益气活血方体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化张运克1,车志英2(1.河南中医学院第一附属医院,河南郑州450000;2.河南中医学院,河南郑州450008)摘 要:目的:探讨益气活血方体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的作用。方法:采用密度梯度离心法分离获取SD大鼠骨髓单个核细胞层,将细胞经过传代培养使细胞得到扩增和纯化,用流式细胞仪鉴别。用益气活血方联合二甲亚砜(DMSO)、丁羟茴醚(BHA)和β-巯基乙醇(BME)等对碱性成纤维生长因子(bFGF)预诱导的MSCs诱导向神经细胞定向分化。用免疫细胞化学方法检测诱导1h、3h后巢蛋白(nestin)的表达,诱导5h后神经元特异性烯醇化酶(NSE)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,鉴定分化细胞的类型,并计数MSCs分化的各种细胞的阳性率。结果:益气活血方体外诱导MSCs1h、3h后分化为nestin免疫细胞阳性率为45.5%±3.4%和38.3%±1.8%,诱导5h后NSE和GFAP免疫细胞阳性率为82.3%±2.4%、12.1%±1.6%,与对照组相比有极显著性差异(P<0.01)。结论:成年大鼠骨髓MSCs可以在体外培养扩增,益气活血方有体外定向诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的作用。关键词:大鼠;骨髓间充质干细胞;巢蛋白;神经元特异性烯醇化酶;胶质纤维酸性蛋白;益气活血方中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1002-2392(2008)01-0022-04
基金项目:本课题得到河南省自然基金(0611040400)、河南省高校杰出科研人才创新工程项目(2007KYCX007)的资助。收稿日期:2007-09-28 修回日期:2007-12-15作者简介:张运克(1966-),男,副主任医师,副教授,医学博士,中国中医科学院博士后,硕士研究生导师,从事中医药防治神经系统疾病的临床与实验研究。 骨髓间充质干细胞((MesenchymalStemCellS,MSCs)属多能干细胞,具有高度自我更新能力和多向分化潜能,体内移植后不良反应较弱,是细胞替代治疗的理想种子细胞,MSCs能够穿越血脑屏障,促进大小胶质细胞的形成[1],其向神经细胞分化潜能为神经系统损伤后的修复提供了一个新的干细胞来源。中药及提取物如黄芪、龟板、丹参等可以诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞等诱导分化,但关于中药复方诱导分化的报道较少。笔者既往的研究证明了益气活血方补阳还五汤具有抑制脑缺血及再灌注模型细胞凋亡、抗自由基等作用[2,3],但关于本方对干细胞分化的影响,尚无相关的报道。本实验研究旨在探讨益气活血方补阳还五汤对骨髓间充质干细胞向神经细胞进行体外诱导分化,为中药复方联合干细胞移植治疗神经系统疾病的临床应用奠定实验基础。1 材料1.1 实验动物 清洁级SD大鼠,1～2个月龄,雌雄各半,体重100g～150g,共20只,购自河南省实验动物中心。1.2 药物与试剂 DMEM培养基,GibcoBRL公司提供;胎牛血清,Hyclone公司提供;淋巴细胞分离液,上海恒信公司提供;胰蛋白酶,华美公司提供;Rabit-Anti-Ratnestin,北京中山公司提供;Rabit-Anti-RatNSE,北京中山公司提供;Rattus-anti-RatGFAP,Neo2Marker公司提供;Histostain-SP试剂盒,北京中山公司提供;BHA、DMSO、BME,Sigma公司提供。实验药物由本院制剂室生产,选用当归60g、桃仁30g,川芎30g加水720ml,提取挥发油,备用。药渣及提取液加入黄芪1200g、赤芍60g、地龙30g、红花30g,再加入920ml水,煎煮1h,滤过,药渣再加入8640ml水,煎煮1h,滤过,合并两次煎液,浓缩至600ml,加入挥发油及吐温-803ml,混匀,装瓶进行高压高温消毒。每毫升相当于生药2.4g。1.3 主要实验设备和仪器 净化工作台,苏州净化集团安泰公司生产;MCO175CO2培养箱,日本SANYO生产;OLYMPUSIX-71倒置显微镜,日本OLYMPUS生产;荧光显微镜,日本OLYMPUS生产;双重纯水蒸馏器,上海亚荣生化仪器厂生产。 方法 获取骨髓 %水合氯醛(3Π)腹腔注射22中 医 药 学 报ActaChineseMedicineandPharmacology 2008年第36卷第1期Vol136,No11,2008
神经干细胞的培养鉴定及分化
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神经干细胞的培养鉴定及分化
朱 琼1，皋月娟2，高顺记1，陈 重1，刘 政1，徐亚丽1(1解放军第三军医大学第二附属医院超声科，重庆市 400037；2解放军第三○二医院超声科，北京市 100039)
引用本文：朱琼，皋月娟，高顺记，陈重，刘政，徐亚丽. 神经干细胞的培养鉴定及分化[J].中国组织工程研究，2017，21(17):2708-2713.
