星形胶质细胞,少突胶质细胞分离培养新方法研究

原代星形胶质细胞细胞培养方法
原代星形胶质细胞（primary astrocytes）是从胶质细胞含量较高的组织（如大脑皮层）中分离得到的。

其细胞培养方法如下：
1. 将新鲜脑组织剖出，用积聚素/液体软膜法（trypsin/liquid membrane method）进行酶解，使得细胞可以分离开来。

2. 使用无菌生理盐水或DMEM/F12将细胞悬液进行洗涤，然后放置在含有足够营养物质的培养基中，如DMEM。

3. 放置的培养皿需放置在37摄氏度、5% CO2和95%空气的恒温箱内，以提供最适宜的环境和养分。

4. 在培养初期，需要添加适当比例的血清（如胎牛血清），以提供必要的生长因子以及细胞所需的其它营养物质。

但在细胞数目增长到一定规模后，可将血清浓度逐步降低，以避免胎牛血清对实验结果的影响。

5. 定期更换培养基，以保证细胞在最佳的生长状态。

6. 如需进行实验或操作，需要将细胞从培养皿中移入滴定皿或其它相应容器中，并按照操作所需加入相应的药物或物质。

注意事项：
1. 在操作过程中需要尽可能避免对细胞的机械损伤，比如抽吸和强烈摇动。

2. 在移入滴定皿或其它操作容器时，需要注意细胞的密度，以避免过于稀疏或过于密集。

3. 在更换培养基、加药等操作时，需要十分温和，以避免对细胞造成伤害或死亡。

胶质细胞原代培养及纯化2.1原代胶质细胞培养1）于细胞培养前1d，用0.05% PLL(or PLO)包被培养瓶，置5% CO2培养箱中6 h以上，使用前用HBSS液冲洗3次，备用；2）1d内的新生C57小鼠4只，置入75%乙醇中消毒后断头处死，75%乙醇中漂洗一次，迅速转移至预冷的HBSS（可加入双抗）中，弯镊从鼻部固定住头部，迅速剪开皮肤，换剪刀，从正中线剪开颅骨，弯镊向两边剥去颅骨，去小脑，将脑组织置于含预冷的HBSS的60mm培养皿中；3）解剖显微镜下仔细剥离皮层表面脑膜和血管后置于含预冷的HBSS的60mm 小皿中，用HBSS洗3次，留少量刚好盖过组织，用眼科弯剪剪碎组织（越碎越好），加入0. 25%胰酶2mL，于37℃水浴中消化7 min，消化过程中摇晃离心管数次，使消化均匀；4）加入含有血清DMEM/F12完全培养基10mL(1:1)终止消化；5）使用玻璃滴管或1mL枪头吹打（可将其头部略剪一部分，以扩大口径），若一次取的动物只数多，由于液体过多，可使用5mL枪头进行吹打，但因其吹打力度较大，操作时要尽量轻且吹打次数不宜过多；6）吹打过程采用分步吹打法，每吹打15~20下，静置1~2min，吸取上清，以避免已消化出的单细胞被过多吹打，该过程重复3次；7）200目筛网过滤至50mL离心管中，去除残余的组织块；8）1000 r/min×5min，弃上清；9）调整细胞数为1～2×106/mL,接种到25cm2培养瓶中,每瓶5mL；10）接种24 h后换以新鲜完全培养基，以除去悬浮死亡的细胞及碎片；11）细胞每3 d更换培养液，培养10～12d左右细胞基本铺满瓶壁，进行纯化分离。

分离根据胶质细胞间贴附性不同进行，将培养瓶放入恒温振荡器中，37℃180rpm振荡5 h，上层疏松贴壁的为小胶质细胞；底层即是纯度较高的星形胶质细胞，收集小胶质细胞，离心重悬，接种于35mm圆皿中；星形胶质细胞用0.25%胰酶消化按1：2传代，待长满后用于实验。

