大鼠小胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案

大鼠脊髓小胶质细胞体外纯化培养方法的建立陈雪;张婷;李彩红;王伟;骆翔;喻志源【摘要】Objective: To establish a simple and highly efficient primary culture method for microglia from rat spinal cord. Methods: Mixed glial cells were obtained from the spinal cord of newborn SD rats. On day 3, the culture medium was changed until the cultured microgila became fused on day 10. The microglia were purified using shocking methods (37 ℃, 180 rpm, 1~2 h) with different adhesion time (20~40 min). The isolated and purified microglia were identified with Iba1 and CD11b after 24 h. Results: The rat spinal cord microglia were successfully isolated and purified. The cultured microglia presented round or fusiform, highly refractive morpholo-gy. Iba1 and CD11b fluorescence tests showed that the purity of microglia was more than 95%. Conclusion:Using nutrition deprivation, Shock and different adhesion time methods, a primary spinal cord microglia culture method with high yield and purity was established, providing a useful tool for studying rat spinal cord microglia in vitro.%目的：建立一种简易高效的大鼠脊髓小胶质细胞原代培养方法。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011021176.7(22)申请日 2020.09.25(71)申请人 南京中医药大学地址 210023 江苏省南京市栖霞区仙林大道138号(72)发明人 郭杨　吴承杰　马勇　潘娅岚　涂鹏程　王礼宁　刘孟敏　孙杰　杨光露　(74)专利代理机构 南京经纬专利商标代理有限公司 32200代理人 余俊杰(51)Int.Cl.C12N 5/079(2010.01)(54)发明名称脊髓损伤大鼠原代小胶质细胞分离方法及应用(57)摘要本发明公开了脊髓损伤大鼠原代小胶质细胞分离方法及应用，本发明所述方法将脊髓损伤短期内的大鼠作为试验原料，通过简单的研磨、过滤等步骤很快即可获得数量可观、高纯度的小胶质细胞；该方法大大缩短了传统方法提取小胶质细胞的时间，并为实时动态检测在体小胶质细胞的功能提供了基础；所述方法克服了传统小胶质细胞纯化难工艺成本高的不足，能够高效、经济地获得高纯度的小胶质细胞，为脊髓损伤后小胶质细胞的研究提供基础。

权利要求书1页 说明书3页 附图2页CN 112011509 A 2020.12.01C N 112011509A1.脊髓损伤大鼠原代小胶质细胞分离方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：第1步、脊髓损伤大鼠模型制备a、使用SD大鼠，测量体重后进行腹膜内麻醉，剃除背部鼠毛，铺巾并用碘伏消毒，使用无菌器械切开皮肤、分离肌肉筋膜、咬除椎板并完整暴露脊髓；b、采用脊髓打击器打击脊髓，然后缝合皮肤，术后用碘伏消毒、定期排尿并注意保暖；第2步、小胶质细胞的分离培养c、将步骤b饲养1-14天的大鼠模型处死，消毒后使用无菌器械取出受损区脊髓，漂洗后置于0℃的DMEM/F12(HAM)完全培养基中剥离、剔除脊膜和血管；d、将脊髓置于滤网上，研磨后采用DMEM/F12(HAM)完全培养基冲洗于离心管中，离心后弃上清并重悬；e、接种d步骤的重悬细胞，37℃、5％CO 2培养箱中孵育后换液培养；第3步、小胶质细胞的鉴定f、取步骤e培养的细胞，采用CD11b免疫荧光染色法鉴定为小胶质细胞。

#论 著#8-9个月SD 大鼠小胶质细胞的纯化分离培养耿 慧 钟 远=摘要> 目的 建立培养8-9个月SD 大鼠大脑皮层小胶质细胞的方法。

方法以M cCarthy 的方法为基础,并加以改进,采用振摇结合贴壁分离法纯化小胶质细胞;CD11b 免疫细胞化学染色对纯化的小胶质细胞纯度进行鉴定;相差显微镜下进行细胞形态观察和细胞计数;CCK-8比色法检测纯化的小胶质细胞在不同时间点的活力和增殖。

