微生物工程资料

第一章、工程概论 1、什么是微生物工程？ ，应用生物科学，特别是微生物学的理论和方法，结合现代工程技术手段，利用微生物的某种特定性状和功能，按照人们设计的蓝图，改良、加工、繁殖微生物，以获取微生物体本身或其代谢产物等有用物质，为人类生产、生活为目的的一门新兴学科。它的最终目的是由微生物的生命活动来实现工业生产。 2、微生物工程主要应用在哪些领域？试举例说明。 1.微生物工程在食品工业中的应用。其中包括传统的含醇饮料、调味品、乳制品等， 2.微生物工程在医药卫生中的应用。抗生素 3.微生物工程在轻工业中的应用。蛋白酶、果胶酶、脂肪酶 4.微生物工程在化工能源产品中的应用。有机酸、清洁能源 5.微生物工程在农业中的应用。生物农药、生物除草剂 6.微生物工程在环境保护中的应用。如沼气发酵、好气发酵法 7.微生物工程在细菌冶金中的应用。利用化能自养细菌如铁细菌、硫化细菌等把亚铁氧化为高铁，将合硫金属矿石中的金属离子形成硫酸盐而释放出来。 8.微生物工程在高技术研究中的应用。如基因工程中用的限制性内切酶、连结酶、DNA探针等； 3、什么是半合成抗生素？试举例说明。 半合成抗生素：某些天然抗生素在去侧链后，可用化学合成法接上新的侧链而改变原有抗菌谱或其它特性，这样的抗生素就被称为半合成抗生素。 常用的半合成青霉素：甲氧苯青霉素(新青Ⅰ )、乙氧萘青霉素(新青Ⅱ )、苯唑青霉素(新青Ⅲ)、氨苄青霉素、羟氨苄青霉索等。 4、深层培养技术 又称沉没培养法。有时也称液体培养法。在深沉的液体培养中进行的一种发酵培养方法。操作时将无菌空气通入容器中，不断搅拌，使微生物充分与氧气接触而迅速繁殖。占地面积小、劳动力省，产量高，适用于机械化和自动化生产。 第二章、菌种来源 1、微生物工程的工业生产具有哪三要素？ 生产菌种的性能、发酵及提纯工艺条件、生产设备。其中优良的菌种是最重要的。 2、一般菌种分离纯化和筛选的步骤是什么？ 标本采集、标本材料的预处理、富集培养、菌种初筛、菌种复筛、性能鉴定、菌种保藏。 3、常用的标本预处理的方法有哪些？举例说明。 (1)采用热处理方法减少材料中的细菌数 (2)采用膜过滤和离心的方法浓缩水中的细胞 (3)采用化学方法 (4)诱饵法：将固体基质（如蛇皮、花粉）等加到待检的土壤或水中，待其菌落长出后再铺平板分离。 (5)空气搅拌法：在空气中搅拌，收集孢子沉淀，如稻草的处理。 4、菌种分离的方法有哪些？ 施加选择性压力分离法 随机分离法 5、什么是施加选择性压力分离法 、分批式富集培养和恒化式富集培养？ 施加选择性压力分离法：利用不同种类的微生物对环境和营养要求的不同，人为控制这些条件，使之利于某类或某种微生物的生长，而不利于其他种类微生物的生存，以达到使目的菌种占优势，而得以快速分离纯化的目的。 摇瓶培养（分批式富集培养）：是指将富集培养物转接到新的同一种培养基中，重新建立选择性压力，如此反复转种几次后，再取此富集培养物接种到固体培养基上，以获得单菌落。 连续培养（恒化式富集培养）：通过改变限制性基质的浓度来控制两类不同菌株的比生长速 率。 6、.设计试验方案，筛选出你所需要的目的菌株？ 第三章、代谢调节 1、微生物的代谢类型、调节方式、调节部位 类型：分解代谢和合成代谢 方式：细胞透性的调节、代谢途径区域化 、代谢流向的调控、代谢速度的调控 调节部位：细胞质：糖酵解、磷酸戊糖途径、糖原合成、脂肪酸合成； 线粒体：丙酮酸氧化、三羧酸循环、B-氧化、呼吸链电子传递、氧化磷酸化； 细胞核：核酸合成； 内质网：蛋白质合成、磷脂合成。 