第一部分微生物工程原理
第一、二章微生物工程概论、生产菌种的来源
SOS生色检测法：利用DNA损伤时，可活化yecA蛋白，进而分解噬菌体的阻遏蛋白，再引起sifA(sulA)基因启动子启动LacZ基因的表达，从而达到检测能损伤DNA的抗肿瘤药物的目的。
生化诱导分析法(BIA)：采用测定溶原性λ噬菌体阻遏物支配下的启动子控制的转录和表达的酶活性的方法。
1、微生物工程的应用领域有？
（1）在食品工业的应用
微生物技术最早开发应用的领域，至今产量和产值仍占微生物工程的首位。食品加工、含醇饮料、发酵乳制品、调味品等
（2）在医药卫生中的应用
抗生素、氨基酸、维生素、生物制品、酶抑制剂
（3）在轻工业中的应用
糖酶、蛋白酶、果胶酶、脂肪酶、凝乳酶、氨基酰化酶、甘露聚糖酶等
（4）在化工能源中的应用
醇及溶剂、有机酸、多糖、清洁能源等
（5）在农业中的应用
生物农药、生物除草剂、生物增产剂等
（6）在环境保护中的作用
污水处理（厌气法、好气法）
（7）在高技术领域中的应用
基因工程的各种工具酶等
2、抗肿瘤药物产生菌的分离原理
临床上有效的抗肿瘤药物大多是直接作用于核酸或抑制核酸生物合成的物质，大部分具有抗菌或抗真菌的活性，现发展出利用微生物筛选作用于DNA 的抗肿瘤药物的方法，如生化诱导分析法、SOS生色检测法
生化诱导分析法（BIA）：采用测定溶原性λ噬菌体阻遏物支配下的启动子控制的转录和表达的酶活性的方法。将E.coli lacZ 连接在λ噬菌体的PL启动子下，当DNA损伤时，诱发λ阻遏蛋白CI分解，PL启动子启动lacZ 基因转录，表达出β-半乳糖苷酶。测定β-半乳糖苷酶活性，可检测能损伤DNA的抗肿瘤药物的存在X-Gal。作显色底物；反应后呈蓝色
SOS生色检测法：利用DNA损伤时，可活化yecA蛋白，进而分解噬菌体的阻遏蛋白，再引起sifA(sulA)基因启动子启动LacZ基因的表达，从而达到检测能损伤DNA的抗肿瘤药物的目的
3、利用DNA修复能力突变株进行抗肿瘤药物的筛选原理
生物--两个以上的DNA修复基因，一个DNA修复基因损伤或变异，仍能存活，但对能引起DNA损伤的化合物十分敏感，易发生死亡
4、抗病毒药物产生菌的筛选分离方法
（1）作用于核酸的方法--药物毒性高；
（2）小平板测定由病毒引起的细胞变性效果(CPE)；
（3）病毒复制中特有的DNA复制酶和核酸合成酶的酶抑制剂
第三章优良菌种的选育
结构不稳定：由于重组质粒DNA发生缺失、插入或重排引起的质粒结构变化。分裂不稳定：由于细胞分裂过程中质粒缺失分配到子细胞中而导致整个质粒丢失准性生殖：指真菌不通过有性生殖的基因重组过程。准性生殖过程包括异核体的形成、二倍体的形成和体细胞的重组.
互变异构效应：指四种碱基第六位上的酮基或氨基的瞬间变构，会引起碱基错配。多因素低剂量的诱变效应：指在自然环境中存在低剂量的宇宙射线、各种短波辐射、低剂量的诱变物质和微生物自身代产生的诱变物质等的作用引起的突变。自然选育：不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程
1、提高质粒稳定性的方法？
两阶段培养法：一增加菌体、二诱导外源基因表达
适当培养条件：温度、pH、培养基组分和溶解氧等
2、质粒不稳定的产生原因？
质粒不稳定---分裂不稳定的两因素：
①含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；②这两种菌的比生长速率差异的大小低拷贝---产生不含质粒子代菌频率高；高拷贝---比生长速率低
拷贝数与工程菌本身特性、培养条件有关
3、影响外源基因在酵母中表达的因素？
因素：外源基因的拷贝数、表达效率、外源蛋白糖基化、宿主菌株的影响（1）外源基因的拷贝数：应协调---稳定性、拷贝数、细胞生长量、表达效率（2）外源基因的表达效率：与启动子、分泌信号和终止序列有关
①启动子：
上游激活序列+近端启动子（TATA序列、起始密码子），分为组成型、诱导型
②启动子（可改变表达效率）
③分泌信号：信号肽、前导肽部分编码序列，分泌过程--加工切割--正确产物
④终止序列：保证适当终止．加Poly(A)尾巴---mRNA比较稳定
（3）外源蛋白的糖基化
糖基化---N-糖苷键、O-糖苷键
氨基末端修饰---二硫键形成---蛋白质折叠---糖基化---分泌
（4）宿主菌株的影响
菌特点：生长能力强、源蛋白酶弱、菌株性能稳定、分泌能力强等
4、酵母菌的载体系统？
酵母载体多为穿梭载体---同时有细菌和酵母的复制原点和选择标记---能在细菌和酵母中--复制和表型选择
(1) 克隆载体的复制序列---四类
①酵母附加体质粒(YEp类)
复制序列---酵母源2um质粒成分，拷贝数约为5-50
②酵母复制型质粒(YRp类)
复制序列---非2um来源的自主复制序列(ARS)，来自酵母染色体或其他生物；稳定性差，拷贝数少
③酵母着丝粒质粒(YCp类)
复制序列---ARS，有酵母染色体中心粒成分，以一种类似染色体的单位参与细胞的有丝分裂和减数分裂，稳定性好，拷贝数一个
④酵母整合型质粒(YIp类)
载体有与酵母染色体重组的序列---整合到染色体中，具有很好的稳定性，拷贝数—个
(2) 表达载体
在克隆载体中插入酵母的表达盒和终止子等调控序列，即可构建成酵母的表达载体。表达盒包括酵母菌强启动子多克隆位点的3’端非编码区。
5、在大肠杆菌中真核基因的表达形式
三种表达方式：即融合蛋白、非融合蛋白、分泌型表达蛋白
（1）融合蛋白：指蛋白质的N端是一段原核DNA序列，C端接上真核基因序列。优点：基因操作简便、表达蛋白较稳定、可高效表达；缺点：因有原核序列---免疫原性---只能作为抗原用；切除---原核多肽---具有生物活性的真核蛋白
（2）非融合蛋白：在大肠杆菌中以真核蛋白mRNA的ATG密码子为起始表达的蛋白质，保持蛋白质原有的生物活性，但易被蛋白酶降解。N末端有甲硫氨酸，能引起人体免疫反应。
（3）分泌表达：通过将外源基因连接到编码原核蛋白信号肽的下游来实现。常用信号肽：碱性磷酸酶(phoA) 、膜外周质蛋白(OmPA) 、霍乱弧菌毒素B亚单位(CTXB)等及大白鼠胰岛素原信号肽。
6、真核表达系统包括
①酵母：是研究基因表达调控最有效的单细胞真核微生物；基因组小，仅为大肠杆菌的4倍；世代周期短；有单倍体、双倍体两种形式；生长繁殖迅速，容易培育，不产生有毒物质，基因工程操作方便，与原核生物相似；表达产物能够糖基化；
②丝状真菌：特点是有很强的蛋白质分泌能力，能正确进行翻译后加工---剪切和糖基化等