结果 培养的8-9个月SD 大鼠大脑皮层小胶质细胞,纯度达到95%,培养过程中未出现明显的增殖。

结论 8-9个月SD 大鼠大脑皮层的小胶质细胞在体外亦可成功培养,为小胶质细胞在老年疾病中的研究奠定了基础的。

=关键词>小胶质细胞;细胞培养;衰老;阿尔茨海默病中图分类号:R 331 文献标识码:A 文章编号:1006-351X (2010)02-0152-03The pr i m ary cu lture m e thod for isolation of m icrogli a fro m 8-9m on th rats GE N G H u i ,Z H ONG Yuan .D epart m entof G e ronti s m,the S i x t h P eop le s 'H osp ita l o f Shangha i Ji ao t ong U n i ve rs i ty ,Shangha i 200233,Ch i na Correspond i ng au thor : ZHONG Y uan ,Ema i:l zhongyuan60@yahoo =Abstract > O bjective T o se t up an easy and e ffecti ve m ethod for pr i m ary cu lti vate and pur ifi cation of the m i crog lia cells .M eth odsBased on class i ca lm i crog li a pri m ary cu lture m e t hod o fM cCa rt hy ,and w e i m proved th i sm ethod .In the l a ter pur ifi cation phase o f ce ll cu lti va tion ,m i crog lias w ere parall y ope ra ted and culti v ated w ith m echan ical separa ti on m ethod .M orpho log i c changes and the nu mber of ce lls were reco rded under the sa m e m agn ifi ed fi e l d o f scope .The acti v ity and t he pro liferati on w ere exam i ned by C ell Counting K it .R es u lts P resen t m od ifi edm ethod stead ily produced m icrog li a from 8-9m ont h SD rat w ith hi gh pur it y.N o sign ificant pro lifera ti on w as found i nnor m a l cu lt ura l cond iti on .Con clusi onThe m i crog lia ce lls i solated from 8-9m ont h SD rat can a lso be cu lti vatedsuccessfull y i n v itro ,prov i ding a basis f o r furt her research o f the m icrog lia i n A l zhe i m er d i sease .=K ey words >M icrog li a ;Ce ll culture ;A g i ng ;A lz he i m er s 'disease作者单位:200233上海,上海交通大学附属第六人民医院老年科通信作者:钟远,Em ai:l z hongyuan60@yahoo .co 小胶质细胞是脑内的免疫效应细胞,大约占中枢神经系统脑实质胶质细胞数量的10%。

大鼠小胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案经过相关文献阅读，参考了众多对于小胶质细胞培养方案，对比了不同方案的利弊优缺，整合了相对符合本实验室条件和实验要求的方法，如有其他变更方案，以修改后为准。

1.实验材料剪刀、小镊子、小毛刷、DMEM/F12培养液、胎牛血清、0.05% 胰蛋白酶、PBS液、恒温细胞培养箱、倒青霉素、链霉素、培养皿离心管、50 mL 细胞培养瓶、CO2置相差显微镜、细胞板、小鼠抗大鼠OX42单克隆抗体、SP免疫组化试剂盒和新生SD大鼠等2.实验步骤2.1小胶质细胞的混合培养取新生SD大鼠若干只(出生24h内),在无菌条件下断头, 迅速剪开颅骨, 取出脑组织至盛有冷PBS 液的培养皿中反复冲洗以去除血污; 再把全脑移入另一盛有PBS 液的培养皿中, 用小毛笔轻轻刷去脑表面的脑膜和血管, 用PBS液冲洗后剪去脑干仅留大脑半球; 用小剪刀充分剪碎脑组织, 加入比组织块总量多30~50倍的0.05% 胰酶, 再移入50 mL 离心管, 用吸管反复吹打消化至肉眼观察无明显的脑组织团块; 加入DMEM/F12 完全培养基(含10%胎牛血清、100U/mL 青霉素和100 ug/mL 链霉素) 终止消化, 再次反复吹打制成单细胞悬液, 配平, 1000 r/ min, 离心5min, 弃上清; 加定量完全培养液再次制成细胞悬液, 更具实验需要接种入若干个50 mL细胞培养瓶或者培养皿中, 置于5%CO恒温细胞培养箱( 372度) 培养; 3 h 后更换1 次培养液, 以后每3 d 换1 次液, 并在镜下观察细胞的生长和存活情况。

2.2小胶质细胞的分离和纯化细胞培养18 d~20d左右, 在倒置相差显微镜下可观察到混和胶质细胞培养物中出现细胞分层现象, 即底层为扁平、多种形状的、具有多个突起的大细胞(星型胶质细胞) , 而上层细胞明显偏小呈类圆形、折光性强, 附着于星型胶质细胞表面生长(小胶质细胞) ; 倒掉培养液, 用0.05%胰酶2~ 3 mL 消化, 边观察边轻轻晃动培养瓶, 等到贴附在星形胶质细胞上的小胶质细胞脱离下来, 将含漂浮的小胶质细胞的消化液转入10 mL离心管, 立刻用完全培养基终止消化。

大鼠少突胶质细胞体外培养方法作者：孟赞唐栎来源：《科学与财富》2018年第20期摘要：目的：體外培养高纯度的少突胶质细胞。

方法：取SD乳鼠脑皮质，用增殖培养基联合EDTA消化机械吹打分离纯化法培养纯化；光学显微镜观察细胞形态；纯化培养3d后免疫荧光染色鉴定细胞类型。

结果：获得高纯度的少突胶质前体细胞以及成熟的少突胶质细胞，少突胶质前体细胞免疫荧光A2B5标记阳性，成熟少突胶质细胞免疫荧光MBP标记阳性。

结论：用增殖培养基联合EDTA消化机械吹打分离纯化法可以得到高纯度的少突胶质前体细胞以及成熟少突胶质细胞。

关键词：少突胶质细胞；原代培养；细胞增殖；EDTA少突胶质细胞（oligodendrocytes， OLs）是中枢神经系统中胶质细胞的[1]。

少突胶质细胞由少突胶质前体细胞（oligodendrocyte progenitor cells， OPCs）分化成熟而来，少突胶质细胞生长发育的损伤可致脱髓鞘疾病导致神经系统损伤[2]，因此研究少突胶质细胞的损伤机制，促进少突胶质细胞修复是我们的目标。