星形胶质细胞的研究张敬军(泰山医学院附属医院神经内科,山东泰安 271000)收稿日期:2006-02-03,修回日期:2006-03-18基金项目:山东省自然科学基金资助项目(No Y2000C23);山东省高等学校省级中青年学术骨干基金资助项目作者简介:张敬军(1963-),男,博士,教授,研究方向:脑血管病、癫痫及帕金森病诊治,Te:l 0538-*******,E-m ai:l JJz hang@ts m c 中国图书分类号:R-05;R 322181;R 32912;R 329124;R 341;R 74文献标识码:A 文章编号:1001-1978(2006)07-0788-04摘要:近年来星形胶质细胞应用研究是神经科学研究的热点,该文综述了星形胶质细胞的形态、调节机制、功能、与疾病的联系等,星形胶质细胞在神经系统的生长及修复中起重要作用。

关键词:星形胶质细胞;胶质纤维酸性蛋白质;分化星形胶质细胞与神经元之间存在复杂的相互作用,以维持神经系统内环境的稳定。

近年随着膜片钳及分子生物学技术的应用,人们发现星形胶质细胞表面不仅具有电压依赖的Na +、K +及C a 2+通道,而且分布着许多神经递质、神经肽、激素及神经营养因子受体[1],并能合成及分泌多种神经活性物质,在维持神经元内外环境、生存、迁移、免疫调节、信号转导、轴突生长及功能整合等方面具有重要作用,与中枢神经系统(C NS)疾病密切相关,因此星形胶质细胞对神经元生存起重要作用[2~6]。

在病理条件下,星形胶质细胞从静息状态快速向活化状态转变,其活化具有瀑布效应,活化的星形胶质细胞对神经元起保护或毒性作用,从而发挥/双刃0效应。

进一步探讨星形胶质细胞的活化机制及功能,对认识脑的奥秘具有重要意义。

1 星形胶质细胞形态特点胶质细胞有突起,其突起不分树突和轴突,没有传导神经冲动功能。

星形胶质细胞(astrocy te ,AS)是胶质细胞中体积最大一种,与少突胶质细胞合称为大胶质细胞。

大鼠少突胶质细胞的纯化培养与鉴定【摘要】目的探讨新生2 d Sprague Dawley(SD)大鼠脑少突胶质细胞的分离方法和生长条件，为少突胶质细胞损伤后髓鞘形成障碍或脱髓鞘疾病的研究奠定基础。

方法根据星形胶质细胞和少突胶质细胞的生长时间差异、细胞生长方式及细胞对培养层粘附等特性的不同，采用两次恒温摇床振荡分离纯化法和条件限定培养基培养获取并鉴定高纯度的大鼠少突胶质细胞。

结果培养出突起有如蜘蛛网状的成熟少突胶质细胞，半乳糖脑苷脂（Galactocerebroside，Gal）阳性。

结论两次恒温摇床振荡分离纯化法和条件限定培养基培养可获取高纯度的大鼠少突胶质细胞。

【关键词】少突胶质细胞；细胞培养；纯化；鉴定Abstract: Objective To culture, purify and identify the astrocytes and oligodendrocytes from rat cerebral tissue. Methods Based on the different properties of developmental time courses，cellular adhesions and growth pattern of astroglial cells and oligodendrocytes，oligodendrocytes were cultured and purified by orbital shaking for twice and the defined culture medium and identified by immmunofluorescent staining. Results The ripe oligodendrocytes were cultured and identified by galactocerebroside. Conclusion The method we used was suitable and effective to obtain oligodendrocytes.Keywords: oligodendrocyte; cultivation; purification;identification少突胶质细胞是中枢神经系统的髓鞘形成细胞，它起源于胚胎神经管的神经上皮细胞，随着中枢神经系统的发育，逐步迁移到白质，并增殖、分化，形成髓鞘包裹轴突。

