倒青霉素、链霉素、培养皿离心管、50 mL 细胞培养瓶、CO2置相差显微镜、细胞板、小鼠抗大鼠OX42单克隆抗体、SP免疫组化试剂盒和新生SD大鼠等2.实验步骤2.1小胶质细胞的混合培养取新生SD大鼠若干只(出生24h内),在无菌条件下断头, 迅速剪开颅骨, 取出脑组织至盛有冷PBS 液的培养皿中反复冲洗以去除血污; 再把全脑移入另一盛有PBS 液的培养皿中, 用小毛笔轻轻刷去脑表面的脑膜和血管, 用PBS液冲洗后剪去脑干仅留大脑半球; 用小剪刀充分剪碎脑组织, 加入比组织块总量多30~50倍的0.05% 胰酶, 再移入50 mL 离心管, 用吸管反复吹打消化至肉眼观察无明显的脑组织团块; 加入DMEM/F12 完全培养基(含10%胎牛血清、100U/mL 青霉素和100 ug/mL 链霉素) 终止消化, 再次反复吹打制成单细胞悬液, 配平, 1000 r/ min, 离心5min, 弃上清; 加定量完全培养液再次制成细胞悬液, 更具实验需要接种入若干个50 mL细胞培养瓶或者培养皿中, 置于5%CO恒温细胞培养箱( 372度) 培养; 3 h 后更换1 次培养液, 以后每3 d 换1 次液, 并在镜下观察细胞的生长和存活情况。
2.2小胶质细胞的分离和纯化细胞培养18 d~20d左右, 在倒置相差显微镜下可观察到混和胶质细胞培养物中出现细胞分层现象, 即底层为扁平、多种形状的、具有多个突起的大细胞(星型胶质细胞) , 而上层细胞明显偏小呈类圆形、折光性强, 附着于星型胶质细胞表面生长(小胶质细胞) ; 倒掉培养液, 用0.05%胰酶2~ 3 mL 消化, 边观察边轻轻晃动培养瓶, 等到贴附在星形胶质细胞上的小胶质细胞脱离下来, 将含漂浮的小胶质细胞的消化液转入10 mL离心管, 立刻用完全培养基终止消化。
生理学报,1999年6月,51(3),291～296 291 Acta Physiologica Sinica大鼠星形胶质细胞组织因子活性的表达及其调控3朱发明33 文志斌 何晓凡 李俊成 贺石林(湖南医科大学生理教研室,长沙410078)摘 要 本实验观察了基础培养条件和凝血酶刺激条件下,大鼠星形胶质细胞组织因子活性的表达及其信号传递途径。
结果显示,基础条件下,A23187(42brom o calcium ionophore)和佛波醇脂(phorbol122myristate132acetate,P M A)能明显提高星形胶质细胞组织因子活性的表达,而三氟吡啦嗪(trifluoperazine,TFP)和12(52异喹啉磺胺)232甲基哌嗪[12(52is oquinolinyl sulfonyl)232methyl2piperazine,H7]则降低星形胶质细胞组织因子活性的表达。
凝血酶能明显增加星形胶质细胞表达组织因子活性;当凝血酶与TFP或H7联合应用时,凝血酶的刺激作用受到明显抑制。
实验表明,星形胶质细胞在基础培养条件下能表达组织因子,凝血酶能刺激它表达组织因子活性。
Ca2+/钙调素和PK C途径参与了在基础条件以及凝血酶刺激条件下星形胶质细胞组织因子活性的表达。
关键词:星形胶质细胞;组织因子;蛋白激酶C;钙调素;凝血酶学科分类号:Q461;R33111 近几年的研究表明,组织因子途径是生理性止血中凝血过程与病理条件下血栓形成的启动环节[1,2]。
组织因子(tissue factor,TF)作为因子Ⅶa的受体在组织因子途径中起关键性作用。
它广泛分布于脑、肺等组织。
血管内皮下的成纤维细胞、平滑肌细胞以及血管外的各种组织细胞都程度不同地表达组织因子,尤其在血管周围组织因子分布比较丰富,这对血液循环系统的完整性起着保护套的作用。
早已知道,脑组织富含组织因子,但长期来对它的来源并未确定。
新近发现星形胶质细胞(astrocyte,AS)是脑组织中TF的主要来源,并已达成广泛的共识[3,4]。