所以得一种简单高效的培养少突胶质细胞的方法具有重要的意义。

本实验在传统的培养方法的基础上，对细胞增殖和分离纯化等相应步骤进行了适当改进，简化了实验操作步骤，节约了实验成本，成功获取了大量的少突胶质细胞，为研究少突胶质细胞的损伤的其分子机制奠定基础。

材料和方法1 材料清洁级出生0～3d SD乳鼠，雌雄不限，动物饲养环境为清洁级，实验过程对动物的处置符合相关动物伦理学要求，B104神经母细胞瘤细胞株，DMEM/F12，胎牛血清，胰酶，多聚赖氨酸（PDL），小鼠抗 A2B5 抗体，羊抗小鼠髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein，MBP）等。

2 方法2.1 B104CM的收集和存储 B104细胞在20ml （DMEM/F12+10%FBS）培养基，75cm2的培养瓶中常规培养，细胞80%～90%融合时，弃去废液，加入10 ml（DMEM/F12 + 1% N2 supplement）培养液，4d后收集上清液备用。

大鼠少突胶质细胞的纯化培养与鉴定【摘要】目的探讨新生2 d Sprague Dawley(SD)大鼠脑少突胶质细胞的分离方法和生长条件，为少突胶质细胞损伤后髓鞘形成障碍或脱髓鞘疾病的研究奠定基础。

方法根据星形胶质细胞和少突胶质细胞的生长时间差异、细胞生长方式及细胞对培养层粘附等特性的不同，采用两次恒温摇床振荡分离纯化法和条件限定培养基培养获取并鉴定高纯度的大鼠少突胶质细胞。

结果培养出突起有如蜘蛛网状的成熟少突胶质细胞，半乳糖脑苷脂（Galactocerebroside，Gal）阳性。

结论两次恒温摇床振荡分离纯化法和条件限定培养基培养可获取高纯度的大鼠少突胶质细胞。

【关键词】少突胶质细胞；细胞培养；纯化；鉴定Abstract: Objective To culture, purify and identify the astrocytes and oligodendrocytes from rat cerebral tissue. Methods Based on the different properties of developmental time courses，cellular adhesions and growth pattern of astroglial cells and oligodendrocytes，oligodendrocytes were cultured and purified by orbital shaking for twice and the defined culture medium and identified by immmunofluorescent staining. Results The ripe oligodendrocytes were cultured and identified by galactocerebroside. Conclusion The method we used was suitable and effective to obtain oligodendrocytes.Keywords: oligodendrocyte; cultivation; purification;identification少突胶质细胞是中枢神经系统的髓鞘形成细胞，它起源于胚胎神经管的神经上皮细胞，随着中枢神经系统的发育，逐步迁移到白质，并增殖、分化，形成髓鞘包裹轴突。

新生大鼠原代小胶质细胞分离培养方法的改良钱凯;唐琳俊;王希;杨坤;张开鑫;钱腾达;马涛;石晶;李立新【摘要】目的研究改良体外小胶质细胞分离培养的方法及效果.传统法存在动物用量大、成本高且细胞培养时间长等局限.方法结合消化试剂组合和手摇震荡法培养分离小胶质细胞;同时采用Iba-1免疫荧光法进行细胞鉴定和纯度分析, 台盼蓝染料法进行活力检测以及脂多糖刺激比较不同状态的小胶质细胞.结果改良法可在4 d 内稳定获得小胶质细胞＞1. 0×106个/60 mm培养皿, 纯度≥98％, 活力＞ 98％, 较传统法在动物用量、总成本和培养时间分别减少了2、3. 2、1. 5倍.结论改良法可减少动物用量、降低成本, 缩短细胞培养时间;为研究小胶质细胞的生物学功能和中枢神经系统疾病机制建立了一种稳定、简便、高效的细胞模型.%Objective Isolation and culture of microglia in vitro has been widely used to explore new therapeutic strategies for various central nervous system diseases, but the existing protocols need a large amount of animal, higher cost and long culture time. Methods Combination of a unique combination of digestive reagents and shaking by hand were used to isolate and purify microglia. The purity of isolated cells was identified by expression of Iba-1 utilizing immunofluorescence technique and the viability of microglia was determined with trypan blue exclusion. Meantime, comparing the different states of microglia using the lipopolysaccharide test.Results The present modified methodology steadily yielded 1. 0 × 106 microglia per 60 mm dish with high purity (≥ 98％) and high survival rate (＞ 98％) within four days. Compared to the existing protocols, the animal dosage, total cost and culture time were reduced by 2, 3. 2 and 1. 5 times, respectively.Conclusion The improved method establishes a stable, simple and efficient cell culture model for studying the biological functions of microglia and elucidating the mechanisms of related CNS diseases.【期刊名称】《临床神经外科杂志》【年(卷),期】2019(016)001【总页数】5页(P1-5)【关键词】小胶质细胞;原代培养;新生大鼠【作者】钱凯;唐琳俊;王希;杨坤;张开鑫;钱腾达;马涛;石晶;李立新【作者单位】南京医科大学第一附属医院神经外科,210029 南京;安徽省芜湖市第二人民医院神经外科;南京医科大学第一附属医院神经外科,210029 南京;南京脑科医院神经外科,210029 南京;南京医科大学第一附属医院神经外科,210029 南京;南京医科大学第一附属医院神经外科,210029 南京;南京医科大学第一附属医院神经外科,210029 南京;南京医科大学第一附属医院神经外科,210029 南京;南京医科大学第一附属医院神经外科,210029 南京【正文语种】中文【中图分类】RQ78;RQ-33小胶质细胞是一类起源于单核-巨噬细胞系、位居于中枢神经系统的细胞种群[1]。