DOI: ORCID: 0000-0002-1810-5009(朱琼)
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文题释义：
神经干细胞：是具有自我更新和多向分化潜能的原始细胞，主要存在于侧脑室下区和海马齿状回颗粒下层，不仅能分化为多种类型的神经细胞替代缺失神经组织，同时能产生多种细胞因子，如脑源性神经营养因子、神经生长因子及胶质源性神经营养因子等，并促进突触发生，调节其可塑性，且能重建部分环路和功能，是神经元替代治疗的理想靶细胞。
细胞分化：指同一来源的细胞逐渐由全能到多能，最后到单能，从而产生形态功能不同的细胞群的过程，其本质是基因组在时间和空间上的选择性表达。如神经干细胞能分化为多种类型神经细胞：星形胶质细胞、小胶质细胞及神经元。同时该过程受局部微环境调节，多种理化因素都能诱导全能细胞产生分化，如血清诱导神经干细胞分化。
摘要
背景：神经干细胞在神经损伤修复和退行性疾病中有广泛的应用前景，体外培养鉴定及促神经元诱导分化是后续研究的基础。
目的：采用悬浮神经球培养法分离培养神经干细胞并对其鉴定，了解生物学特性。
方法：采用悬浮神经球培养法从C57BL/6胎鼠大脑半球分离培养神经干细胞，观察形态特征及超微结构，CCK-8法绘制生长曲线，流式细胞仪检测细胞周期，免疫荧光法检测特异性标志蛋白Nestin的表达；用体积分数为1%和10%的血清诱导分化后，免疫荧光法检测GFAP、βⅢ-tubulin和MBP的表达。
Y27632对体外培养的大鼠神经干细胞增殖和分化的影响的开题报告
一、研究背景
神经干细胞是一类具有自我更新和多能分化潜能的细胞。在生物医学领域，神经干细胞的应用前景非常广泛，例如可用于治疗神经系统退行性疾病和中枢神经系统损伤等领域。因此，提高神经干细胞的增殖和分化效率是研究的重点之一。而Y27632是一种针对Rho激酶的抑制剂，具有诱导形态学改变、增强细胞粘附和改变细胞骨架等作用，因此被广泛应用于细胞培养中。本研究旨在探究Y27632对于大鼠神经干细胞体外培养的影响。
二、研究内容
1.探究Y27632对大鼠神经干细胞增殖的影响。
选取一定浓度的Y27632加入到大鼠神经干细胞培养基中，采用MTT法检测细胞增殖情况，观察加入Y27632后神经干细胞增殖程度的变化。
2.探究Y27632对大鼠神经干细胞分化的影响。
将大鼠神经干细胞培养在不同剂量的Y27632培养基中，观察神经干细胞的分化情况，并运用Immunofluorescence染色和实时荧光定量PCR等技术方法对各细胞类型进行鉴定。
三、研究意义
探究Y27632对大鼠神经干细胞增殖和分化的影响，能为神经干细胞的体外培养提供新的方法和途径，进一步推进干细胞研究领域的发展。同时，该研究还能为神经系统疾病和损伤的治疗提供有力的基础研究支持。
第２７卷第２期 ２０ １ ０年４月 医学研究与教育 Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｖｏ１．２７ Ｎｏ．２ Ａｐｒ．２０１０ 大鼠海马神经干细胞的分离培养与免疫荧光鉴定 ・基础医学・
陈凯 －一。康现江 ，张平 ，穆淑梅。，郭明申 （１．河北大学生命科学学院，河北保定０７１００２；２．河北工程大学农学院，河北邯郸０５６００１；３．河北大学附属医院神经内 科，河北保定０７１０００） 摘要：目的 分离培养新生ＳＤ大鼠神经干细胞，并对其生物学特性进行鉴定。方法 采用无血清培养联合应用碱性成纤 维细胞生长因子和表皮生长因子对大鼠海马神经干细胞分离培养，采用免疫荧光的方法检测神经干细胞的ｎｅｓｔｉｎ抗原。结 果从新生大鼠海马齿状回分离的细胞群可不断增殖形成细胞克隆球，并且呈ｎｅｓｔｉｎ阳性表达，具有多向分化能力。结论 分离培养的细胞是中枢神经系统的干细胞。 关键词：神经于细胞；分离培养；免疫荧光鉴定 中图分类号：Ｑ３４３ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７４—４９０Ｘ（２０１０）一０２—０００１—０４ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｒａｔｓ Ｃｈｅｎ Ｋａｉ。一，Ｋａｎｇ Ｘｉａｎｊｉａｎｇ ，Ｚｈａｎｇ Ｐｉｎｇ３，ｅｔ ａ１． （１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌ －ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｅｂｅｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂａｏｄｉｎｇ Ｈｅｂｅｉ ０７１００２；２．Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｑ厂Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｈｅｂｅｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏ｛Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｈａｎｄａｎ Ｈｅｂｅｉ ０５６００１ ３．