2、酶活调节和酶量调节的区别 酶活性调节:是对现有的酶在活性变化上进行调节，它不会涉及酶量的变化， 酶量的调节:不涉及现有酶活性的变化，只是通过影响酶合成或酶合成速率以控制酶量变化，达到控制代谢过程的目的。 从调节作用的特点上看:酶活性调节的效果既及时又迅速，但由于酶量调节涉及到酶蛋白合成，它调节的效果相应地来得慢。 3、酶合成调节的诱导和阻遏、诱导剂、阻遏物 诱导：是指在某种化合物作用下，导致某种酶合成或合成速率提高的现象。 阻遏：是在某种物质作用下导致某种酶合成停止或合成速率降低的现象。 诱导剂：能够诱导某种酶合成的化合物称为该酶的诱导剂。 阻遏物:阻遏酶合成的物质称为阻遏物 4、在工业发酵上如何应用代谢调节理论，试举例 工业发酵的目的：大量积累人们所需要的微生物代谢产物。 代谢的人工控制：人为地打破微生物的代谢控制体系，使代谢朝着人们希望的方向进行。 人工控制代谢的手段：控制发酵条件（生物化学方法）； 改变微生物遗传特性(遗传学方法）； 改变细胞膜透性； 5、前体与诱导物的区别 有时难于区分促进作用是诱导物的作用还是前体的作用。一般，可把那些能在生长期内、生产期前促进产物合成的化合物看做诱导物，而前体往往只在生产期内起作用。 另外，诱导物可以被非前体的结构类似物取代。 7、次级代谢的调节主要有哪些方式 （1）初级代谢对次级代谢的调节； （2）碳代谢物的调节作用； （3）氮代谢物的调节作用； （4）磷酸盐的调节作用； （5）次级代谢中的诱导作用及产物的反馈作用； （6）次级代谢中细胞膜透性调节 8、代谢工程及三种方式 代谢工程是指利用基因工程技术，定向地对细胞代谢途径进行修饰、改造，以改变微生物的代谢特性，并与微生物基因调控、代谢调控及生化工程相结合，构建新的代谢途径，生产新的代谢产物的工程技术领域。

方式：改变代谢途径 、扩展代谢途径 、构建新的代谢途径 第四章、菌种的选育 菌种选育方法：自然选育、人工选育（诱变、杂交、原生质体融合、基因工程） 自然突变的原因：多因素低剂量的诱变效应、互变异构效应 自然选育的优点：简单易行，并可以达到纯化菌种、防止菌种衰退、稳定生产、提高产量的目的。缺点：效率低、进展慢。 突变包括染色体畸变、点突变 诱变育种的基本过程：选择合适的出发菌株→制备待处理的菌悬液→诱变处理→筛选→保藏和扩大试验。 出发菌株应具备：对诱变剂的敏感性高；具有特定生产性状的能力或潜力。 出发菌株的来源：自然界直接分离到的野生型菌株；历经生产考验的菌株；已经历多次育种处理的菌株。 制备细胞悬液要求：菌体处于对数生长期，并使细胞处于同步生长；细胞分散且为单细胞，以避免表型迟延现象（phenotypic lag）； 表型延迟现象：指某一突变体在DNA复制和细胞分裂后，才在表型上显示出来，造成不纯的菌落。原因：分离性延迟现象，生理性延迟现象 诱变剂的作用：提高突变的频率；扩大产量变异的幅度；使产量变异朝着正突变或负突变移动。 杂交育种指将两个基因型不同的菌株经吻合或接合，使遗传物质重新组合，从中分离和筛选具有新性状的菌株。 1.细菌杂交：细菌的杂交可以通过细菌接合、F因子转导、R因子转移、转化和转导等发生基因重组。普遍性转导，双交换形成转导子。 2.放线菌的杂交育种： 放线菌的杂交原理：包括四种遗传体系： a.异核现象 b.接合现象c.异核系的形成d.重组体的形成 放线菌的杂交方法：混合培养法（选择性平板法、异核系分析法）、平板杂交法、玻璃纸转移法。 玻璃纸转移法具体步骤为：（1）玻璃纸混合培养；（2）混合培养物的转移；（3）异核系的分离。 3.