原代神经小胶质细胞培养方法的初探廖婷;袁雪;荣曦;刘红【摘要】目的:建立一种简单有效的小胶质细胞原代培养和纯化方法.方法:取出生24h的SD大鼠的脑皮层组织,胰酶消化成单个细胞、培养,待细胞长满培养瓶后,用力拍打培养瓶3min,离心并收集沉淀,加入新培养基再培养,采用免疫荧光法鉴定其纯度.结果:共聚焦显微镜鉴定小胶质细胞纯度达到96.85％.结论:拍击法提纯小胶质细胞的培养方法产量多,纯度高,为小胶质细胞在神经退行性疾病相关研究提供了基础.%Objective:To establish a simple and efficient method for the separation and purification of primary microglia.Methods:The cerebral cortex tissues were collected from one-day-old neonatal SD rats,and cells were obtained through trypsin digestion.The single cell suspension was then cultured.After the cells were confluent on the bottom of the culture flask,the culture flask was vigorously tapped for 3min,then centrifuged and the precipitate was collected and cultured again.The purity was identified by immunofluorescence. Results:The purity of microglia was96.85％.Conclusion:Vigorously tapping the culture flask could achieve high yield and high purity of microglia,and it provided the foundation for the study of microglia in neurodegenerative diseases.【期刊名称】《广西医科大学学报》【年(卷),期】2019(036)004【总页数】4页(P650-653)【关键词】小胶质细胞;原代培养;纯化方法;神经退行性疾病【作者】廖婷;袁雪;荣曦;刘红【作者单位】广西医科大学第一附属医院老年内分泌科,南宁 530021;广西医科大学第一附属医院老年内分泌科,南宁 530021;广西医科大学第一附属医院老年内分泌科,南宁 530021;广西医科大学第一附属医院老年内分泌科,南宁 530021【正文语种】中文【中图分类】R741小胶质细胞在中枢神经系统的损伤及疾病转归过程中起着重要作用[1]。

小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案小鼠星形胶质细胞（astrocytes）是中枢神经系统中一种重要的胶质细胞，主要起支持和维护神经元生存、供能以及调节神经元活动等功能。

原代培养和分离纯化小鼠星形胶质细胞是研究其生物学特性和相关疾病发生机制的重要实验方法。

以下是一种常用的小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案。

实验材料和仪器：1.小鼠（新生仔小鼠）2.离心管、培养皿、显微镜3.无菌生理盐水、套管、吸头4. DMEM/F12培养基、FBS、胰蛋白酶、DNase I5.离心机、试管摇床、显微镜、离心管架6.显微针、细胞计数板、加热振荡器实验步骤：1.小鼠的准备：a.使用新生仔小鼠，从母鼠的子宫中取出。