校内讲义组织工程实验（供药学院生物工程专业用）吉林大学药学院生物工程综合教研室二○○五实验须知1．按时进入实验室，穿好白大衣，带好实验纪录本和笔；2．实验前应认真做好预习，明确本次实验的目的，了解实验内容，熟悉实验步骤；3．实验前认真听任课教师的讲解和实验安排，未经允许勿动任何实验器具；4．实验中不要大声喧哗，如有问题，及时请教任课教师，做到有条不紊；5．认真按照实验操作规程进行实验，及时准确地做好实验记录；6．实验记录要采用专用实验记录用纸，不得用单页纸进行记录；7．实验记录要使用钢笔或碳素笔，不得使用铅笔、圆珠笔进行记录；8．不得涂沫、删改原始实验数据，养成实事求是和严谨的科研作风；9．对实验中涉及到的精密仪器，要严格按照使用规程进行操作，出现故障或有不明之处，要及时请教任课老师，不得擅自拆卸维修；10．实验废弃物要按相关要求进行统一收集处理，不得随意倾倒；11．实验结束后，要认真清洗实验器具，并按要求摆放，清洁实验台面；12．值日生认真清扫地面，清理实验垃圾；13．离开实验室前，要认真检查水、电、煤气是否关闭好，养成良好习惯；14．实验后要及时写出实验报告，按时交给任课教师评阅。

前 言本《组织工程实验》讲义是根据药学院生物工程专业（医学）教学需要，遵照教学大纲要求而编写的。

本实验讲义编写的指导思想是：1．根据《组织工程》理论课程内容，确定实验课内容；2．结合学院现有实验设备和实验条件，确定实验内容；3．与其它相关实验课内容统筹考虑，确定实验内容；4．根据本专业学生的实际情况，培养学生的独立实验能力；5．充分考虑到本专业的学科发展和技术前沿；6．参考兄弟院校相关专业的实验课程开设情况。

通过本实验课的教学实践，使学生加深理解理论课学习的内容，掌握组织工程基本的实验技术和操作规程，达到独立开展组织工程实验的能力。

本《组织工程实验》讲义是由生物工程综合教研室和生物工程实验中心全体教师共同努力完成的。

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小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案小鼠星形胶质细胞（astrocytes）是中枢神经系统中一种重要的胶质细胞，主要起支持和维护神经元生存、供能以及调节神经元活动等功能。

原代培养和分离纯化小鼠星形胶质细胞是研究其生物学特性和相关疾病发生机制的重要实验方法。

以下是一种常用的小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案。

实验材料和仪器：1.小鼠（新生仔小鼠）2.离心管、培养皿、显微镜3.无菌生理盐水、套管、吸头4. DMEM/F12培养基、FBS、胰蛋白酶、DNase I5.离心机、试管摇床、显微镜、离心管架6.显微针、细胞计数板、加热振荡器实验步骤：1.小鼠的准备：a.使用新生仔小鼠，从母鼠的子宫中取出。

b.将小鼠头部朝下放在无菌生理盐水中，用套管轻轻吸出小鼠颅内的脑组织。

c.将脑组织转移到含有DMEM/F12培养基的离心管中，并用离心管摇床低速振荡15-20分钟使细胞均匀分散。

2.细胞分离：a.将离心管架放在显微镜下，用显微针将脑组织均匀挫碎。

b.将脑组织转移到含有DMEM/F12培养基的培养皿中。

c. 添加0.25%胰蛋白酶和10 U/ml DNase I，37°C孵育30分钟。

d.轻轻吸入含有酶切的脑组织，并用吸头轻轻洗涤脑组织，收集上清液。

e.将上清液通过0.22μm的滤网过滤，除去大颗粒的细胞。

3.细胞培养：a. 将滤过后的细胞悬液计数，计算细胞密度并将其稀释至10^6细胞/ml。

b.取DMEM/F12培养基，添加10%FBS，将稀释后的细胞悬液转移到培养皿中。

c.在培养皿中加入5%CO2，37°C孵育。

d.每两天更换一次培养基，直到细胞至80%～90%的密度。

4.纯化小鼠星形胶质细胞：a.将培养皿中的细胞收集到离心管中，进行离心。

b.用无菌生理盐水洗涤细胞，去除不附着的细胞和残留的培养基。

c.将洗涤后的细胞用DMEM/F12培养基重新悬浮，计数并计算细胞密度。

d.用磁层细胞分选仪，通过细胞表面标记的抗体对细胞进行阳性选择，分离纯化小鼠星形胶质细胞。

星形胶质细胞的培养方法与鉴定（Culture and Indentification of Astrocytes）胶质细胞是神经系统内数量众多的一大类细胞群体,约占中枢神经系统(CNS)细胞总数的90%,星形胶质细胞(astrocytes, AS)是其中主要的组成成分。

