大鼠胚胎卵巢冻存前后异体异位移植的实验研究汇总

・ 论著・ 大鼠胚胎卵巢冻存前后异体异位移植的实验研究

任 冉 , 孟英奇 , 李玉岩

(大连市妇产科医院 , 大连 116033

【摘要】 目的 :研究胚胎卵巢冷 2解冻移植后的生存 、 生长及功能恢复情况 。 方法 :将

冻存大鼠胚胎卵巢植入去势成年雌鼠皮下 , 观察阴道脱落细胞变化 。以新鲜胚胎卵巢移

植作为对照 。 术后 3个月 , 取移植卵巢及自身子宫进行组织学研究 , 并测定血清雌二醇

(E 2 水平 。 结果 :移植卵巢内可见不同阶段的发育卵泡 , 并可见间质腺和黄体 。阴道上皮

细胞及子宫内膜有雌激素效应 。 血清学研究显示 , 移植卵巢具有与正常卵巢接近的内分

泌功能 。 结论 :冻融胚胎卵巢移植后能在异体异位存活 、 生长发育并具有内分泌功能 。

【关键词】 卵巢功能试验 ; 冷冻 ; 移植 , 异体 ; 大鼠

中图分类号 :Q954.592 文献标识码 :A 文章编号 :1004-7379(2002 06-0415-03

The study of heterotopic allotransplantation of cryopreserved fetal ovary in rats. Ren

Ran ,

Meng Yingqi , Li Yuyan. Dalian City Obstetrical and Gynecological Hospital ,

Dalian 116033

【 Abstract 】 Objective :T o study the survival ,growth and function restoration of

allotransplanted

cry opreserved fetal ovary. Methods :Cry opreserved rat fetal ovaries were grafted to

castrated adult fe 2

male rats. The vaginal epithelium was observed after transplantation 3m onths. The

grafts and uterus

were rem oved and underwent histological examination and serum estradiol (E 2

level were deter 2

mined. R esults :There were follicles in different developing stages ,corpus luteum

and interstitial

glands in the graft. The effects of estrogen on the vaginal epithelium and

endometrium were ob 2

served. Serum E 2showed that transplanted fetal ovary restored secreting function.

Conclusions :Cry 2

opreserved fetal ovary can be survival after heterotransplantation develop and

restore the function of

secreting steroid horm ore.

【 K ey w ords 】 Ovarian function

tests ;Freezing ;Transplantation ,alotransplantation ;Rats

性激素参与人体多种生理及生命活动 , 其水平 下降可引起机体生理功能衰退。 随着人类寿命的延 长及性激素对机体健康作用的不断揭示 , 人们越来越 重视病理性卵巢切除、 卵巢早衰和更年期综合征及其 带来的后果。 目前临床上除外源性激素替代治疗外 , 尚无更好的治疗方法。 使用性激素纠正临床症状虽 有明显

疗效 , 但天然雌激素制剂少 , 外源性激素在体 内非生理性释放对机体有诸多副作用。 为了探索新 的治疗途径 , 我们进行了冻存胚胎卵巢及新鲜胚胎卵 巢异体 (成年鼠 异位移植的研究 , 比较了两者的移植 效果 , 以期为临床上治疗内源性雌激素缺乏提供一种 简单可行 , 供体丰富 , 效果明显的新方法。

1 材料和方法

1. 1 动物及分组 未交配过的成年雌性 S prague 2Dauley (S D 大鼠 , 由大连医科大学动物室提供 ,18~20周龄 , 体重 200g , 经阴道脱落细胞涂片证实有正常动情周期者作为受体 , 随机 分成 4组 , 每组 10只 。 移植物为孕 18~20天的大鼠胚胎卵

巢 ,A 组为正常对照组 , 仅行背部皮肤 、 筋膜 、 肌层切开缝合 。 B 组为去势对照组 , 仅切除双侧卵巢 , 不移植胚胎卵巢 。 C 组为新鲜胚胎卵巢移植组 , 切除双侧卵巢后 , 立即皮下移植 新鲜胚胎卵巢 。 D 组为冷冻胚胎卵巢移植组 , 切除双侧卵巢

后 , 将冷冻保存 1周的胚胎卵巢解冻后皮下移植 。

1. 2 手术方法 术前用 10%水合氯醛按 0. 3ml/kg 体重注 入腹腔内进行麻醉 。手术部位备皮消毒后 , 进行以下手术 。 (1 取胚胎卵巢术 :逐层切开腹壁 , 取出子宫置于生理盐水 中 , 取出胚胎于解剖镜下摘取卵巢 , 置于生理盐水中备用 ; (2 胚胎卵巢的冷 2解冻 :将需冻存后移植的胚胎卵巢置于装 有 1. 5ml 的 1. 4m ol/L 二甲基亚砜 (DMS O 的冷冻管中 , 置于 -20℃ 冰箱中 20min , 再置于液氮气相中 24h , 然后置于液氮 液相中保存 1周 。 移植前用 40℃ 水浴快速复温 , 反复用温生 理盐水冲洗去除冷冻保护剂 , 再放入 37℃ 孵育箱中孵育 30min ; (3 去势手术 :经腰背部切口逐层进入腹腔 , 寻找肾上 缘大量脂肪堆 , 可见卵巢包裹其中 , 切除双侧卵巢 ; (4

移植 手术 :将 C 组动物去势后立即植入胚胎卵巢于背部皮下 , 缝 514

现代妇产科进展 2002年 11月第 11卷第 6期 Prog Obstet G ynecol ,N ov.