b.将小鼠头部朝下放在无菌生理盐水中，用套管轻轻吸出小鼠颅内的脑组织。

c.将脑组织转移到含有DMEM/F12培养基的离心管中，并用离心管摇床低速振荡15-20分钟使细胞均匀分散。

2.细胞分离：a.将离心管架放在显微镜下，用显微针将脑组织均匀挫碎。

b.将脑组织转移到含有DMEM/F12培养基的培养皿中。

c. 添加0.25%胰蛋白酶和10 U/ml DNase I，37°C孵育30分钟。

d.轻轻吸入含有酶切的脑组织，并用吸头轻轻洗涤脑组织，收集上清液。

e.将上清液通过0.22μm的滤网过滤，除去大颗粒的细胞。

3.细胞培养：a. 将滤过后的细胞悬液计数，计算细胞密度并将其稀释至10^6细胞/ml。

b.取DMEM/F12培养基，添加10%FBS，将稀释后的细胞悬液转移到培养皿中。

c.在培养皿中加入5%CO2，37°C孵育。

d.每两天更换一次培养基，直到细胞至80%～90%的密度。

4.纯化小鼠星形胶质细胞：a.将培养皿中的细胞收集到离心管中，进行离心。

b.用无菌生理盐水洗涤细胞，去除不附着的细胞和残留的培养基。

c.将洗涤后的细胞用DMEM/F12培养基重新悬浮，计数并计算细胞密度。

d.用磁层细胞分选仪，通过细胞表面标记的抗体对细胞进行阳性选择，分离纯化小鼠星形胶质细胞。

原代小胶质细胞提取简介小胶质细胞是中枢神经系统中的一类非神经元细胞，主要起到支持和修复神经元的作用。

提取原代小胶质细胞是进行相关研究的重要步骤之一，本文将详细介绍原代小胶质细胞提取的方法和步骤。

材料和仪器•新鲜解剖的小鼠或大鼠脑组织•离心管和离心机•细胞培养液（DMEM/F12等）•消化酶（如胰蛋白酶和DNA酶）•细胞培养皿或培养板•显微镜•血红蛋白溶解液•离心管和适当的离心速度方法步骤1.将新鲜解剖的小鼠或大鼠脑组织置于含有细胞培养液的离心管中，并使用显微镜进行清洗和去除非脑组织部分。

2.将脑组织放入含有消化酶的细胞培养液中，使用离心机在适当的温度和时间下进行消化。

消化的时间和温度需要根据具体实验目的和消化酶的种类进行调整，一般情况下为37摄氏度下1-2小时。

3.在消化过程中，每隔一段时间用吸管轻轻地反复吸取和释放溶液，以充分分散细胞和加速消化过程。

4.消化完成后，用细胞培养液洗涤细胞多次，以去除消化酶和细胞碎片等杂质。

5.将洗净的细胞转移至含有细胞培养液的细胞培养皿或培养板中，置于带有5%CO2的恒温培养箱中进行培养。

通常在37摄氏度下培养48-72小时。

6.每隔一段时间观察培养皿或培养板中的细胞形态和数量，并进行必要的培养液更换。

7.当细胞达到适当状态后，使用血红蛋白溶解液进行裂解，以释放胶质细胞内的胶质酸球。

8.使用离心机将细胞裂解物离心，以去除细胞碎片和核酸等杂质。

9.取得清除杂质的细胞裂解物，即可得到纯净的原代小胶质细胞。

结论通过本文介绍的方法和步骤，可以提取到纯净的原代小胶质细胞，用于进一步的研究和实验。

在进行实验前，需要根据具体实验目的和研究要求对提取步骤进行相应的调整和优化。

同时，保持细胞培养的良好条件和适当的观察，有助于获得质量优良的小胶质细胞，为相关研究提供可靠的实验基础。

以上是关于原代小胶质细胞提取的详细步骤和方法介绍，希望对相关研究工作者有所帮助。

大鼠原代细胞培养步骤
大鼠原代细胞培养是指从活体组织中分离出的未经连续传代的细胞进行培养和繁殖。

以下是大鼠原代细胞培养的一般步骤：
1. 材料准备：准备培养皿、培养基、PBS（磷酸盐缓冲液）、消化酶、抗生素等。

2. 组织采集：使用无菌操作将大鼠体内所需组织（如肝脏、脾脏、肺组织等）取出。

3. 组织处理：将采集到的组织置于PBS中，用显微刀或剪刀切碎组织，使其细胞释放出来。

4. 细胞分散：使用适当的消化酶（如胰蛋白酶）对组织进行消化，使细胞分散开来。

5. 筛选和洗涤：倒入含有培养基的离心管中，并通过滤网筛除组织碎片、未被消化的残余物等。

6. 细胞计数：使用细胞计数板或细胞计数仪对细胞进行计数，以确定合适的细胞密度。

7. 细胞培养：将细胞悬浮液均匀地分配到预先消毒的培养皿中，并加入适量的培养基。

8. 培养条件：将培养皿放置在恒温培养箱中，设置适当的温度、湿度和CO2浓度，提供细胞生长所需的营养物质。

9. 观察和维护：定期观察细胞的形态、增殖情况和细胞污染情况，并进行必要的维护工作，如培养基更换、细胞传代等。

10. 实验应用：根据具体实验目的，将培养好的大鼠原代细胞用
于各种细胞学、分子生物学和药理学实验中。

需要注意的是，大鼠原代细胞具有有限的传代次数，因此在实验中需要及时进行细胞传代，以保证细胞的正常生长和功能。

同时，严格遵守无菌操作规范，确保细胞培养的纯度和质量。

2．1小胶质细胞的原代细胞培养2．1．1混合胶质细胞培养自中山大学北校区动物中心购买刚出生1天内的SD乳鼠，用75％酒精消毒后固定四肢，剪开皮肤、颅骨，取出脑组织放入PBS液中洗涤一次，分离脑干取出，脑膜及血管尽量剥离，将组织放入盛有DMEM／F12无血清培养基的培养皿中，移至离心管中剪碎，加入浓度为0．125％的胰蛋白酶，37。