自1846年Rudolt Virchow发现神经胶质细胞以来,传统研究一直认为星形胶质细胞只对神经元起营养支持作用,而对神经信号的传递和处理不起作用, 在过去的几年中,上述观念已经发生了巨大的转变。

AS在中枢神经系统的发育及病理生理过程中起重要作用，如神经系统发育、突触传递、神经系统内环境的稳定及新陈代谢等中枢神经系统的多种正常生理活动,以及神经疾病的病理机制。

此外，它还具有摄取、灭活和供给神经递质,抗氧化、营养修复以及抑制神经元过度兴奋和帮助学习记忆等多种功能。

目前对星形胶质细胞功能的认识主要是通过对离体培养星形胶质细胞的观察获得的,然而既往文献报道的培养星形胶质细胞与在体脑内的星形胶质细胞相比较存在显著差异,例如培养的星形胶质细胞形态上通常为扁平多角,核周体丰富,仅有少量枝状突起,而在体的星形胶质细胞则一般表现为胞体较小,突起多而细长;培养条件下星形胶质细胞常过度增殖分裂直至细胞铺满支持物,且随细胞培养时间的延长细胞间的异质性逐渐消失,而成年脑内星形胶质细胞的数量稳定,不同部位星形胶质细胞具有显著的异质性。

由于在体内星形胶质细胞与其它神经细胞混杂存在,因此需要对星形胶质细胞进行纯化,才能深入了解其形态结构和生物学功能。

在限定细胞种植密度（低密度接种）,限制培养基成分及其更换次数的培养条件下,星形胶质细胞表现出阶段性的体外发育过程。

本文参照国内外培养分离胶质细胞的方法,根据多年的实验研究,改进了大鼠大脑皮质星形胶质细胞的体外培养方法,为后续实验对星形胶质细胞的生物学作用研究提供了的基本的实验模型。

1 材料与方法1. 1 实验动物 新生1～3 d 的SD 乳鼠1～2 只(昆明医学院动物所提供) ,雌雄不限。

体外原代星形胶质细胞分离培养方法的优化黄太萍;黄巨恩;沈丽【摘要】目的:通过对国内外原代培养星形胶质细胞的不同方法的比较运用,旨在优化现有的星形胶质细胞(AS)分离培养方法,建立稳定,高产的培养模式,为进一步研究奠定基础.方法:结合自有实验室条件采用优化的胰蛋白酶消化组织块分离培养法获取AS,进行形态学观察,绘制生长曲线,对培养的细胞进行GFAP免疫荧光鉴定.结果:体外培养的原代AS 7～10 d基本融合,胞体不规则,突起丰富如网状,生长曲线符合正常细胞生长特性;免疫荧光染色显示细胞纯度可达95％以上.结论:优化的胰蛋白酶消化组织块分离培养法对AS的培养更适宜自有实验室条件,可获得稳定纯度较高的AS,为中枢神经系统疾病相关研究提供了新的基础.【期刊名称】《广西医科大学学报》【年(卷),期】2014(031)006【总页数】4页(P894-897)【关键词】星形胶质细胞;体外培养;鉴定;大鼠【作者】黄太萍;黄巨恩;沈丽【作者单位】广西医科大学护理学院南宁 530021;广西医科大学护理学院南宁530021;广西医科大学护理学院南宁 530021【正文语种】中文【中图分类】R-33神经胶质细胞是构成神经组织的两大类细胞之一,其生物学作用越来越受到重视，而星形胶质细胞(astrocyte，AS) 是其中的主要部分，在神经系统发育、突触传递、神经系统内环境的稳定和新陈代谢等中枢神经系统的多种正常生理活动, 以及神经疾病的病理机制中都起着十分重要的作用[1]。