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，Ａｆｆｉｌｉ￣ｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ０ｊ Ｈｅｂｅｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｏｏｄｉｎｇ Ｈｅｂｅｉ ０７１０００，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：０ｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｓｏｌａｔｅ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ＳＤ ｎｅｗｂｏｒｎ ｒａｔｓ，ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｉｔｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ａｄｏｐｔｅｄ ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｔｏ ｉｓｏｌａｔｅ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｈｅ ｒａｔ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ｕｓｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｎｅｓｔｉｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｈｉｐｐｏｅａｍｐａｌ ｄｅｎｔａｔｅ ｇｙｒｕｓ ｃｏｕｌｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｌｙ，ａｎｄ ｆｏｒｍ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｃｌｏｎｅｓ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉ－ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｓｈｏｗ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎｅｓｔｉｎ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｏｓｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｔｈｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ；ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｅｅ 神经干细胞（Ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ＮＳＣｓ）由胚胎 早期的神经上皮产生，同其他组织中的干细胞一样 具有自我复制和多向分化潜能的特性，研究发现哺 乳动物无论在胚胎发育期还是在成年，其中枢神经 系统内都存在具有自我增殖和多向分化潜能的 ＮＳＣｓ１１－３１，ＮＳＣｓ的分离、培养为神经发育研究和中 枢神经系统疾病的治疗提供了一条新的思路。本实 收稿日期：２０１０—０１—１５ 基金项目：河北省科技厅基金项目（０８２０６１２０Ｄ） 作者简介：陈凯（１９７７一），男，河北邯郸人，讲师，硕士。 通信作者：康现江（１９６４一），男，河北邯郸人，教授，博士，研 究生导师。 验从出生２４ｈ的ＳＤ大鼠海马分离出ＮＳＣｓ，并进 行体外培养、传代及表面标志物的鉴定，建立了 ＮＳＣｓ的培养及鉴定方法，为深入研究ＮＳＣｓ的生物 学特性及临床应用打下了基础。 １材料与方法 １．１试剂ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养基、Ｂ２７（Ｇｉｂｃｏ），碱性 成纤维细胞生长因子（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ， ｂＦＧＦ，ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ），表皮生长因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ＥＧＦ，ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ），胎牛血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ，Ｈｙｃｌｏｎｅ），谷氨酰胺（Ｂｉｏｓｈａｒｐ）， 青霉素和链霉素（华北制药厂），胰蛋白酶、多聚赖 一