C水浴箱中消化15分钟，血清终止消化，待组织沉淀后收集上液，余下组织可通过反复吹打进行再次消化，经过709m细胞滤网过滤，收集滤液，1500r ／min离心5分钟，去上清，加入完全培养基悬浮细胞后进行细胞计数，以1*106接种至预先用多聚．L．赖氨酸铺被的75cm2培养瓶中。

24d'时后稍微轻摇下未贴壁及贴壁不稳的细胞碎片，全量更换培养基，随后4天／次换液，约至10天左右可见明显的细胞分层，上层为半贴壁，呈圆形，透光性较好，主要为小胶质细胞及少量的少突胶质细胞，下层细胞主要为星形胶质细胞、神经元。

第一章原代小胶质细胞的培养、纯化及鉴定2．1．2小胶质细胞分离及纯化：机械振摇法：将铺满胶质细胞／神经元的培养瓶置于摇床振摇，180r／min，15rain，将培养基吸出，并用PBS冲洗1遍，收集脱落的细胞，1500r／s 5min离心，去除上清液，加入完全培养基，吹打混匀，计数，(34+39+30+33)／4×104／ml，以3×105／孔的浓度将细胞种入6#L板(已放置盖玻片)，37。

C 5％C02温箱培养15．30分钟，更换培养基，即去除延迟贴壁的少突胶质细胞，贴壁细胞即为纯化的小胶质细胞。

分离后的底层混合细胞继续加入15％FBSDMEM／F12培养基，4．5天后可以再次收获小胶质细胞。

2．1．3免疫荧光鉴定步骤1)小胶质细胞接种第2—3天后，待细胞在盖玻片上伸出伪足时，自培养箱中取出。

2)用预温的PBS洗3次，每次5分钟3)4％多聚甲醛室温固定20分钟左右4)PBS洗3次，每次5分钟5) 5％BSA室温封闭30分钟6)加抗Iba抗体(用1％BSA稀释)放在湿盒里，4V过夜7)PBS洗3次，每次5分钟8)DIIFITC．山羊抗小鼠IgG(用1％BSA稀释)避光孵育1小时9)PBS洗3次，每次5分钟10)DIIDAPI(用1％BSA稀释)避光孵育5分钟11)1xPBS洗3次，每次5分钟12)95％甘油封片。

少突胶质细胞原代培养_
少突胶质细胞原代培养
少突胶质细胞来源于1-2 天的大鼠。

断头后大鼠大脑收集到Ham’s F-12培养液中，移除脑膜和血管。

皮质用机械匀浆进行匀浆然后将细胞悬液依次通过230μm和104μm尼龙网进行过滤。

细胞通过100 0rpm 7分钟离心进行收集，用添加12.5%胎牛血清的DMEM进行重悬细胞。

最后以2.0×105 cells/cm2浓度将细胞接种于培养皿中，将培养皿维持在37°C，5%CO2潮湿环境中。

3天后更换培养基，以后每两天更换一次。

9-11天后细胞能够铺满培养皿。

少突胶质细胞祖代生长在星形胶质细胞层的上面然后运用旋转摇床以260rpm 18小时摇荡分离，通过30μm的尼龙网过滤，然后细胞悬液接种到含无血清培养基的培养皿中。

培养基成分：DMEM-Ham‘s F-12混合物（1:1），10 mM HEPES，0.1%牛血清蛋白，25μg/mL 人铁转蛋白，30nM三碘甲状腺氨酸，20nM氢化可的松，20nM黄体酮，10nM 维生素H，5μg /mL胰岛素，16μg/mL腐胺，30nM硒，50U/mL 青霉素和50μg/mL 链霉素，还含有2.5ng/mL 血小板源性生长因子AA和2.5ng/ mL 碱性成纤维细胞生长因子用于刺激少突胶质细胞增殖。

培养基每两天更换一次。

如果在没有血小板源性生长因子AA和碱性成纤维细胞生长因子的存在情况下，原始的少突胶质细胞在无血清培养基中分化成少突细胞，3天后添加3%胎牛血清。

原始细胞和成熟的少突胶质细胞都能用于确定神经毒性。

小鼠原代肝细胞分离和培养原代肝细胞分离和培养试剂（1）无钙灌流液NaCl 8.3 gKCl 0.5 gHEPES 2.4 gEDTA 0.015 g青霉素105 U链霉素 0.1 g用适量超纯H2O溶解，1 mol·L-1NaOH或1 mol·L-1HCl调节pH至7.4，加超纯H2O定容至1 L。

（2）胶原酶溶液NaCl 8.0 gKCl 0.4 gCaCl20.56 gNa2HPO4·12H2O 0.134 gKH2PO4 0.06 gNaHCO30.35 g葡萄糖 1.00 gHEPES 5.96 g用适量超纯ddH2O溶解，1 mol·L-1NaOH或1 mol·L-1HCl调节pH至7.5-7.6，加超纯H2O定容至1 L每次酶灌流液用量25 mL，临用前加入IV型胶原酶12.5 mg。