2002,V ol. 11,N o. 6

线作标志 。 D 组胚胎卵巢解冻后 , 同法移植 。

1. 3 观察指标

1. 3. 1 动物的一般状态 观察大鼠手术后的活动 、 饮食 、 毛 皮的变化及切口愈合情况 。常规饲养至术后 3个月在动情 期处死 。

1. 3. 2 移植物组织学检查 动物处死后 , 取出移植物观察大 小、 形态及血供。 然后组织切片 , 光镜下观察卵泡发育情况。 1. 3. 3 移植物内分泌功能监测

1. 3. 3. 1 阴道细胞学检查 从移植第 3天开始 , 每日行阴 道涂片 , 观察脱落细胞变化 , 根据脱落细胞类型进行分析 。 未出现性周期变化者 , 显微镜下计数每高倍视野角化细胞比 例 , >50%者视为有雌激素作用 。

1. 3. 3. 2 子宫重量及其组织学观察 动物处死后 , 取出整 个子宫 , 修剪周围组织 , 称湿重 , 固定标本 , 子宫角部组织切 片 , 观察子宫内膜变化 。

1. 3. 3. 3 放免法测定血清 E 2水平 在动情期取大鼠血清 , 用 天津九鼎生物制品有限公司提供药盒的测定血清 E 2水平 。

2 结 果

2. 1 一般情况 实验动物均于术后 2h 恢复活动 , 无 1例死亡 , 活动 、 摄食正常 , 手术切口无感染 。 2. 2 阴道涂片 A 组呈正常动情周期变化 ;B 组阴 道上皮呈持续性无角化状态 ;C 组和 D 组在移植后 1个月阴道涂片开始出现改变 (大鼠从出生到性成 熟需 60~75d , 两组未呈现典型动情周期的细胞类 型 , 但有角化细胞周期性出现 。 C 组中 9只大鼠角 化细胞超过 50%,1只出现持续无角化状态 , 认为无 雌激素 作 用 。 D 组 中 8只 大 鼠 角 化 细 胞 数 量 > 50%,2只出现持续无角化状态 。

2. 3 子宫重量及其组织学观察 A 组子宫肌层较 厚 , 内膜层呈现不同程度增生期变化 。 B 组子宫萎 缩 , 子宫内膜层薄 , 腺体少且短 。 C 组和 D 组子宫明

显增 粗 , 明 显 重 于 去 势 组 , 差 异 有 显 著 性 (P < 0. 05 , 而 C 组和 D 组差异无显著性 ,C 、 D 组分别与 A 组比较 , 差异亦无显著性 。见表 1。光镜下见子 宫内膜呈不同程度增生 , 腺体明显增多 、 增长 , 见图

1、 2。

2. 4 血清 E 2水平 移植后 3个月 ,C 组和 D 组血 清 E 2水 平 高 于 同 期 B

组 , 差 异 有 显 著 性 (P <

0. 05 , 但 C 组 、 D 组和 A 组之间的两两比较 , 差异均 无显著性 (P >0. 05 , 见表 1。

表 1 各组子宫重量和血清 E 2水平 ( x ±s

组别 n 子宫重量

(g /100g 体重

血清 E 2 (c /pm ol ・ L -1

A 组 100. 373±0. 02845. 321±18. 999

B 组 100. 151±0. 03319. 245±4. 543

C 组 100. 333±0. 061346. 403±15. 8863 33

3P <0. 05 2. 5 胚胎卵巢的观察 大鼠的妊娠期为 20~24d , 平均 22d 。孕 18~20d 的胚胎卵巢呈半月状 , 乳白 色 , 长径不足 1mm 。 镜下见卵巢外包被 1~2层上皮 细胞 , 外层为皮质 , 占主要部分 , 含有大量处于分裂 状态的卵原细胞 , 其周围可见梭形细胞将卵原细胞 成群分隔 , 未见典型的原始卵泡形成 , 见图 3。 2. 6

移植物的观察 胚胎卵巢移植后 3个月 ,85%移植物的体积明显增大 , 与正常成年大鼠卵巢 (5mm ×4mm ×3mm 接近 。多数生长成圆球状或椭圆形 , 亦有呈串珠状生长 , 表面呈粉红色 , 凹凸不平 , 周围 血管网丰富 。 镜下见移植卵巢被结缔组织包围 , 卵 巢内血管丰富 , 可见大量不同发育阶段的卵泡 、 黄体 和间质腺及退化闭锁的卵泡 , 未见明显淋巴细胞浸 润 , 见图 4、 5。 (本文彩图 1~5见插页

3 讨 论