目前体外培养AS常用的方法有非酶分离细胞法，酶消化分离法，限制性细胞培养法。

其中运用最多的为酶消化分离法。

本文通过对比和摸索，针对本实验室的自身条件采用了胰蛋白酶消化组织块分离培养法对体外培养大鼠AS进行优化，取得良好效果。

1 材料和方法1.1 实验动物和试剂：新生24 h内的SD大鼠，由广西医科大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(桂)2012-0002；DMEM-HG、胎牛血清由维森特公司提供、胰蛋白酶由美国Gibco公司提供；Anti-GFAP antibody为abcam公司产品；anti-rabbit-488为中杉金桥公司产品。

小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案经过相关文献阅读，参考了众多对于小胶质细胞培养方案，对比了不同方案的利弊优缺，整合了相对符合本实验室条件和实验要求的方法，如有其他变更方案，以修改后为准。

1. 实验材料与试剂剪刀、小镊子、小毛刷、DMEM/F1培养液、胎牛血清、马血清、0.25%, 0.05%胰蛋白酶、PBS®、青霉素、链霉素、培养皿离心管、50 mL细胞培养瓶、CO恒温细胞培养箱、倒置相差显微镜、细胞板、荧光标记二抗、0.4% Trypan Blue 染色液、抗小鼠0X4单克隆抗体和新生SD」、鼠等试剂配比：(1) DMEM 10:10:1DMEM, 10%FBS, 10%Horse Serum, 1% Penicillin/Streptomycin (P/S)(2) DMEM 5:5:1DMEM, 5% FBS, 5% of Horse Serum, 1% P/S(3) SERUM FREE MEDIUM + GROWTH FACTORS ( DMEM/F12 无血清培养基+生长因子)25卩g/m转铁蛋白，10nM生物素，30 nM亚硒酸钠，1卩g/ml putrescine (腐胺)，5 卩g/m胰岛素，20 nM hydrocortisone (氢化可的松)，20 nM progesterone (孕激素)，1 %P / S+生长因子(5ng/ ml的血小板衍生生长因子PDGF-AA和5ng / ml碱性成纤维细胞生长因子bFGF )胰蛋白酶/ EDTA溶液0.05 %胰蛋白酶+0.02 % EDTA在W / O 内Ca2+ / Mg2 + 的HBSSDMEM/F12 con ta ining 25 卩g/ml tran sferri n, 10 nM biot in, 30 nM sodium selenite, 1 卩g/ml putrescine, 5 卩g/ml insulin, 20 nM hydrocortisone, 20 nMprogesterone, 1% P/S + Growth Factors (5 ng/ml PDGF-AA and 5 ng/ml bFGF) Trypsin/EDTA solution 0.05% Trypsin + 0,02% EDTA in HBSS w/o Ca2+/Mg2+37oCmicrodissecting instruments: large dissecting scissors, mouse-teeth forceps, curved forceps and fine Dumont forcepsTabletop centrifugeT75 cm2 tissue culture flasks with plug-seal （BD Falcon, 137787）culture plates （Falcon）（Saatilene, Hitech）2. 实验步骤2.1 星形胶质细胞的混合培养取新生SD」、鼠若干只（出生24h内），在无菌条件下断头,迅速剪开颅骨,取出脑组织至盛有冷PBS 液的培养皿中反复冲洗以去除血污; 再把全脑移入另一盛有PBS 液的培养皿中，用小毛笔轻轻刷去脑表面的脑膜和血管,用PBSR冲洗后剪去脑干仅留大脑半球; 用、剪刀充分剪碎脑组织, 加入比组织块总量多30~50倍的0.05%胰酶, 再移入50 mL 离心管, 用吸管反复吹打消化至肉眼观察无明显的脑组织团块；加入DMEM/F12完全培养基（含10%S台牛血清、100U/mL青霉素和100 ug/mL 链霉素）终止消化, 再次反复吹打制成单细胞悬液, 配平, 1000 r/ min, 离心5min,弃上清；加定量完全培养液再次制成细胞悬液，更具实验需要接种入若干个50 mL细胞培养瓶或者培养皿中，置于5%COS温细胞培养箱（37度）培养； 3 h 后更换1 次培养液, 以后每3 d 换1 次液, 并在镜下观察细胞的生长和存活情况。