霉菌的杂交育种： 准性生殖：是指真菌中不通过有性生殖的基因重组过程。 准性生殖过程：异核体的形成，二倍体的形成，体细胞重组。 霉菌的杂交技术：选择直接亲本：具有遗传标记。异核体的形成：混菌培养。双倍体的检出：斑点和扇面。分离子的检出：纯化、鉴别。 原生质体融合的优越性：有利于不同种属微生物的杂交。重组频率高于其他杂交方法。遗传物质传递更加充分、完善，既有核配，又有质配。可以用温度、药物、紫外线等处理、纯化亲株的一方或双方，然后使之融合再在再生菌落中筛选重组子，提高筛选效率。用微生物的原生质体进行诱变，可明显提高诱变频率。 原生质体融合步骤：原生质体制备（主要是酶法，如溶菌酶、纤维素酶等）、原生质体再生、原生质体融合、融合子的检出（直接法、间接法） DNA重组技术的基本过程 含目的基因的DNA片断的准备、载体、含目的基因的DNA片断与载体相连接、将重组分子送入受体细胞，并于其中复制、扩增、筛选出带有重组DNA分子的转化细胞 获得目的基因的方法：鸟枪法、cDNA法、人工合成 质粒不稳定可分为分裂不稳定和结构不稳定两种情况。 质粒的分裂不稳定：是指基因工程菌分裂时，出现一定比例不含质粒的子代菌。 质粒的结构不稳定：是指外源基因从质粒上丢失、碱基重排或缺失，引起基因工程菌性能的改变。 质粒不稳定产生的原因：一是含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；二是这两种菌的比生长速率(μ)差异的大小。 提高质粒稳定性的方法：两阶段培养法；控制适当的培养条件。 第五章：菌种保藏 菌种衰退：菌种经过长期人工培养或保藏，由于自发突变的作用而引起某些优良特性变弱或消失的现象。 菌种衰退的原因是有关基因的负突变。在形态上：分生孢子减少或颜色改变。在生理上：常指产量的下降. 防止菌种衰退的方法有：控制传代次数；选择合适的培养条件；利用不同类型的细胞进行传代；选择合适的保藏方法。 菌种保藏的原理和方法：菌种保藏主要是根据微生物的生理、生化特性，在人工创造的条件下使其代谢处于不活泼的休眠状态，生长繁殖受到抑制。这样就能尽可能地减低菌种的变异率。主要是通过降低培养基营养成分（寡营养）、低温、干燥和缺氧四个手段。斜面低温保藏法（低温。弊端：短期内多次传代；容易引起菌种发生变异，杂菌污染的机会随之增多）砂土管保藏法：（干燥，寡营养）真空冷冻干燥保藏法(干燥，低温）液氮保藏法 (低温)悬液保藏法（寡营养保藏）低温保藏法、石蜡油封存法（低温、缺氧）自然基质保藏法、基因工程菌的保藏 菌种的复壮是指创造一个适合原菌株生长繁殖的条件，经分离纯化，淘汰退化型个体或挑出原种型个体的选育菌种的方法。 菌种的复壮措施：纯种分离：（平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑取法等）； 通过寄主体内生长进行复壮；淘汰已衰退的个体。 第六章、培养基 1、孢子培养基、种子培养基和发酵培养基及 基本配制要求 孢子培养基：是供菌种繁殖孢子的一种常用固体培养基，对这种培养基的要求是：能使菌体迅速生长，产生较多优质的孢子，并要求这种培养基不易引起菌种发生变异。所以对孢子培养基的基本配制要求是： （1）营养不要太丰富(特别是有机氮源)，否则不易产孢子。 （2）所用无机盐的浓度要适量，不然也会影响孢子量和孢子颜色。 （3）要注意孢子培养基的pH和湿度。 种子培养基：是供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌体长得粗壮，成为