（3）HBSS缓冲液NaCl 8.0 gKCl 0.4 gCaCl20.14 gMgSO4·7H2O 0.2 gNa2HPO4·12H2O 0.134 gKH2PO40.06 gNaHCO30.35 g葡萄糖 1.00 gHEPES 5.96 g用适量ddH2O溶解，1 mol·L-1NaOH或1 mol·L-1HCl调节pH至7.4，加超纯H2O定容至1 L。

以上溶液均过滤灭菌。

肝细胞的消化分散采用两步法：先用无钙灌流液作预灌流，目的在于冲去残积血，除去或减少肝细胞间的钙离子，以减小细胞间的粘着力。

然后再用含钙的胶原酶灌流液灌流，以消化细胞间质而分散肝细胞，具体步骤如下：①预灌流：健康SD大鼠（体重150～200 g），禁食8 h后，水合氯醛（10%）麻醉，四肢伸展腹部向上背部固定于操作台上，胸腹部酒精消毒。

小心打开腹腔，暴露分离肝门静脉，用留置针门静脉插管，动脉夹立即夹紧，剪断下腔静脉以37℃无钙灌流液以流速20 mL·min-1开放灌流，并迅速剪断下腔静脉以备灌流液顺畅流出。

原代小胶质细胞提取一、背景介绍小胶质细胞是中枢神经系统的重要成分，其主要功能是支持和调节神经元的活动。

在疾病的发生和发展过程中，小胶质细胞也扮演着重要的角色。

因此，对小胶质细胞的研究具有重要意义。

二、提取方法1. 原代培养法原代培养法是目前最常用的小胶质细胞提取方法之一。

具体步骤如下：（1）将新鲜脑组织切成小块并去除血管、脑膜等组织。

（2）将组织块置于含有消化酶（如0.25% 胰蛋白酶）和DNA 酶的消化液中，在37℃下消化4~5次。

（3）将消化后的混合物通过筛网过滤，得到单个小胶质细胞。

（4）将单个小胶质细胞接种到含有营养物质的培养基中进行培养。

2. 富集法富集法是另一种常用的小胶质细胞提取方法。

具体步骤如下：（1）将新鲜脑组织切成小块并去除血管、脑膜等组织。

（2）将组织块置于含有分离液（如70% 葡萄糖、0.9% NaCl 等）的离心管中，在低速离心下沉淀。

（3）将上清液转移至新的离心管中，在高速离心下沉淀小胶质细胞。

（4）将沉淀的小胶质细胞接种到含有营养物质的培养基中进行培养。

三、注意事项1. 提取过程要在无菌条件下进行，避免污染。

2. 提取前应先对动物进行麻醉和处死处理，避免动物痛苦。

3. 消化酶和DNA 酶的浓度应根据实验需要进行调整，以保证消化效果。

4. 培养基的配方应根据实验需要进行调整，以保证小胶质细胞正常生长和发育。

四、总结小胶质细胞是中枢神经系统的重要成分，对其研究具有重要意义。

原代培养法和富集法是目前最常用的小胶质细胞提取方法，提取过程要在无菌条件下进行，避免污染。

消化酶和DNA 酶的浓度应根据实验需要进行调整，以保证消化效果。

培养基的配方应根据实验需要进行调整，以保证小胶质细胞正常生长和发育。

小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案小鼠星形胶质细胞是中枢神经系统中的一类胶质细胞，具有重要的生理功能。

进行小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验是研究其功能和机制的关键步骤之一、下面是一份关于小鼠星形胶质细胞的原代培养及分离纯化实验方案。

实验步骤：1.小鼠主星形胶质细胞原代培养（1）准备培养基：将DMEM/F12培养基配制好，添加10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素（P/S）和20ng/mL生长因子（如EGF和bFGF），混匀即可。

将培养基过滤灭菌。

（2）小鼠灭菌和解剖：选取3-5天龄的小鼠，进行表面消毒处理，解剖小鼠颅脑组织。

（3）组织分离：将解剖得到的小鼠颅脑组织放入培养皿中，使用去髓针将组织剪碎，加入2mL预先配制好的DMEM/F12培养基。

（4）消化组织：使用0.25%胰酶溶液和0.05%胆汁酸溶液进行组织消化，将组织置于37°C的恒温槽中，用胶性吸管轻轻吹泡，约30分钟后停止消化。

（5）细胞分离：用离心机将细胞分离，将上清液收集到新的离心管中，用DMEM/F12培养基进行稀释后离心。

（6）细胞计数：用显微镜观察细胞形态，进行细胞计数。

（7）细胞培养：将细胞悬浮液转移到预先涂有胶原的培养皿中，加入预先配制好的培养基，放入培养箱中，37°C、5%CO2培养。

2.小鼠星形胶质细胞分离纯化（1）胶质细胞去除：在培养2-3周后，使用轻轻摇晃的方法将胶质细胞除去，以保留星形胶质细胞。

（2）非星形胶质细胞去除：使用超声波分离方法对星形胶质细胞进行提纯，将细胞悬浮液转移到离心管中，使用超声波技术使星形胶质细胞聚集起来，再次离心。

（3）细胞计数和分装：用显微镜观察细胞形态，进行细胞计数并分装到新的培养皿中。

（4）鉴定纯化程度：使用免疫细胞化学方法，如免疫荧光染色，检测特定星形胶质细胞标志物的表达水平，以确定纯化程度。

（5）细胞培养：将纯化后的星形胶质细胞继续培养，并进一步进行功能和机制的研究。

一种原代小胶质细胞培养与纯化方法的改良徐蛟天;边立功;张琰;王威;陈孝祥;陈鑫月;李庆;邓兴力【期刊名称】《中风与神经疾病杂志》【年(卷),期】2018(035)002【摘要】目的建立一种简易高效的新生大鼠小胶质细胞的原代培养和纯化方法,提高小胶质细胞的产量以及纯度.方法在传统Miriam Mecha的混合胶质细胞培养方法的基础上通过改良操作,混合培养小胶质细胞,并分别采用手拍法、摇床法以及温和胰酶消化法,纯化小胶质细胞,通过差速贴壁进一步纯化细胞.荧光显微镜下标记小胶质细胞的特异性标记物Iba1、CD11b/c进行鉴定.结果 (1)分离培养第1天小胶质细胞呈不规则圆形,折光不均匀,继续培养3~5d,小胶质细胞逐渐出现单极或多极突起,7d时部分细胞转为静止状态,呈分枝状;(2)纯化后小胶质细胞多呈静息状态,细胞免疫荧光CD11b/c、Iba1双阳性;(3)不同纯化方法细胞免疫荧光并计数显示:手拍法纯化小胶质细胞,细胞阳性率( >96%)明显高于胰酶消化法( >90%,P<0.05),前者细胞产量明显高于摇床法(P<0.05).结论通过改良传统Miriam Mecha的混合小胶质细胞的培养和纯化方法,可以提高小胶质细胞产量以及纯度.%Objective To establish a simple and efficient method of primary microglial cell culture and purification of neonatal rats,improve the production and purity of microglial cell.Methods Improved operation,mixed cultured micro-glial cell and purified microglial cell respectively,on the basis of traditional hybrid Miriam Mecha microglial cell cultural method,by mild digestion with trypsin,shaking table method and hand clapping.Meanwhile,we also used differential attach-ment method to further purify cells.Purified microgliacells were labeled with specific marker:Ibal,CD11b/c by fluores-cence microscope.Results (1)Isolated purified primary microglia cell appeared irregular rounds and refractive uneven in 1 day,then the cells gradually grown unipolar or multipolar process in 3~5 days,interestingly,some cells changed to sta-tionnary state and became cladodromous in 7days;(2)Purified microglia cells were labeled with specific marker:Ibal,CD11b/c by fluorescence microscope and most of them changed to stationnary state and became cladodromous;(3)The three methods of identifying cells were detected by immunofluorescence,the result shown:The hand clapping method had a higher positive rate( >95%) than trypsinization method and shaking table method( >90%,P<0.05) in different time points.Conclusion We improved the production and purity of primary microglia cells through this improved traditional Miriam Mecha method.It can get a greater number and purity of microglia cell,using hand clapping method combine with differential attachment method to purify mixed cultured cells.【总页数】4页(P115-118)【作者】徐蛟天;边立功;张琰;王威;陈孝祥;陈鑫月;李庆;邓兴力【作者单位】昆明医科大学第一附属医院神经外一科,云南昆明650032;昆明医科大学基础医学院人体解剖学与组织胚胎学系,云南昆明650500;昆明医科大学第一附属医院神经内科,云南昆明650032;昆明医科大学第一附属医院神经外一科,云南昆明650032;昆明医科大学第一附属医院神经外一科,云南昆明650032;昆明医科大学,云南昆明650500;昆明医科大学第一附属医院神经内科,云南昆明650032;昆明医科大学第一附属医院神经外一科,云南昆明650032【正文语种】中文【中图分类】R741【相关文献】1.原代小胶质细胞及神经元细胞培养不同纯化方法的比较 [J], 王宝萍;李东风;徐书雯2.三种原代小胶质细胞纯化培养方法的对比及分析 [J], 于腾波;程永帅;寇德伟;褚言琛;王爱民3.新生大鼠原代小胶质细胞分离培养方法的改良 [J], 钱凯;唐琳俊;王希;杨坤;张开鑫;钱腾达;马涛;石晶;李立新4.小鼠小胶质细胞原代培养的高产改良方法 [J], 尹赛格;张恒睿;陈滟;孙俊;5.小鼠小胶质细胞原代培养的高产改良方法 [J], YIN Sai-ge;ZHANG Heng-rui;CHEN Yan;SUN Jun因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。